Summary
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת כימות של תאים סרטניים דבק לצומת לימפה (LN) קריודורים. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת-פלואורסצנטית, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה של תא הגידול מחייב לתוך הכריכה.
Abstract
גידול בלוטות לימפה ניקוז (LNs) הם לא רק מסננים של פסולת המיוצר הגידול. הם אחד האתרים האזוריים הנפוצים ביותר של מגורים זמניים של תאים סרטניים המופץ בחולים עם סוגים שונים של סרטן. הזיהוי של תאים אלה המתגוררים בתוך הגידול הוא בסמנים חשובים הקשורים פרוגנוזה גרועה החלטות הטיפול הפסיקה. מודלים העכבר האחרונות הצביעו על תאים סרטניים בתוך המתגוררים יכול להיות מקור משמעותי של תאים ממאירים עבור גרורות מרוחקות. היכולת לכמת את הadהיסוס של תאי הגידול לתוך מכימומה הוא מד קריטי במחקר ניסיוני המתמקד בזיהוי של גנים או איתות מסלולים הרלוונטיים הפצת הלימפה/גרורתית. מכיוון LNs הם מבנים תלת-ממדיים מורכבים עם מגוון רחב של הופעות ויצירות בסעיפים רקמות בהתאם למישור של סעיף, מטריצות שלהם קשה לשכפל ניסויים בתוך מבחנה באופן מלא בשליטה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת את הקוונפיקציה של תאים סרטניים דבק כדי בהקפאה חלקים. שימוש במקטעים סידוריים של אותו LN, אנו להתאים את השיטה הקלאסית שפותחה על ידי Brodt להשתמש בתוויות לא רדיואקטיביות ולספור ישירות את מספר תאים הגידול הקפדה על פני השטח בשטח. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת על-ידי זריחה, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה לתא-מחייב ב-LN, אשר היא עדות מרמזת של שינויים מולקולריים באיגוד האהדה של אינטגרציה להתאים שלהם ב-ligands ליגנדס.
Introduction
גרורות סרטן היא הסיבה העיקרית לכישלון הטיפול ואת ההיבט הדומיננטי סכנת חיים של סרטן. כפי היסוד 130 לפני שנים, התפשטות גרורתית תוצאות כאשר האליטה של תאי הגידול הפיצו (DTCs, "זרעים") לרכוש יכולות ביולוגיות ספציפיות המאפשרות להם להתחמק אתרים עיקריים ולהקים צמיחה ממאיר באתרים מרוחקים ("האדמה")1. לאחרונה, מספר מושגים חדשניים לגבי היחסים "זרעים וקרקע" הופיעו, כגון אינדוקציה של נישות גרורתית (המשגיחה כ "אדמה פורייה" הדרושה "זרעים" כדי לשגשג), הזריעה עצמית של גידולים ראשוניים על ידי dtcs, "זרע" תרדמה באיברים משניים ומודל מתקדמות מקבילי של גרורות2.
עבור ממאירות מוצק ביותר, DTCs יכול לשכון ולהתגלות באיברים רבים mesenchymal, כגון מח עצם ובלוטות הלימפה (LNs) בחולים עם או בלי ראיות של גרורות קליני. מכיוון LNs ניקוז הגידול הם המיקום הראשון של התפשטות האזור של DTCs, במצב LN הוא אינדיקטור תחזיות חשוב והוא משויך לעיתים קרובות עם החלטות טיפול בפסיקה3. עבור חלק מסוגי הגידולים, הקורלציה בין במעמד ותוצאות גרועות יותר היא חזקה, כולל ראש וצוואר4,5, שד6, הערמונית7, ריאה8, קיבה9, המעי הגס10,11 בלוטת התריס סרטן12.
