Summary
Burada, lenf nodu (LN) kriyokesilere yapışkan tümör hücrelerinin sayısallaştırılmasını sağlayan basit ve ucuz bir yöntemi tanımlıyoruz. LN-yapışık tümör hücreleri ışık mikroskobu ile kolayca tanımlanır ve floresan tabanlı bir yöntemle doğrulanır, tümör hücre bağlayıcılığını LN parenkime bağlayan bir adezyon indeksi verir.
Abstract
Tümör drenaj lenf düğümleri (LNs) sadece tümör üretilen atık filtreleri değildir. Farklı kanser türlerine sahip hastalarda disemine tümör hücrelerinin geçici ikamet en yaygın bölgesel sitelerinden biridir. Bu LN-ikamet eden tümör hücrelerinin tespiti kötü prognoz ve adjuvan tedavi kararları ile ilişkili önemli bir biyobelirteçtir. Son fare modelleri LN-ikamet tümör hücrelerinin uzak metastazlar için malign hücrelerin önemli bir kaynak olabileceğini göstermiştir. Tümör hücrelerinin LN parankim'e yapışmasını ölçebilme yeteneği, genlerin tanımlanmasına veya lenfatik/metastatik yayma ile ilgili sinyal yollarına odaklanan deneysel araştırmalarda kritik bir göstergedir. LN'ler, kesit düzlemine bağlı olarak doku kesitlerinde çeşitli görünüm ve kompozisyonlara sahip karmaşık 3B yapılar olduğundan, matrislerinin deneysel olarak in vitro'yu tam kontrollü bir şekilde kopyalaması zordur. Burada, yapışkan tümör hücrelerinin LN kriyokesilerine nicelleştirilmesini sağlayan basit ve ucuz bir yöntemi tanımlıyoruz. Aynı LN'nin seri bölümlerini kullanarak Brodt tarafından geliştirilen klasik yöntemi radyoaktif olmayan etiketler kullanmak ve LN yüzey alanına göre bağlı tümör hücrelerinin sayısını doğrudan saymak için uyarlıyoruz. LN-yapışık tümör hücreleri ışık mikroskobu ile kolayca tanımlanır ve floresan tabanlı bir yöntemle doğrulanır, ln parenkim için hücre bağlayıcı lık ortaya koyan bir adezyon indeksi vererek, integrinlerin bağlaçlarına bağlanmasında moleküler değişikliklerin düşündürücü kanıtıdır.
Introduction
Kanser metastazı tedavi başarısızlığının ana nedeni ve kanserin yaşamı tehdit eden yönüdür. 130 yıl önce öne sürüldüğünde, metastatik yayılma sonuçları, yaygın tümör hücrelerinin elit (DTCs, "tohumlar") onları birincil siteleri kaçınmak ve uzak bölgelerde kötü huylu büyüme kurmak için izin belirli biyolojik yetenekler elde ("toprak")1. Son zamanlarda, premetastatik nişler indüksiyon ("tohum" gelişmek için gerekli bir "verimli toprak" olarak kavramsallaştırılmış), DTCs tarafından birincil tümörlerin kendi kendine tohumlama, ikincil organlarda "tohum" uykuhali ve metastazparalelilerleme modeli 2 gibi "tohum ve toprak" ilişkileri ile ilgili çeşitli yeni kavramlar ortaya çıkmıştır 2 .
Çoğu katı maligniteiçin, DTC'ler klinik metastaz bulgusu olan veya olmayan hastalarda kemik iliği ve lenf düğümleri (LN) gibi birçok mezenkimal organda bulunabilir ve saptanabilir. Tümör drenaj LNs DTCs bölgesel yayılmasının ilk yer olduğundan, LN durumu önemli bir prognostik göstergesidir ve genellikle adjuvan tedavi kararları ile ilişkilidir3. Bazı tümör tipleri için, LN durumu ve kötü sonuçlar arasındaki korelasyon güçlü, baş ve boyun dahil4,5, meme6, prostat7, akciğer8, mide9, kolorektal10,11 ve tiroid kanserleri12.
