Summary
यहां, हम एक सरल और सस्ती विधि का वर्णन करते हैं जो चिपकने वाले ट्यूमर कोशिकाओं के मात्राकोलिम्स को लिम्फ नोड (एलएन) क्रायोसेक्शन की अनुमति देता है। एलएन-अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जाता है और फ्लोरेसेंस-आधारित विधि द्वारा पुष्टि की जाती है, जिससे एक आसंजन सूचकांक होता है जो एलएन पैरान्चिमा को ट्यूमर सेल-बाध्यकारी आत्मीयता का पता चलता है।
Abstract
ट्यूमर-ड्रेन लिम्फ नोड्स (एलएनएस) केवल ट्यूमर-उत्पादित कचरे के फिल्टर नहीं हैं। वे कैंसर के विभिन्न प्रकार के रोगियों में प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं के अनंतिम निवास के सबसे आम क्षेत्रीय स्थलों में से एक हैं। इन एलएन में रहने वाले ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाना खराब पूर्वानुमान और न्यायनिर्णयन चिकित्सा निर्णयों से जुड़ा एक महत्वपूर्ण बायोमार्कर है। हाल ही में माउस मॉडल संकेत दिया है कि एलएन रहने वाले ट्यूमर कोशिकाओं दूर मेटाटैस के लिए घातक कोशिकाओं का एक बड़ा स्रोत हो सकता है । एलएन पैरान्चिमा के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की चिपकने की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता प्रायोगिक अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण गेज है जो लिम्फेटिक/मेटास्टैटिक प्रसार के लिए प्रासंगिक जीन या सिग्नलिंग रास्तों की पहचान पर केंद्रित है । क्योंकि एलएनएस अनुभाग के विमान के आधार पर ऊतक वर्गों में विभिन्न प्रकार के दिखावे और रचनाओं के साथ जटिल 3 डी संरचनाएं हैं, इसलिए उनके मैट्रिस को पूरी तरह से नियंत्रित तरीके से प्रयोगात्मक रूप से विट्रो में दोहराना मुश्किल होता है। यहां, हम एक सरल और सस्ती विधि का वर्णन करते हैं जो चिपकने वाले ट्यूमर कोशिकाओं के मात्राकरण को एलएन क्रायोसेक्शन की अनुमति देता है। एक ही एलएन के धारावाहिक वर्गों का उपयोग करते हुए, हम गैर रेडियोधर्मी लेबल का उपयोग करने के लिए ब्रॉडटी द्वारा विकसित क्लासिक विधि को अनुकूलित करते हैं और सीधे एलएन सतह क्षेत्र में ट्यूमर कोशिकाओं का पालन करने की संख्या को गिनते हैं। एलएन-अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जाता है और फ्लोरेसेंस-आधारित विधि द्वारा पुष्टि की जाती है, जिससे एक आसंजन सूचकांक दिया जाता है जो एलएन पैरान्चिमा को सेल-बाध्यकारी आत्मीयता का पता चलता है, जो उनके सहसंबंधित एलएन-लिगांड के लिए पूर्णांक के आत्मीयता बाध्यकारी में आणविक परिवर्तन का विचारोत्तेजक सबूत है।
Introduction
कैंसर मेटास्तासिस उपचार विफलता और कैंसर के प्रमुख जीवन के लिए खतरा पहलू के लिए मुख्य कारण है। 130 साल पहले के रूप में, मेटास्टैटिक फैल परिणाम जब प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं (DTCs, "बीज") के एक अभिजात वर्ग विशिष्ट जैविक क्षमताओं है कि उंहें प्राथमिक साइटों से बचने के लिए और दूर साइटों ("मिट्टी")1पर घातक विकास की स्थापना की अनुमति प्राप्त करते हैं । हाल ही में, "बीज और मिट्टी" संबंधों के बारे में कई उपन्यास अवधारणाएं उभरी हैं, जैसे प्रीमेटास्टैटिक निकस (बीजों के लिए आवश्यक "उपजाऊ मिट्टी" के रूप में संकल्पित), डीटीसी द्वारा प्राथमिक ट्यूमर की स्व-सीडिंग, माध्यमिक अंगों पर "बीज" निद्रा और मेटास्टैसिस2का समानांतर प्रगति मॉडल।