Lns הם איברים קטנים דמוי של מערכת הלימפה, כי הם מכוסים בתאים רשתית מוקף עם כלי הלימפה. איברים אלה נחוצים בהחלט לתפקוד מערכת החיסון13. LNs לפעול כפלטפורמות מושכים עבור תאים מחזורי החיסונית, להביא את לימפוציטים ו אנטיגן הצגת תאים יחד14. עם זאת, LNs גם למשוך תאים סרטניים במחזור. לאורך עשורים, LNs היו בתמונה כמסלולים פסיבי של הובלה תאים סרטניים גרורתי. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תאים סרטניים עשוי גם להיות מונחה לכיוון LNs על ידי כימוטקטיק (נוגדנים) ו/או האפוטוטקטיק (אלמנטים מטריקס מושג) רמזים מופרש על ידי אנדותל הלימפה15. כדוגמאות, ביטוי יתר של קולטן CCR7 בתאי הגידול מקלה על ההדרכה של תאים מלנומה גרורתית לקראת הגידול-LNs מרוקן16. בנוסף, מסחטות חלבונים ב-LN לספק פיגום דבק עבור גיוס והישרדות של תאים סרטניים במחזור17. למעשה, מרוקן הגידול LNs לספק קרקע פורייה לזריעה של DTCs, אשר ניתן לשמור במדינות מתרבים או רדום על ידי מסוים בתוך אותות סביבתיים מיקרו18. גורלם הסופי של פקדי הזמן המתגוררים בעיר הוא שנוי במחלוקת; כמה עבודות מציעות כי תאים אלה הם אינדיקטורים פסיבי של התקדמות גרורתית19, בעוד אחרים מציעים כי הם בסבירות גבוהה יותר מייסדי ההתנגדות (על-ידי לזריעה עצמית אתרים ראשיים) ו/או לפעול כמאגרים סלולריים עבור גרורות (הפצת "זרעים" לצמיחת סרטן שלישוני)20,21. לאחרונה, שימוש במודלים פרה-קליניים, זה הוכיח כי חלק של אלה בתוך המתגוררים DTCs באופן פעיל הפולשים כלי הדם, נכנס למחזור הדם והכובש את הריאות21.
בהתחשב בכך נוכחות של תאים סרטניים ב LNs הוא סמן עבור תוקפנות סרטן והחלטיות, במחקר זה, אנו אופטימיזציה שיטה קלאסית שפותחה על ידי Brodt22 כדי כימות הגידול למדוד בלתי מותאם למדידת הגידולים לתאי מבחנה. השימוש בכדאיות מבוססת-פלואורסצנטית איפשר לנו לפתח פרוטוקול בעלות נמוכה, מהירה, רגישה וידידותית לסביבה (לא רדיואקטיבית) לאיתור שינויים דביקים בין תאי גידול לבין מקטעי בהקפאה. באמצעות התאים של סרטן השד MCF-7 המבטא רמות שונות של ביטוי גנים NDRG4 ועכברוש בסעיפים קפואים להדגים את השיטה, הראנו כי פרוטוקול זה איפשר מתאם טוב בין הדבקה תא הגידול כדי LNs בתוך מבחנה בתוך גרורות שנצפו בחולי סרטן השד24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LNs התגלו מגוויות טרי של מבוגר בריא חולדות Wistar הוקרב על ידי פריקה צוואר הרחם. עקבנו אחר הנחיות NIH לכאב ומצוקה בחיות מעבדה וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה ומחקר בעלי חיים של מכון המחקר והחינוך של בית החולים Sírio-Libanês (CEUA P 2016-04).
הערה: כל הרקמות הקפואות הטריות נחשבות לחומרים ביולוגיים ויש לטפל בהן באמצעות אמצעי זהירות מתאימים לבטיחות ביולוגית.
1. Lymphadenectomy וקריוסיסיב
- מניחים גוויות טריים של חולדות Wistar למבוגרים (180-220 g) שוכב בתוך שכיבה על לוח חיתוך נקי בטמפרטורת החדר.