NNs retiküler hücrelerle kaplı ve lenfatik damarlar ile çevrili lenfatik sistemin küçük oval organlardır. Bu organlar kesinlikle bağışıklık sisteminin işleyişi için gereklidir13. NNs birlikte lenfositler ve antijen sunan hücreleri getirerek, bağışıklık dolaşan hücreler için çekici platformlar olarak hareket14. Ancak, LNs da dolaşan tümör hücrelerini çekmek. On yıllar boyunca, LNs metastatik tümör hücreleri için ulaşım pasif yolları olarak resmedildi. Ancak, son çalışmalar tümör hücrelerinin de kemotaktik (kemokinler) ve / veya haptotaktik (ekstrasellüler matriks elemanları) ipuçları lenfatik endotel15tarafından salgılanan lNs doğru yönlendirilmiş olabileceğini göstermiştir. Örnek olarak, tümör hücrelerinde CCR7 reseptörünün aşırı ekspresyonu tümör drenaj LNs16doğru metastatik melanom hücrelerinin rehberlik kolaylaştırır. Buna ek olarak, ekstrasellüler LN proteinleri işe alma ve dolaşım da dahil olmak üzere bir yapışkan iskele sağlamak17. Aslında, tümör drenaj LNs belirli LN mikroçevresel sinyaller18tarafından proliferatif veya atıl devletlerde muhafaza edilebilir DTCs, tohumlama için verimli toprak sağlamak. Bu LN ikamet Eden DTCs nihai kaderi tartışmalıdır; bazı çalışmalar bu hücrelerin metastatik ilerleme pasif göstergeler olduğunu düşündürmektedir19, diğerleri direnç daha olası kurucuları olduğunu düşündürmektedir (kendi kendine tohumlama birincil siteleri) ve / veya metastaziçin hücresel rezervuarlar olarak hareket (üçüncül kanser büyümesi için "tohum" yayılıyor)20,21. Son zamanlarda, preklinik modeller kullanılarak, bu LN ikamet DTCs aktif kan damarları işgal, kan dolaşımına girdi ve akciğerlerkolonize birkısmını gösterilmiştir 21 .
NNs kanser hücrelerinin varlığı kanser saldırganlık ve invazivite için bir belirteç olduğunu göz önünde bulundurarak, Bu çalışmada, biz kantitatif in IN NNs tümör hücre adezyonu ölçmek için Brodt22 tarafından geliştirilen klasik bir yöntem optimize. Floresan tabanlı bir testin kullanılması, tümör hücreleri ile LN kriyokesitleri arasındaki yapışkan değişikliklerin tespiti için düşük maliyetli, hızlı, hassas ve çevre dostu (radyoaktif olmayan) bir protokol geliştirmemize olanak sağladı. YÖNTEMe örnek vermek için NDRG4 gen ekspresyonu ve sıçan LN dondurulmuş bölümleri farklı düzeylerde ifade MCF-7 meme kanseri hücreleri kullanarak, bu protokol in vitro ve LN metastaz meme kanseri hastalarında gözlenen LN'ler için tümör hücre adezyonu arasında iyi bir korelasyon izin gösterdi24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ldns servikal çıkış tarafından kurban sağlıklı yetişkin Wistar sıçanların taze leşkurtarıldı. NIH Laboratuvar Hayvanlarında Ağrı ve Sıkıntı Rehberi'ni takip ettik ve tüm prosedürler Sírio-Libanês Hastanesi Araştırma ve Eğitim Enstitüsü Etik Komitesi ve Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylandı (CEUA P 2016-04).
NOT: Tüm taze dondurulmuş dokular biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir ve uygun biyogüvenlik önlemleri kullanılarak ele alınmalıdır.
1. Lenfadenektomi ve Kriyoding
- Oda sıcaklığında temiz bir diseksiyon panosuna sırt recumbency yatan yetişkin Wistar sıçanların (180-220 g) taze karkas yerleştirin.
NOT: LN'ler ötanazi sonrası 30 dk'ya kadar toplanmalıdır. - % 70 izopropil alkol ile sıçan karkas sprey ve LN hasat için steril aletler kullanın.
- Cımbız yardımıyla karın derisini kaldırın ve altta yatan dokuya zarar vermeden medial kesi ile bir oyuk açın, karın iç sezgisini açığa. Bağırsak dışarı çekin ve torasik ve abdominal LNs görünür hale gelir (Şekil 1).