अधिकांश ठोस घातक ताओं के लिए, डीटीसी कई मेसेनचिमल अंगों में रह सकते हैं और उनका पता लगाया जा सकता है, जैसे कि नैदानिक मेटास्टैसिस के सबूत के साथ या बिना रोगियों में बोन मैरो और लिम्फ नोड्स (एलएनएस)। क्योंकि ट्यूमर-ड्रेनएलडीसी के क्षेत्रीय प्रसार का पहला स्थान है, एलएन स्थिति एक महत्वपूर्ण शकुन संकेतक है और अक्सर न्यायनिर्णयन चिकित्सा निर्णयों से जुड़ा होता है3। कुछ ट्यूमर प्रकारों के लिए, एलएन स्थिति और बदतर परिणामों के बीच संबंध मजबूत है, जिसमें सिर और गर्दन4,5,स्तन6,प्रोस्टेट7,फेफड़े 8,गैस्ट्रिक9,कोलोरेक्टल10,11 और थायराइड कैंसर12शामिल हैं।
एलएनएस लिम्फेटिक सिस्टम के छोटे ओवोइड अंग होते हैं, जो रेटिकुलर कोशिकाओं से ढके होते हैं और लिम्फेटिक जहाजों से घिरे होते हैं। ये अंग प्रतिरक्षा प्रणाली13के कार्यकरण के लिए नितांत आवश्यक हैं . एलएनएस प्रतिरक्षा परिसंचारी कोशिकाओं के लिए आकर्षित प्लेटफार्मों के रूप में कार्य करते हैं, लिम्फोसाइट्स और एंटीजन-पेश कोशिकाओं को एक साथ14लाते हैं। हालांकि, एलएनएस भी परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं को आकर्षित करते हैं । दशकों से, एलएनएस मेटास्टैटिक ट्यूमर कोशिकाओं के लिए परिवहन के निष्क्रिय मार्गों के रूप में चित्र थे । हालांकि, हाल के अध्ययनों से संकेत मिला है कि ट्यूमर कोशिकाओं को कीमोटैक्टिक (केमोकिन) और/या हैप्टोटैक्टिक (एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स तत्व) लिम्फेटिक एंडोथेलियम15द्वारा स्रावित संकेतों द्वारा एलएनएस की ओर भी निर्देशित किया जा सकता है । उदाहरण के रूप में, ट्यूमर कोशिकाओं में CCR7 रिसेप्टर की अतिअभिव्यक्ति ट्यूमर-ड्रेनएल16 कीओर मेटास्टैटिक मेलानोमा कोशिकाओं के मार्गदर्शन की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, एक्सट्रासेलुलर एलएन प्रोटीन ट्यूमर कोशिकाओं17परिसंचारी की भर्ती और अस्तित्व के लिए एक चिपकने वाला पाड़ प्रदान करते हैं । वास्तव में, ट्यूमर-ड्रेनिंग एलएनएस डीटीसी की सीडिंग के लिए उपजाऊ मिट्टी प्रदान करते हैं, जिसे विशिष्ट एलएन माइक्रोएनवायरमेंटल सिग्नल18द्वारा प्रसारात्मक या निष्क्रिय राज्यों में बनाए रखा जा सकता है। इन एलएन में रहने वाले डीटीसी का अंतिम भाग्य विवादास्पद है; कुछ काम ों का सुझाव है कि इन कोशिकाओं मेटास्टैटिक प्रगति19के निष्क्रिय संकेतक हैं, जबकि दूसरों का प्रस्ताव है कि वे प्रतिरोध के अधिक संभावना संस्थापक है (स्वयंबोने प्राथमिक साइटों द्वारा) और/ हाल ही में, प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग करके, यह प्रदर्शित किया गया है कि इन एलएन-रहने वाले डीटीसी के एक अंश ने सक्रिय रूप से रक्त वाहिकाओं पर हमला किया, रक्त परिसंचरण में प्रवेश किया औरफेफड़ों को 21उपनिवेश किया।
यह देखते हुए कि एलएनएस में कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति कैंसर आक्रामकता और आक्रामकता के लिए एक मार्कर है, इस अध्ययन में, हमने ब्रॉड22 द्वारा विकसित एक क्लासिक विधि को अनुकूलित किया ताकि वे विट्रो में एलएनएस को ट्यूमर सेल आसंजन को मात्रात्मक रूप से माप सके। फ्लोरेसेंस आधारित परख के उपयोग ने हमें ट्यूमर कोशिकाओं और एलएन क्रायोसेक्शन के बीच चिपकने वाले परिवर्तनों का पता लगाने के लिए कम लागत, तेजी से, संवेदनशील और पर्यावरण के अनुकूल (गैररेडियोधर्मी) प्रोटोकॉल विकसित करने की अनुमति दी। इस विधि का उदाहरण देने के लिए एनडीआरजी4 जीन अभिव्यक्ति और चूहा एलएन फ्रोजन वर्गों के विभिन्न स्तरों को व्यक्त करने वाले एमसीएफ-7 स्तन कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि इस प्रोटोकॉल ने स्तन कैंसर रोगियों24में देखे गए विट्रो और एलएन मेटास्टेमिस में एलएनएस के लिए ट्यूमर सेल आसंजन के बीच एक अच्छा संबंध की अनुमति दी ।