הערה: LNs יש לאסוף עד 30 דקות לאחר המתת חסד. - רסס את גופת החולדה עם אלכוהול איזופרופילי 70% והשתמש בכלים מעוקרים לקציר.
- הרם את עור הבטן בעזרת מלקחיים ופתח חלל עם חתך אמצעי מבלי לפגוע ברקמה הבסיסית, תוך חשיפת מעיים הבטן. משוך החוצה את המעי, LNs החזה ואת הבטן להיות גלוי (איור 1).
- השתמש במספריים של מספריים בעלי עצות בוטה כדי להימנע מפגיעה בעורק הראשי העליון השוכב מאחור.
הערה: בהתאם למיקום של הצומת לימפה מחדש, יש צורך לנקות רקמות אחרות דבקה אותו, כגון רקמה מצע. - הקציר LNs לתוך 15 מ ל צינורות חרוטי המכיל 5 מ ל של מלוחים סטרילי מאגור פוספט (PBS).
- להשליך כראוי את גוויות החולדה.
- להסיר LNs טרי מ-PBS, רול ולייבש את הצומת על נייר סינון יבש. מניחים אותו בצלחת פטרי קטנה ולהוסיף פתרון הטבעה של דגימות רקמות קפואות (O.C.T.) עבור 2 דקות.
- להעביר ולהתמצא הפנים למטה במיקום הרצוי בבסיס של הקריוזקן, עם מספיק בדיוק O. C כדי לכסות את זה. להימנע בועות ליד הרקמה. משטח הקרקע הוא. החלק התחתון של הקריומיושן
- באופן מיידי להקפיא את הקריומד במקרר קלקר עם קרח יבש. כאשר יש עדיין חלק קטן של O.C.T. הקפואה (~ 20-35 s), להעביר את המדגם לרדיד אלומיניום ולמקם אותו קריר עם קרח יבש תוך המשך להקפיא דגימות אחרות. בסוף, לאחסן את כל הדגימות ב-80 ° c עד הפחתת.
- מקטע את LN עם עובי התאמת מקטע התאמה ל 5-8 μm. העברת הקפאה של שקופיות על מיקרוסקופ.
הערה: לפני שאתה מוותר, הסר את הדגימות הקפואות ממקפיא-80 ° c ואפשר להם לתקן את הטמפרטורה בחדר המיקרו-מיקרו-סטטיסטיקה ב-22 ° c עבור כ -30 דקות. ניתן לאחסן את השקופיות המכילות ב-80 ° c עד חודש אחד.
2. תיוג סלולארי עם צבעי פלורסנט
הערה: צבעי פלורסנט נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה של תאים. אנחנו מעדיפים להשתמש התיוג הארוך שרשרת התוויות (dii (C18), עירור 549 nm, פליטה 565 nm) כי הם בהירים, יציב ניתן להוסיף ישירות לתקשורת התרבות, אינו משפיע על הכדאיות התא או המאפיינים דבק תא25,26.
- תאים המונתק גדלים תחת תנאים אידיאליים (כלומר, במדיום מלא) ולהשעות מחדש בינונית ללא סרום בצפיפות של 106 תאים/mL.
- הוסף 1 מ ל של השעיית תא (106 תאים) לצינור a15 mL ו תווית עם דיל (C18) (2 μg/mL) עבור 10 דקות ב 37 ° c.
הערה: לאחר 5 דקות, בעדינות מתפרעים את הצינורות כדי למנוע משקעי תאים וכתמים של תאי ממדים. צפיפויות גדולות יותר דורשות זמני דגירה ארוכים יותר עבור כתמים אחידים. זמן דגירה אופטימלי עבור הצביעת התא משתנה עם קו התאים. זה יכול להיות יותר כימות באמצעות FL2 המקובלת זרימה cy, לנסות ערוץ זיהוי (איור 2א). - צנטריפוגה את שפופרות ההשעיה בתווית ב 300 x g עבור 4 דקות.