- Dikkatle arkasında yatan üstün mezenterik arter yaralanmasını önlemek için künt ucu makası kullanımı ile her sıçan DANS'ları çıkarmak.
NOT: Rezeke lenf nodunun bulunduğu yere bağlı olarak, mezenterik doku gibi ona bağlı diğer dokuların temizlenmesi gereklidir. - 5 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL konik tüpler halinde hasat LN'leri.
- Fare leşlerini düzgün bir şekilde atın.
- PBS'den taze NN'leri çıkarın, düğümü kuru filtre kağıdına yuvarlayın ve kurulayın. Küçük bir Petri kabına yerleştirin ve dondurulmuş doku örnekleri (O.C.T.) için 2 dakika gömme çözeltisi ekleyin.
- LN'yi bir kriyomold tabanında istenilen pozisyonda, üzerini örtecek kadar O.C.T ile aşağı doğru aktarın ve yönlendirin. Doku yakınında kabarcıklar kaçının. Kesit yüzeyi kriyomold'un alt kısmıdır.
- Hemen kuru buz ile bir strafor soğutucu da kriyomold snap-freeze. Hala dondurulmamış O.C.T. (~ 20-35 s) küçük bir parçası olduğunda, alüminyum folyo için örnek aktarın ve kuru buz ile bir soğutucu yerleştirin diğer örnekleri dondurmaya devam ederken. Sonunda, kesit kadar -80 °C'de tüm örnekleri saklayın.
- Kesitli LN, kesit kalınlığını 5-8 m.'ye ayarlayan bir kriyostat ile mikroskop slaytlarına aktarın.
NOT: Kesitlemeden önce, -80 °C'lik dondurucudan dondurulmuş numuneleri çıkarın ve -22 °C'de -22 °C'de sıcaklıkla dengede durun ve ln içeren slaytlar -80 °C'de bir aya kadar saklanabilir.
2. Floresan Boyalar ile Hücresel Etiketleme
NOT: Floresan boyalar hücre biyolojisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Biz uzun zincirli dialkylcarbocyanines etiketleme kullanmayı tercih (DiI(C18),uyarma 549 nm, Emisyon 565 nm) çünkü parlak, istikrarlı ve kültür medya doğrudan eklenebilir, hücre canlılığı veya hücre yapışkan özellikleri etkilemez25,26.
- İdeal koşullarda büyüyen hücreleri ayrıştırın (yani tam ortamda) ve serumsuz ortamda 106 hücre/mL yoğunlukta yeniden askıya alın.
- A15 mL konik tüpe 1 mL hücre süspansiyonu (106 hücre) ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika boyunca Dil(C18)(2 μg/mL) etiketi ekleyin.
NOT: 5 dakika sonra, hücre çökeltisini ve tortul hücrelerin alt boydananmasını önlemek için tüpleri hafifçe çalkalayın. Daha büyük yoğunluklar, tek tip boyama için daha uzun kuluçka süreleri gerektirir. Hücre boyama için en uygun kuluçka süresi hücre hattına göre değişir. Konvansiyonel FL2 akış sitometri sitometri sitometri sitometrisi algılama kanalı kullanılarak daha iyi ölçülebilir (Şekil 2A). - 4 dk için 300 x g etiketli süspansiyon tüpleri santrifüj.
- Supernatant çıkarın ve serum içermeyen orta 10 mL iki kez yıkayın. Hücreleri kırmızı pelet olarak kurtarın. Serumsuz ortamda 106 hücre/mL'deki hücreleri %0.1 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) ile yeniden askıya alın.
3. Poli-L-lizin Solüsyonu veya Tohumlama Kontrolü Olarak BSA ile Precoating Yemekleri (İsteğe Bağlı)
NOT: Farklı tümör hücrelerinin farklı deney gruplarının aynı sayıda tohumlanmış olmasını sağlamak için PLL ile precoated hücre kültürü yemeklerini pozitif yükleme kontrol yüzeyleri olarak, ayrıca bsa kaplı yüzeyleri negatif kontroller olarak kullandık.
- Steril koşullarda, PLL veya BSA kaplı kuyuları hazırlamak için 300 μL PLL (H2O'da %0,1 w/v) veya BSA (H2O'da %2,5 w/v ile seyreltilmiş) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Aspirasyon ile çözeltiyi çıkarın, steril PBS ile yüzeyi hafifçe durulayın ve hücre tohumlamadan önce doku kültürü kaputunda oda sıcaklığında tabağı havakurulayın.