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Protocol
एलएनएस को सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा बलिदान किए गए स्वस्थ वयस्क विस्टार चूहों के ताजा शवों से बरामद किया गया । हमने प्रयोगशाला पशुओं में दर्द और संकट के लिए एनआईएच दिशानिर्देशों का पालन किया और सभी प्रक्रियाओं को सिरियो-लिबेस अस्पताल (सीयूए पी 2016-04) के अनुसंधान और शिक्षा संस्थान के नैतिकता समिति और पशु अनुसंधान द्वारा अनुमोदित किया गया था।
नोट: सभी ताजा जमे हुए ऊतकों को जैव खतरनाक माना जाता है और उचित जैव सुरक्षा सावधानियों का उपयोग करके संभाला जाना चाहिए।
1. लिम्फेनेक्टॉमी और क्रायोसेक्शनिंग
- कमरे के तापमान पर एक साफ विच्छेदन बोर्ड पर पृष्ठीय विश्राम में झूठ बोल वयस्क Wistar चूहों (180-220 ग्राम) के ताजा शवों रखें ।
नोट: एलएनएस को इच्छामृत्यु के बाद 30 मिन तक एकत्र किया जाना चाहिए। - 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ चूहे के शव को स्प्रे करें और एलएन संचयन के लिए निष्फल उपकरणों का उपयोग करें।
- चिमटी की सहायता से पेट की त्वचा को उठाएं और अंतर्निहित ऊतकों को नुकसान पहुंचाए बिना एक मध्यस्थ चीरा के साथ एक गुहा खोलें, पेट आंत को उजागर करें। आंत को बाहर निकालें और छाती और पेट के एलएनएस दिखाई देते हैं(चित्र 1)।
- ध्यान से कुंद टिप कैंची के उपयोग के साथ प्रत्येक चूहे से एलएनएस आबकारी के पीछे झूठ बोल बेहतर मेसेंडेरिक धमनी घायल से बचने के लिए ।
नोट: पुन: काटने लिम्फ नोड के स्थान के आधार पर, इसका पालन करने वाले अन्य ऊतकों को साफ करना आवश्यक है, जैसे कि मेसेंट्रिक ऊतक। - 15 मिलीएल शंकुई ट्यूबों में हार्वेस्ट एलएनएस जिसमें बाँझ फॉस्फेट बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) के 5 मिलील होते हैं।
- चूहे के शवों को ठीक से त्याग दें।
- पीबीएस से ताजा एलएनएस निकालें, रोल और एक सूखी फिल्टर कागज पर नोड सूखी । इसे एक छोटी पेट्री डिश में रखें और 2 मिन के लिए जमे हुए ऊतक नमूनों (O.C.T.) के लिए एम्बेडिंग समाधान जोड़ें।
- स्थानांतरण और एलएन चेहरा एक क्रायोमोल्ड के आधार में एक वांछित स्थिति में नीचे केंद्रित, बस पर्याप्त O.C.T के साथ इसे कवर करने के लिए । ऊतक के पास बुलबुले से बचें। सेक्शनिंग सतह क्रायोमोल्ड के नीचे है।
- तुरंत स्नैप-सूखी बर्फ के साथ एक स्टायरोफोम कूलर में क्रायोमोल्ड फ्रीज। जब अभी भी जमे हुए O.C.T. (~ 20-35 एस) का एक छोटा सा हिस्सा है, तो नमूने को एल्यूमीनियम पन्नी में स्थानांतरित करें और अन्य नमूनों को फ्रीज करने के लिए जारी रखते हुए इसे सूखी बर्फ के साथ कूलर में रखें। अंत में, सभी नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर अनुभागित होने तक स्टोर करें।
- एक क्रायोस्टेट के साथ एलएन को 5-8 माइक्रोन में सेक्शन मोटाई को समायोजित करें। माइक्रोस्कोप स्लाइड पर क्राइन सेक्शन को स्थानांतरित करें।
नोट: सेक्शनिंग से पहले, जमे हुए नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटा दें और उन्हें लगभग 30 मिनट तक के लिए -22 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टेट माइक्रोटोम चैंबर में तापमान को समतुल्य करने की अनुमति दें। एलएन युक्त स्लाइड्स को एक महीने तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