- הסר את הסופרנטנט ושטוף פעמיים ב -10 מ ל של מדיום ללא סרום. לשחזר את התאים כדורי אדום. השהה מחדש את התאים בגודל של 106 תאים/mL ב-סרום ללא מדיום עם 0.1% בסרום (bsa).
3. מנות מקדימות עם פתרון פולי-L-ליזין או BSA כבקרת זריעה (אופציונלי)
הערה: השתמשנו מנות תרבות התא מצופה מראש עם PLL כמו משטחי טעינה חיוביים שליטה כדי להבטיח כי קבוצות נסיוניות שונות של תאים סרטניים הופרה באותו מספר, כמו גם משטחים מצופי BSA כפקדים שליליים.
- בתנאים סטריליים, כדי להכין את PLL-or BSA-מצופה בארות, להוסיף 300 μL של PLL (0.1% w/v ב H2o) או bsa (מדולל ב 2.5% w/v ב h2o) ישירות לצלחת 24-הבאר ו מודלת לילה ב 4 ° c.
- להסיר את הפתרון על ידי השאיפה, לשטוף בעדינות את פני השטח עם PBS סטרילי ומייבשים את הצלחת בטמפרטורת החדר במכסה העור-רקמה לפני זריעת התאים.
הערה: הכרכים הסופיים של PLL או BSA חייבים להיות מותאמים בהתאם לאזור של צלחות היטב שונות.
4. זריעת פלורסנט-התווית תאים סרטניים על בתוך בהקפאה או PLL/BSA-מצופה בארות
הערה: כפקדים ניסיוניים, השתמשנו (1) מנות תרבות התא מצופות מראש עם PLL או BSA ו-(2) מקטעים רצופים של אותו b לניסוי (ראה פירוט זה באיור 2D), שבו האחרון יהיה למזער וריאציות אזוריות בהרכב מטריצה (ecm) של כל מקטע LN, אשר בתורו יכול להכתיב את קצב עבור שיטת הדבקה של תא הגידול הבא, בחר באיכות גבוהה ורציפים מקטעי בהקפאה.
- שוטפים בעדינות את הקריודורים פעמיים עם PBS ומייבשים עם PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- חסימת הדבקה לא ספציפית לקריודורים עם 2.5% BSA עבור 30 דקות ב-37 ° c. השתמש בתאי השטיפה האימונוהיסטוכימיה ובעריסות לאמינה כדי להבטיח כי כל ה-O. C. T הוסר במהלך השטיפה והincubations.
- מסננים את ה-BSA העודפים על מגבת נייר יבשה, מייבשים את המתאר של מקטעי LN בעזרת מטלית כותנה וממקיפים את המקטעים באמצעות עט פאפ.
- עבור שיטת הדבקה של תא הגידול, להוסיף 100 μL של השעיית תא (משלב 2.4) לכל מקטע LN מוקף או גם בצלחות 24-היטב PLL-מצופה ולמקם אותו בארון מחולל לחות עבור 1-2 h ב 37 ° c בחממה המקובלת בתרבות התא.
הערה: הנפח הסופי של השעיית תאים צריך להיות מותאם על פי השטח של LNs שונים מוקפים. - שטוף בעדינות את התאים הלא מחסיד ארבע פעמים עם PBS. תקן את התאים הפלורסנט הנותרים חסיד עם 3.7% פורמלדהיד ב-PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
5. קוונפיקציה ידנית של המדד הדביק
הערה: המדד הדביק (כלומר, תאים סרטניים/in mm2) הושג באמצעות מטרה 10x ובאופן ידני לספור את מספר התאים הסרטניים, מזוהה בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2ד), באזורים הלימפה לימפה של מספר שדות עצמאיים (השיג באמצעות
- השתמש במיקרוסקופ פלורסנט עם מטרה 10x לקחת תמונות TIFF נפרדות בשני ערוצים המתאימים לשדות הבהירים והמוארים בצבע אדום (איור 2ד). שם ושמור תמונות אלה באופן שיטתי.