NOT: PLL veya BSA'nın son hacimleri farklı kuyu plakalarının alanına göre ayarlanmalıdır.
4. LN Kriyokesiveya PLL/BSA kaplı Kuyularda Floresan etiketli Tümör Hücrelerinin Tohumlanması
NOT: Deneysel kontroller olarak, (1) pll veya BSA ile önceden kaplanmış hücre kültürü yemeklerini ve (2) deney başına aynı LN'nin ardışık bölümlerini (Şekil 2D'deki bu ayrıntıya bakın), her LN bölümünün hücre yapışma hızını belirleyebilen hücre yapışma hızını belirleyebilen hücre dışı matris (ECM) bileşimindeki bölgesel varyasyonları en aza indirecek olan (Şekil 2D'de)kullandık. Aşağıdaki tümör hücre doyuzyun tonu için yüksek kaliteli ve sıralı LN kriyokesiyonları seçin.
- Kriyokesitleri PBS ile iki kez hafifçe yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS ile rehidrat.
- 37 °C'de 30 dk için %2,5 BSA ile kriyokesitlere spesifik olmayan yapışmayı engelleyin. Yıkama ve kuluçka sırasında tüm O.C.T'nin çıkarıldığından emin olmak için immünohistokimya yıkama odaları ve lamina beşiklerini kullanın.
- Kuru bir kağıt havlu üzerinde fazla BSA drenaj, bir pamuklu bez ile LN bölümlerin anahat kuru ve pap kalem kullanarak bölümleri çevreleyen.
- Tümör hücre adezyonu analizi için, her çevrelenmiş LN bölümüne 100 μL hücre süspansiyonu (adım 2.4)'i ekleyin veya 24 kuyulu PLL kaplı plakalara yerleştirin ve geleneksel hücre kültürü kuluçka makinesinde 37 °C'de 1-2 saat nemlendirilmiş bir hazne rafına yerleştirin.
NOT: Hücre süspansiyonunun son hacmi, farklı çevrelenmiş LN'lerin alanına göre ayarlanmalıdır. - Yapışmaz hücreleri PBS ile dört kez hafifçe yıkayın. Oda sıcaklığında 15 dakika pbs% 3.7 formaldehit ile kalan yapışık floresan hücreleri düzeltin.
5. Yapıştırıcı Endeksinin Manuel Nicelemesi
NOT: Yapıştırıcı indeksi (yani, tümör hücreleri/LN mm2)10X hedefi kullanılarak elde edildi ve tümör hücrelerinin sayısı manuel olarak sayılarak, ışık mikroskobu ile kolayca tanımlandı ve floresan mikroskop(Şekil 2D)ile doğrulandı , çeşitli bağımsız alanların lenf düğüm alanları başına (National Institute of Health ImageJ/FIJI yazılımı kullanılarak elde edildi).
- Parlak ve kırmızı floresan alanlara karşılık gelen iki kanalda ayrı TIFF görüntüleri almak için 10x hedefi olan floresan mikroskop kullanın(Şekil 2D). Bu görüntüleri sistematik olarak adlandırın ve kaydedin.
- ImageJ/FIJI'yi başlatın, görüntüleri açın ve ölçeği ayarlayın. Kalibrasyon ölçeği (örneğin, mikrometrik cetvel 1 mm)(Şekil 2C)kullanmak gerekir.
- Mikrometrik cetvelin (veya sahne mikrometresinin) fotoğrafını açın, Düz çizgi aracını seçin ve bilinen bir mesafeyi tanımlayan düz bir çizgi çizin.
- Analiz menüsünde Ölçek Ayarla'yıseçin. Piksellerde Mesafe, adım 5.3'te çizilen çizginin uzunluğuna (piksel olarak) göre doldurulur. Bilinen mesafe gerçek mesafe (bu durumda, milimetre) ve uzunluk alanı (bu durumda, milimetre cinsinden) birim uzunluk birimi ile doldurulacaktır.
- Global'e tıklayın (bu kalibrasyon bu ImageJ/FIJI oturumunda açılan tüm görüntüler için geçerlidir) ve Tamamtuşuna basın.