2. फ्लोरोसेंट रंगों के साथ सेलुलर लेबलिंग
नोट: फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग सेल जीव विज्ञान में व्यापक रूप से किया जाता है। हम लंबी श्रृंखला dialkylcarbocyanines लेबलिंग (DiI (सी18),उत्तेजना ५४९ एनएम, उत्सर्जन ५६५ एनएम का उपयोग करना पसंद करते हैं क्योंकि वे उज्ज्वल, स्थिर हैं और संस्कृति मीडिया में सीधे जोड़ा जा सकता है, सेल व्यवहार्यता या सेल चिपकने वाले गुणों को प्रभावित नहीं करता है25,26।
- आदर्श परिस्थितियों में बढ़ रही कोशिकाओं को अलग करना (यानी, पूर्ण माध्यम में) और 106 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर सीरम-मुक्त माध्यम में फिर से निलंबित करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए दिल (सी18)(2 μg/mL) के साथ a15 mL शंकुन ट्यूब और लेबल के लिए सेल निलंबन (106 कोशिकाओं) के 1 mL जोड़ें ।
नोट: 5 मिन के बाद, धीरे से कोशिका तलछट और तलछट कोशिकाओं के कम दाग से बचने के लिए ट्यूबों को उत्तेजित करें। बड़े घनत्व को एक समान धुंधला करने के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है। सेल धुंधला के लिए एक इष्टतम ऊष्मायन समय सेल लाइन के साथ बदलता रहता है। पारंपरिक FL2 फ्लो साइटोमेट्री डिटेक्शन चैनल(चित्रा 2ए)का उपयोग करके इसे बेहतर मात्रा में निर्धारित किया जा सकता है। - 4 मिन के लिए 300 x ग्राम पर लेबल निलंबन ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
- सुपरनेट ेंट निकालें और सीरम-फ्री मीडियम के 10 एमएएल में दो बार धो लें। कोशिकाओं को लाल छर्रों के रूप में ठीक करें। सीरम-मुक्त माध्यम में 106 कोशिकाओं/mL पर कोशिकाओं को 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ फिर से निलंबित करें।
3. पॉली-एल-लिसिन समाधान या बीएसए के साथ प्रीकोटिंग व्यंजन एक सीडिंग कंट्रोल (वैकल्पिक) के रूप में
नोट: हम सेल संस्कृति सकारात्मक लोडिंग नियंत्रण सतहों के रूप में PLL के साथ precoated व्यंजन का इस्तेमाल किया सुनिश्चित करें कि ट्यूमर कोशिकाओं के विभिंन प्रयोगात्मक समूहों को एक ही संख्या में वरीयता प्राप्त थे, साथ ही साथ बीएसए-लेपित सतहों नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ।
- बाँझ परिस्थितियों में, पीएलएल-या बीएसए-कोटेड कुओं को तैयार करने के लिए, पीएलएल के 300 माइक्रोन (एच2ओ में 0.1% w/v) या बीएसए (एच2ओ में 2.5% डब्ल्यू/वी पर पतला) सीधे 24-अच्छी प्लेट और इनक्यूबेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जोड़ें।
- आकांक्षा द्वारा समाधान निकालें, धीरे से बाँझ PBS और हवा के साथ सतह कुल्ला-सेल सीडिंग से पहले ऊतक संस्कृति हुड में कमरे के तापमान पर थाली सूखी ।
नोट: PLL या बीएसए के अंतिम संस्करणों को विभिन्न अच्छी तरह से प्लेटों के क्षेत्र के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
4. एलएन क्रायोसेक्शन या PLL/बीएसए-लेपित कुओं पर फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को सीडिंग
नोट: प्रयोगात्मक नियंत्रण के रूप में, हमने (1) सेल संस्कृति व्यंजनों का उपयोग किया जो प्रति प्रयोग उसी एलएन के लगातार वर्गों और (2) प्रति प्रयोग के लगातार खंडों (चित्रा 2डीमें इस विस्तार को देखें), जहां उत्तरार्द्ध प्रत्येक एलएन अनुभाग की अतिरिक्त मैट्रिक्स (ईसीएम) संरचना में क्षेत्रीय विविधताओं को कम करेगा, जो बदले में सेल आसंजन दर को निर्देशित कर सकता है। निम्नलिखित ट्यूमर सेल आसंजन परख के लिए, उच्च गुणवत्ता और अनुक्रमिक एलएन क्रायोसेक्शन का चयन करें।