- הפעל את ImageJ/פיג'י, פתח את התמונות וקבע את קנה המידה. יש להשתמש בסולם כיול (לדוגמה, שליט מיקרומטר 1 מ"מ) (איור 2ג).
- פתח את התמונה של סרגל המיקרומטר (או מיקרומטר שלב), בחר את כלי הקו הישר וצייר קו ישר המגדיר מרחק ידוע.
- בתפריט ' ניתוח ', בחר ' קבע קנה מידה'. המרחק בפיקסלים יתמלא בהתאם לאורך (בפיקסלים) של הקו שצויר בשלב 5.3. המרחק הידוע יתמלא במרחק האמיתי (במקרה זה, במילימטרים) וביחידת האורך בשדה ' יחידת אורך ' (במקרה זה, במילימטרים).
- לחץ על הלחצן הכללי (כיול זה חל על כל התמונות שנפתחו בהפעלת imagej/פיג'י) ולחץ על אישור.
- הלימפה האזור הצומת כימות: בחר את הכלי שרביט ועל ידי לחיצה כפולה, לפתוח את הגדרות הכלי מטה . הגדר מצב כמחוברל-8. לחץ בתמונה והגדר את הסובלנות עד לבחירת כל בלוטות הלימפה בתמונה ולחץ על אישור. כדי למדוד את האזור, פתח את ' נתח ' | מדידה (CTRL + M). האזור מבוטא ביחידות שנקבעו קודם לכן.
- תא הגידול כימות: לפתוח את מיקרוסקופ אור/תמונות זריחה בתוכנת פיג'י. בחר תוספים | לנתח את | מונה תאים | . מונה תאים לחץ על התמונה כדי להיות כמותית ולחץ על לחצן אתחול בחלון מונה התא. בחר סוג מונה (1-8) ולחץ על התאים בתמונה. כדי לאתחל את התמונה הבאה, לחץ על לחצן איפוס בחלון המונה של התא, פתח את התמונה החדשה וחזור על כל השלבים.
הערה: המדד האדהזיה מבוטא כמספר תאי גידול מחסיד לכל אזור LN (תאים/mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו ממחישים את היכולת על ידי הערכת הפוטנציאל הדביק LN של פלורסנט אדום MCF-7 סרטן השד ביטוי רמות שונות של הגן NDRG4 (המכונה NDRG4-חיוביים ו NDRG4-שלילי תאים), מאפטור שלילי של beta1 אינטגרציה באשכולות במשטח התא24, על ידי בחינת שברים של בתאי הגידול החולדה in-חסיד. דוגמאות לתמונות הגלם של פרוטוקול זה מוצגות באיור 2. כפי שנצפה באיור 2ב, המבנה של התאים החסיד מעוגל בצורת, והם מפוזרים באופן מאוד ברחבי LN. מדד הדבק LN הוא 2-קיפול גבוה יותר ב-NDRG4-שלילי MCF-7 תאים (877 ± 124 תאים/mm2 של LN) בהשוואה לכך בתאים NDRG4-חיובי mcf-7 (412 ± 76 תאים/mm2 של LN, p = 0.03) (איור 2ד).