- Lenf düğümü alanı ölçümü: Değnek aracını seçin ve çift tıklayarak, Değnek aracı ayarlarını açın. Modu 8'e ayarlayın. Fotoğrafa tıklayın ve fotoğraftaki tüm lenf düğümlerini seçene kadar toleransı ayarlayın ve Tamamtuşuna basın. Alanı ölçmek için Analyze | Ölçü (CTRL + M). Alan daha önce belirlenen birimlerde ifade edilir.
- Tümör hücre niceliği: FIJI yazılımındaki ışık mikroskobu/floresan görüntülerini açın. Eklentileri Seçin | Analiz Et | Hücre Sayacı | Hücre Sayacı. Sayısalhale getirmek için fotoğrafın üzerine tıklayın ve hücre sayacı penceresinde Ki'ye initialize düğmesine basın. Sayaç türünü (1-8) seçin ve fotoğraftaki hücrelere tıklayın. Bir sonraki fotoğrafı açmak için hücre sayacı penceresindeki Sıfırla düğmesine basın, yeni fotoğrafı açın ve tüm adımları yineleyin.
NOT: LN adezyon indeksi, LN kapalı alana göre yapışık tümör hücrelerinin sayısı olarak ifade edilir (hücre/mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz ndrg4 geninin farklı düzeylerde ifade kırmızı floresan MCF-7 meme kanseri hücrelerinin LN yapışkan potansiyelini değerlendirerek test göstermek (NDRG4-pozitif ve NDRG4-negatif hücreler olarak anılacaktır), hücre yüzeyinde beta1-integrin kümeleme negatif bir modülatör24, sıçan LN-adheren tümör hücrelerinin fraksiyonları inceleyerek. Bu protokolün ham görüntüleriörnekleri Şekil 2'degösterilmiştir. Şekil 2B'dede görüldüğü gibi, yapışık hücrelerin morfolojisi şekilli olarak yuvarlanır ve LN boyunca heterojen olarak dağılırlar. LN yapıştırıcı indeksi NDRG4-negatif MCF-7 hücrelerinde (877 ± 124 hücre/mm2 LN) 2 kat daha yüksektir( buna karşılık gelen NDRG4-pozitif MCF-7 hücrelerinde (412 ± 76 hücre/mm2 LN, p = 0,03)(Şekil 2D).
Şekil 1: Sıçan mezenterik LNs izolasyon için adım adım prosedürü. (A) Ventral orta hat deri kesi: ötenazi sıçanlar dorsal recumbency pozisyona yerleştirildi ve 30-50 mm orta hat insizyonu orta karın örten deride yapıldı, karın visseraaçığa (karaciğer, ince bağırsak, çekum ve mesane). (B) İnce bağırsak, visseral yağ dokusuna gömülü sıçan mezenterik LN'lerini teşhir ederek karın boşluğundan hafifçe çıkarıldı. (C) Çıkarıldıktan sonra diseksiyon edilen gastrointestinal sistem brüt anatomisi. (D) Bağlanan yağ dokusundan mezenterik lenf düğümleri kesilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıçan lenf nodu kesitlerine tümör hücre adezyonunun temsili sonuçları. (A) Etiketsiz hücrelere (alt kadranda) göre DiI(C18)etiketlemenin (üst kadranda) yoğunluğunu gösteren açıklayıcı akış sitometri analizi. (B) Kırmızı etiketli MCF-7 hücrelerinin ışık (sol) ve floresan (sağda) mikroskopi görüntüleri yıkama adımından sonra LN bölümlerine yapışır. (C) Adezyon testinden sonra, kapaklara bağlı hücreler, lenf nodu bölgesini tahmin etmek için kalibrasyon ölçeği ve doğrudan hücre sayımı için floresan mikroskopi kullanılarak elle ölçülür. (D) NDRG4 MCF-7 meme tümör hücrelerinde nakavt lenf nodu adezyonu artar. Kırmızı floresan MCF-7 hücrelerinin temsili görüntüleri (NDRG4-pozitif veya NDRG4-negatif DiIC18 etiketli hücreler) 5 μm sıçan lenf nodbölümleri ne zaman tohumlama sonra 30 dk. LN yapıştırıcı indeksi, LN kapalı alana göre yapışık tümör hücrelerinin sayısı olarak ifade edilir (hücre/mm2). Ölçek çubuğu = 200 μm. *p < 0,05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanser hücrelerinin lenfatik sistem yayılması karmaşık hücre odaklı olaylar çeşitli gerektirir. Onlar primer tümör hücre ayrılması ve ekstrasellüler matriks remodeling ile başlar (ECM) mimarisi, ve kalıcı kemotaksis ve sentinel NNs yolda afferent lenfatikler aracılığıyla aktif göç tarafından desteklenir. Kanser hücreleri bağlı ve LNs hayatta, kolayca diğer ikincil organlara yayılabilir. Burada tümör hücreleri ve dondurulmuş NN'ler arasındaki özel yapışkan etkileşimlerin hızlı ve düşük maliyetli fonksiyonel analizi için kolay bir yöntem açıklıyoruz.