- धीरे-धीरे क्रायोसेक्शन को पीबीएस के साथ दो बार धोएं और कमरे के तापमान पर 15 न्यूनतम के लिए पीबीएस के साथ रिहाइड्रेट करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 2.5% बीएसए के साथ क्रायोसेक्शन के लिए अविशिष्ट आसंजन ब्लॉक करें। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री वॉश चैम्बर्स और लेमिना पालना का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए करें कि वॉश और ऊष्मायन के दौरान पूरे ओसीटी को हटा दिया गया था।
- एक सूखे कागज तौलिया पर अतिरिक्त बीएसए नाली, एक कपास झाड़ू के साथ एलएन वर्गों की रूपरेखा सूखी और एक पीएपी कलम का उपयोग कर वर्गों घेरना ।
- ट्यूमर सेल आसंजन परख के लिए, सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें (चरण 2.4 से) प्रत्येक घेर एलएन अनुभाग में या अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से PLL-लेपित प्लेटों में और यह पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए एक humidified कक्ष रैक में जगह है।
नोट: सेल निलंबन की अंतिम मात्रा अलग घेर एलएनएस के क्षेत्र के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । - पीबीएस के साथ चार बार गैर-अनुयायी कोशिकाओं को धीरे से धोएं। कमरे के तापमान पर 15 न्यूनतम के लिए पीबीएस में 3.7% फॉर्मलडिहाइड के साथ शेष अनुयायी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को ठीक करें।
5. चिपकने वाला सूचकांक का मैनुअल परिमाणीकरण
नोट: चिपकने वाला सूचकांक (यानी, ट्यूमर कोशिकाओं/एलएन मिमी2)एक 10X उद्देश्य का उपयोग करके हासिल किया गया था और मैन्युअल रूप से ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की गिनती, आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना गया और एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2डी),कई स्वतंत्र क्षेत्रों के प्रति लिम्फ नोड क्षेत्रों (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान इमेजजे/फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त) द्वारा पुष्टि की गई थी।
- उज्ज्वल और लाल फ्लोरोसेंट क्षेत्रों(चित्रा 2डी)के अनुरूप दो चैनलों में अलग-अलग झगड़ा छवियों को लेने के लिए 10x उद्देश्य के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। नाम और व्यवस्थित रूप से इन छवियों को बचाने के लिए।
- इमेजजे/फिजी शुरू करें, छवियों को खोलें और पैमाना निर्धारित करें। अंशांकन पैमाने (जैसे, एक माइक्रोमेट्रिक शासक 1 मिमी)(चित्रा 2सी)का उपयोग करना आवश्यक है।
- माइक्रोमेट्रिक शासक (या एक चरण माइक्रोमीटर) की तस्वीर खोलें, सीधी रेखा उपकरण का चयन करें और एक सीधी रेखा खींचें जो एक ज्ञात दूरी को परिभाषित करती है।
- एनालाइजा मेनू में, सेट स्केलका चयन करें। पिक्सल में दूरी चरण 5.3 में खींची गई लाइन की लंबाई (पिक्सल में) के आधार पर भरी जाएगी। ज्ञात दूरी वास्तविक दूरी (इस मामले में, मिलीमीटर में) और लंबाई क्षेत्र की इकाई में लंबाई की इकाई (इस मामले में, मिलीमीटर में) से भरी जाएगी।
- ग्लोबल पर क्लिक करें (यह अंशांकन इस ImageJ/FIJI सत्र में खोली गई सभी छवियों पर लागू होता है) और ओकेप्रेस ।
- लिम्फ नोड क्षेत्र क्वांटिफिकेशन: छड़ी उपकरण का चयन करें और डबल क्लिक करके, छड़ी टूल सेटिंग्स खोलें। 8-कनेक्टेडकरने के लिए मोड सेट करें। फोटो में क्लिक करें और फोटो में सभी लिम्फ नोड्स का चयन करें और ठीकप्रेस जब तक सहिष्णुता सेट । क्षेत्र को मापने के लिए, खुला विश्लेषण । उपाय (सीटीआरएल + एम)। यह क्षेत्र पूर्व में निर्धारित इकाइयों में व्यक्त किया जाता है।