איור 1: הליך הסטפני לבידוד של LNs החולדה המסרית. (א) חיתוך העור באמצע קו ביניים: חולדות מורדמים הוצבו במצב שכיבה מורבית וחתך 30-50 מ"מ באמצע הדרך נעשה בעור על הבטן האמצעית, חשיפת מעיים הבטן (כבד, המעי הדק, מעי ושלפוחית השתן). (ב) המעי הדק הוציא בעדינות מחלל הבטן חשיפת lns החולדה מוטבע ברקמת שומן הקרביים. (ג) האנטומיה הגולמית של מערכת העיכול לאחר ההסרה. (ד) גזור בלוטות לימפה מתוך רקמת השומן המחבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות הנציג של הדבקה תא הגידול לתוך מקטעים הלימפה חולדה. (א) המחשה הזרימה cy, הניתוח המראה את עוצמת DiI (C18) תיוג (הרביע העליון) לעומת תאים לא מתויג (הרביעהתחתון). (ב) האור (השמאלי) והפלורסנט (מימין) תמונות מיקרוסקופית האדום שכותרתו מק-7 תאים המתויגים לסעיפים LN לאחר שלב הכביסה. (ג) לאחר בדיקת הדבקה, תאים מצורפים על שמיכות מאוונים באופן ידני על ידי שימוש בסולם כיול כדי להעריך את אזור הלימפה ואת המיקרוסקופיה פלורסנט לספירה ישירה של תאים. (ד) NDRG4 למטה ב-mcf-7 בתאי גידול בשד מגביר את הלימפה לימפה. תמונות מייצגות של פלורסנט אדום mcf-7 תאים (NDRG4-חיוביים או NDRG4-שליליים DiIC18 תאים) 30 דקות לאחר זריעה על 5 יקרומטר הלימפה מקטעים הצומת. המדד הדביק ב-LN מבוטא כמספר התאים הסרטניים חסיד לכל שטח מכוסה LN (תאים/mm2). סרגל קנה מידה = 200 μm. * p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת הלימפה הפצת תאים סרטניים דורש מגוון של אירועים מונחה תאים מורכבים. הם ליזום עם ניתוק התאים מהגידול העיקרי ואת שיפוץ של מטריצה החילוץ (ecm) האדריכלות, והם נתמכים על ידי כימוצ מתמשך הגירה פעילה דרך כלי לימפה lymphatics en בדרך הזקיף lns. אם תאים סרטניים לדבוק ולשרוד LNs, הם יכולים בקלות להתפשט לאיברים משניים אחרים. כאן נתאר שיטה קלה לניתוח פונקציונלי מהיר ובעלות נמוכה של אינטראקציות דביקות ספציפיות בין תאי גידול לבין LNs קפואים.
מבנית, LNs הם בדידים ספוג, כמו ההמונים של רשתות צפופה ונרחבת של סיבי ECM, המכונה לעתים קרובות "סיבי רשתית", אשר לשמש נתיבים עבור הגירה תא וכתעלות עבור משלוח מהיר של גורמים מסיסים (אנטיגנים ו/או נוגדנים) בתוך ה-LN הפנימי27. סיבי הרשתית השמורים של LNs קפוא של הספק תמיכה אותות האפוטקטיק ולספק מקפלים של תאים הגידול הדבקה בתוך מבחנה. סיבים אלה מורכב בעיקר של חלבונים מבניים, כגון collagens I ו III, ועל ידי אלמנטים ecm משני, כגון fibronectin, tenascin, למינציה, vitronectin ו הפארן סולפט פרוטאוגליקנים28,29. בעקבות הדבקה התא, רוב הגורמים הללו ecm הנגזר לספק רמזים מולקולריים הקובעים הישרדות התא (המתרבים או תרדמה מדינות) או תא מוות (anoikis) באמצעות שידורי אינטגרציה בתיווך.
כאן, אנו מדגימים את השיטה באמצעות LNs עכברוש מקסימית ו קו הגידול של הגוף האנושי. לחילופין, ניתן להשתמש במקורות אחרים של LNs. ההרכב של עכברוש, העכבר או האדם LNs כולל חלבונים מבניים ופונקציונלי זהה המהווים חלק של ECM יליד הילידים, כל שמירה על אתרי קשירה דומים הנחוצים תאים הדבקה23. חשוב מכך, הצעד הקריטי היחיד הוא להשתמש בפרוסות רצופות של אותו ' LN ' לכל ניסוי כדי למזער וריאציות אזוריות בקומפוזיציה של ECM של כל מקטע LN, שבתורו יכול להכתיב את קצב ההדבקה של התא.