- ट्यूमर सेल क्वांटिफिकेशन: फिजी सॉफ्टवेयर में लाइट माइक्रोस्कोपी/फ्लोरेसेंस इमेज खोलें । प्लगइन्स का चयन करें । विश्लेषण करें । सेल काउंटर । सेल काउंटर। सेल काउंटर विंडो में मात्रा निर्धारित करने और आरंभिक बटन दबाने के लिए फोटो पर क्लिक करें। काउंटर टाइप (1-8) का चयन करें और तस्वीर में कोशिकाओं पर क्लिक करें। अगली फोटो को शुरू करने के लिए सेल काउंटर विंडो में रीसेट बटन दबाएं, नई फोटो खोलें और सभी स्टेप्स दोहराएं।
नोट: एलएन आसंजन सूचकांक एलएन कवर क्षेत्र (कोशिकाओं/मिमी2)प्रति अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है ।
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Representative Results
हम लाल फ्लोरोसेंट एमसीएफ-7 स्तन कैंसर कोशिकाओं की एलएन चिपकने वाली क्षमता का मूल्यांकन करके परख को दर्शाते हैं, जिसमें एनडीआरजी4 जीन के विभिन्न स्तरों को व्यक्त किया गया है (जिसे एनडीआरजी4-सकारात्मक और एनडीआरजी4-नकारात्मक कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है), कोशिका सतह24पर बीटा1-पूर्णांक क्लस्टरिंग का एक नकारात्मक मॉड्यूलर, चूहा एलएन-अनुयायी कोशिका ट्यूमर के अंशों की जांच करके। इस प्रोटोकॉल की कच्ची छवियों के उदाहरण चित्र 2में दिखाए गए हैं । जैसा कि चित्र ा 2बीमें देखा गया है, अनुयायी कोशिकाओं की आकृति विज्ञान आकार में गोल होती है, और उन्हें पूरे एलएन में विषम रूप से फैलाया जाता है। एलएन चिपकने वाला सूचकांक NDRG4-नकारात्मक MCF-7 कोशिकाओं (८७७ ± १२४ कोशिकाओं/LN के एमएम2) में 2 गुना अधिक है कि इसी NDRG4 में तुलना में सकारात्मक MCF-7 कोशिकाओं (४१२ ± ७६ कोशिकाओं/LN, पी = ०.०३)(चित्रा 2डी)के एमएम2 ।
चित्रा 1: चूहा मेसेंडेरिक एलएनएस के अलगाव के लिए स्टेपवाइज प्रक्रिया। (A)वेंट्रल मिडलाइन त्वचा चीरा: इच्छामृत्यु चूहों को पृष्ठीय रीक्यूबेंसी स्थिति में रखा गया था और मध्य पेट में स्थित त्वचा में 30-50 मिमी मिडलाइन चीरा लगाया गया था, जिससे पेट का आंत (यकृत, छोटी आंत, सीकम और मूत्राशय) उजागर होता था। (ख)छोटी आंत को धीरे से पेट की गुहा से बाहर निकाला गया, जिसमें आंत के ऊतकों में एम्बेडेड चूहे मेसेंडेरिक एलएनएस को उजागर किया गया । (ग)हटाने के बाद विच्छेदित गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट की सकल शरीर रचना। (डी)जोड़ने वाले ऊतकों से विच्छेदित मेसेंडेरिक लिम्फ नोड्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: चूहा लिम्फ नोड वर्गों के लिए ट्यूमर सेल आसंजन के प्रतिनिधि परिणाम। (A)इलस्ट्रेटिव फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण जिसमें गैर-लेबल वाली कोशिकाओं (निचले चतुर्भुज) की तुलना में डीआई (सी18)लेबलिंग (ऊपरी चतुर्भुज) की तीव्रता को दर्शाया गया है। (ख)लाल लेबल वाले एमसीएफ-7 कोशिकाओं की लाइट (बाएं) और फ्लोरोसेंट (दाएं) माइक्रोस्कोपी छवियां वाशिंग स्टेप के बाद एलएन वर्गों का पालन करती हैं । (ग)आसंजन परख के बाद, कवरस्लिप पर संलग्न कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से लिम्फ नोड क्षेत्र और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का अनुमान लगाने के लिए एक अंशांकन पैमाने का उपयोग करके सीधे सेल गिनती के लिए मात्रा निर्धारित कर रहे हैं । (D)एमसीएफ-7 स्तन ट्यूमर कोशिकाओं में NDRG4 नॉकडाउन लिम्फ नोड आसंजन को बढ़ाता है । लाल फ्लोरोसेंट एमसीएफ-7 कोशिकाओं (NDRG4-सकारात्मक या NDRG4-नकारात्मक DiIC18-लेबल कोशिकाओं) की प्रतिनिधि छवियां 5 μm चूहा लिम्फ नोड खंडों पर सीडिंग के बाद 30 किमी । एलएन चिपकने वाला सूचकांक एलएन कवर क्षेत्र (कोशिकाओं/मिमी2)प्रति अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है । स्केल बार = 200 माइक्रोन। * पी एंड एलटी; 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
कैंसर कोशिकाओं के लिम्फेटिक सिस्टम प्रसार के लिए विभिन्न प्रकार की जटिल कोशिका-चालित घटनाओं की आवश्यकता होती है। वे प्राथमिक ट्यूमर से सेल टुकड़ी और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) वास्तुकला के पुनर्मॉडलिंग के साथ शुरू करते हैं, और प्रहरी एलएनएस के रास्ते में अफ्रेरेंट लिंफेटिक्स के माध्यम से लगातार कीमोटैक्सिस और सक्रिय प्रवास द्वारा समर्थित होते हैं। यदि कैंसर कोशिकाओं का पालन करें और एलएनएस में जीवित रहते हैं, वे आसानी से अंय माध्यमिक अंगों में फैल सकता है । यहां हम ट्यूमर कोशिकाओं और जमे हुए एलएनएस के बीच विशिष्ट चिपकने वाली बातचीत के तेजी से और कम लागत वाले कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक आसान विधि का वर्णन करते हैं।
संरचनात्मक रूप से, एलएनएस ईसीएम फाइबर के घने और व्यापक नेटवर्क के असतत स्पंज जैसी जनता हैं, जिन्हें अक्सर "रेटिकुलर फाइबर" के रूप में जाना जाता है, जो सेल माइग्रेशन के लिए पथ के रूप में कार्य करते हैं और एलएन परेंचिमा27के भीतर घुलनशील कारकों (एंटीजन और/या केमोकिन्स) के तेजी से वितरण के लिए नाली के रूप में। परख के जमे हुए एलएनएस के संरक्षित रीटिकुलर फाइबर हैप्टोटैक्टिक संकेतों का समर्थन करते हैं और विट्रो में ट्यूमर सेल आसंजन के लिए मचान प्रदान करते हैं। ये फाइबर मुख्य रूप से संरचनात्मक प्रोटीन से बने होते हैं, जैसे कि कोलेजन प्रथम और तृतीय, और द्वितीयक ईसीएम तत्वों जैसे फाइब्रोनेक्टिन, टेनासिन, लेमिनिन, वित्रोनेक्टिन और हेपरन सल्फेट प्रोटेओग्लिकन28,29। सेल आसंजन के बाद, इनमें से अधिकांश एलएन-व्युत्पन्न ईसीएम कारक आणविक संकेत प्रदान करते हैं जो पूर्णांक-मध्यस्थता संकेतों के माध्यम से सेल सर्वाइवल (प्रोलिफेरेटिव या निद्रा राज्य) या सेल डेथ (एनोइकिस) निर्धारित करते हैं।
यहां, हम ज़ेनोजेनिक चूहा एलएनएस और एक मानव स्तन ट्यूमर सेल लाइन का उपयोग कर परख प्रदर्शित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, एलएनएस के अन्य स्रोतों का उपयोग किया जा सकता है। चूहे, माउस या मानव एलएनएस की संरचना में वही संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रोटीन शामिल हैं जो देशी स्तनधारी ईसीएम का हिस्सा हैं, सभी समान बाध्यकारी साइटों को संरक्षित करते हैं जो सेल आसंजन23के लिए आवश्यक हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि एकमात्र महत्वपूर्ण कदम प्रत्येक एलएन अनुभाग की ईसीएम संरचना में क्षेत्रीय विविधताओं को कम करने के लिए प्रति प्रयोग एक ही एलएन के लगातार स्लाइस का उपयोग करना है, जो बदले में सेल आसंजन दर को निर्देशित कर सकता है।