חיסרון של האמת היא שזה לא מסכם את הצעדים הראשונים של הפצת הלימפה, רק המשקף את החוזק הדביק של תאים סרטניים כדי LNs. למשל, זריעת פחות אגרסיבי בתאי הגידול בשד בסעיפים LN, כמו MCF-7 (איור 2) או תא הגידול T47D קווים24, להוביל הדבקה חזקה בסעיפים LN ב מבחנה, ברמות דומות יותר מאשר נצפתה עבור התאים אגרסיבי-MB גבוה-231 הגידול (נתונים לא מוצגים). עם זאת, ידוע היטב כי אורתואינים mcf-7 גידולים מבע לא יכול להגיע הזקיף lns, בעוד מד א-MB-231 גידולים באופן ספונטני גרורות להם30. ברור, את צוואר הבקבוק הראשי עבור התאים MCF-7 בתוך גרורות היווצרות להתרחש בשלבים לפני שהם מגיעים לדבוק LNs, כמו חוסר היכולת של MCF-7 תאים ביעילות להימלט מן גידולים ראשוניים. כך, החוזק של השיטה המתוארת כאן הוא לא להקים קשרים ישירים עם פוטנציאל בתוך גרורתי, אבל היא שיטה פשוטה כדי לכמת את התכונות הדביקות של תא גידול ב ECM ריאליסטי יותר בתוך מבחנה. על ידי שימוש ברקמות קפואות, הקריודורים מייצגים את המורכבות הטבעית של LNs במונחים של מבנה וקומפוזיציה, אשר יהיה בלתי אפשרי לשחזר באמצעות טכניקות סינטתיים, במיוחד אלה באמצעות חלבונים ECM מטוהרים.
מגבלות נוספות של השיטה הם (1) זה לא מאפשר הערכה של הפוטנציאל כימוטקליזם של גורמים מופרש על ידי LNs וכי (2) זה לא ליידע אם התא ספציפי הדבקה לסעיפים LN היא תוצאה של מחייב מועדפים לחלבונים ECM, תאים או כל מבנים אחרים הנמצאים בסעיפים LN. עם זאת, חשנו כי גישה זו יכולה להיות רלוונטית וחייבת להיחשב ברצינות ליישומים מסוימים, אך היו מעבר להיקף של כתב היד המסוים הזה. לדוגמה, במחקר שנערך לאחרונה, זיהינו את N-Myc במורד הגן מוסדר 4 (NDGR4) כמו ביואריסטית מכונאי של גרורות בתוך גידולים בשד24. מכונאי, תאים סרטניים חסר NDRG4 ביטוי להגדיל את הדבקה לקריודורים של LNs על ידי העדפה הרכבה של β1-אינטגרציה קולטנים בקצה המוביל של תאים סרטניים בחזה. יתר על כן, באמצעות בקרות נוספות, כמו מנות מצופות עם חלבונים ECM מטוהרים, גילינו כי הדבקה הדיפרנציאלי לסעיפים LN היא תוצאה של שיוך סלקטיבי עם vitronectin24.
לבסוף, ראוי לציין כי שיטה זו אינה מוגבלת לסעיפים LNs והוא יכול להיות מוגדר כדי להעריך את הדבקה תא לאיברים חיים שונים, כמו קריוחלקי הטחול או הריאות. תאים גרורתית התצוגה אורגאוטרוזם ומדידות של חוזק דבק בחלקים קפואים של איברים שונים בפריפרייה, יכול להיות ממוצע שימושי לחיזוי הפצת סרטן ספציפי לאיברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לד ר רוסאנה דה לימה פאגאנו ואנה קרולינה Pinheiro קמפוס לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ: FAPESP-סאו פאולו מחקר קרן (2016/07463-4) ולודוויג המכון לחקר הסרטן (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