परख की एक खामी यह है कि यह लिम्फेटिक प्रसार के पहले कदम को फिर से तैयार नहीं करता है, केवल एलएनएस के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की चिपकने वाली ताकत को दर्शाती है। उदाहरण के लिए, एमएसीएफ-7(चित्रा 2)या T47D ट्यूमर सेल लाइनों24जैसे एलएन वर्गों पर कम आक्रामक स्तन ट्यूमर कोशिकाओं को सीडिंग करना, उच्च आक्रामक एमडीए-एमबी-231 ट्यूमर कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाए गए) के लिए मनाए गए समान स्तरों की तुलना में विट्रो में एलएन वर्गों के लिए एक मजबूत आसंजन का कारण बनता है। हालांकि, यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि ऑर्थोटोपिक एमसीएफ-7 विद्वेष ट्यूमर प्रहरी एलएनएस तक नहीं पहुंच सकता है, जबकि एमडीए-एमबी-२३१ ट्यूमर अनायास उन्हें30मेटास्टेसाइज कर ते हैं । जाहिर है, एमसीएफ-7 कोशिकाओं के लिए मुख्य अड़चन एलएन-मेटास्टेमिस गठन एलएन तक पहुंचने और उसका पालन करने से पहले कदम-कदम में होते हैं, जैसे एमसीएफ-7 कोशिकाओं की अक्षमता कुशलतापूर्वक प्राथमिक ट्यूमर से बच जाती है। इसलिए, यहां वर्णित परख की ताकत एलएन-मेटास्टैटिक क्षमता के साथ सीधे सहसंबंध स्थापित नहीं है, लेकिन विट्रो में अधिक यथार्थवादी ईसीएम में ट्यूमर सेल के चिपकने वाले गुणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल तरीका है। जमे हुए ऊतकों का उपयोग करके, क्रायोसेक्शन संरचना और संरचना के मामले में एलएनएस की प्राकृतिक जटिलता का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो सिंथेटिक तकनीकों का उपयोग करके विश्राम करना असंभव होगा, विशेष रूप से शुद्ध ईसीएम प्रोटीन का उपयोग करने वाले।
विधि की अतिरिक्त सीमाएं हैं (1) यह एलएनएस द्वारा स्रावित कारकों की कीमोटैक्टिक क्षमता के मूल्यांकन की अनुमति नहीं देता है और यह (2) यह इस बारे में सूचित नहीं करता है कि एलएन वर्गों के लिए सेल-विशिष्ट आसंजन एलएन वर्गों के लिए तरजीही बाध्यकारी का परिणाम है या नहीं। हालांकि, हमने महसूस किया कि यह दृष्टिकोण प्रासंगिक हो सकता है और विशेष अनुप्रयोगों के लिए गंभीरता से विचार किया जाना चाहिए, लेकिन इस विशेष पांडुलिपि के दायरे से परे थे । उदाहरण के लिए, हाल ही में एक अध्ययन में, हमने स्तन ट्यूमर24में एलएन मेटाटैसिस के मशीनिस्ट बायोमार्कर के रूप में एन-मायक डाउनस्ट्रीम-विनियमित जीन 4 (एनडीजीआर4) की पहचान की। मशीनी रूप से, एनडीआरजी4 अभिव्यक्ति की कमी वाले ट्यूमर कोशिकाएं स्तन ट्यूमर कोशिकाओं के अग्रणी किनारे पर 1-पूर्णांक रिसेप्टर्स की असेंबली के पक्ष में एलएनएस के क्रायोसेक्शन में आसंजन को बढ़ाती हैं। इसके अलावा, शुद्ध ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित व्यंजनों की तरह अतिरिक्त नियंत्रणों का उपयोग करके, हमने खुला है कि एलएन वर्गों के लिए अंतर आसंजन vitronectin24के साथ चयनात्मक सहयोग का परिणाम है ।
अंत में, यह नोट करने लायक है कि यह विधि एलएनएस वर्गों तक सीमित नहीं है और तिल्ली या फेफड़ों के क्रायोसेक्शन जैसे विभिन्न जीवित अंगों के लिए सेल आसंजन का आकलन करने के लिए स्थापित किया जा सकता है। मेटास्टैटिक कोशिकाएं विट्रो में विभिन्न अंगों के जमे हुए वर्गों में चिपकने वाली ताकत के ऑर्गनोट्रोपिज्म और मापन का प्रदर्शन करती हैं, अंग-विशिष्ट कैंसर प्रसार की भविष्यवाणी के लिए एक उपयोगी मतलब हो सकती हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए डॉ रोसाना डी लीमा पगानो और एना कैरोलिना पिन्हेरो कैम्पोस का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम से अनुदान द्वारा समर्थित था: FAPESP-साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (2016/07463-4) और लुडविग इंस्टीट्यूट फॉर कैंसर रिसर्च (LICR) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
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