Yapısal olarak, LN'ler, ln parenchyma27içinde hücre göçü için yollar ve çözünür faktörlerin (antijenler ve/veya kemokinler) hızlı bir şekilde teslimi için kanal olarak hareket eden "retiküler lifler" olarak adlandırılan, yoğun ve geniş ECM liflerinin sünger benzeri kütleleridir. Testin dondurulmuş LN'lerinin korunmuş retiküler lifleri haptotaktik sinyalleri destekler ve in vitro tümör hücre adezyonu için iskeleler sağlar. Bu lifler öncelikle yapısal proteinler oluşur, kollajenler I ve III gibi, ve ikincil ECM elemanları tarafından, fibronektin gibi, tenasin, laminin, vitronektin ve heparan sülfat proteoglikanlar28,29. Hücre adezyonu sonrasında, bu LN türetilmiş ECM faktörlerinin çoğu integrin aracılı sinyaller yoluyla hücre sağkalımını (proliferatif veya uyku durumlarını) veya hücre ölümünü (anoikis) belirleyen moleküler ipuçları sağlar.
Burada, ksenojenik sıçan LNs ve bir insan meme tümörü hücre hattı kullanarak testi göstermek. Alternatif olarak, diğer LN kaynakları kullanılabilir. Sıçan, fare veya insan LNs bileşimi yerli memeli ECM bir parçası olan aynı yapısal ve fonksiyonel proteinleri içerir, tüm hücre yapışması için gerekli olan benzer bağlama siteleri koruyarak23. Daha da önemlisi, tek kritik adım, her LN bölümünün ECM bileşimindeki bölgesel varyasyonları en aza indirmek için deney başına aynı LN'nin ardışık dilimlerini kullanmaktır ve bu da hücre yapışma hızını belirleyebilir.
Titrenin bir dezavantajı lenfatik yayılmanın ilk adımlarını tekrarlamamasıdır, sadece tümör hücrelerinin yapışkan gücünü NN'lere yansıtır. Örneğin, LN kesitlerinde, MCF-7(Şekil 2) veya T47D tümör hücre hatları24gibi daha az agresif meme tümör hücrelerinin tohumlanması, yüksek agresif MDA-MB-231 tümör hücreleri için gözlenenden benzer seviyelerde, in vitro ln bölümlerine güçlü bir yapışma yol açar (veriler gösterilmez). Ancak ortotopik MCF-7 ksenogreft tümörlerinin sentinel LN'lere ulaşamadığı, MDA-MB-231 tümörlerinin ise spontan olarak metastaz yaptığı bilinmektedir30. Açıkçası, MCF-7 hücreleri LN-metastaz oluşumu için ana darboğaz onlar ulaşmak ve LNs yapışmadan önce adımlar oluşur, MCF-7 hücrelerinin yetersizliği gibi verimli primer tümörlerden kaçmak. Yani, burada açıklanan analiz gücü LN-metastatik potansiyeli ile doğrudan korelasyon kurmak değil, daha gerçekçi bir ECM in vitro bir tümör hücresinin yapışkan özelliklerini ölçmek için basit bir yöntemdir. Dondurulmuş dokular kullanarak, kriyokes yapı ve kompozisyon açısından LNs doğal karmaşıklığı nı temsil, sentetik teknikler kullanarak yeniden oluşturmak mümkün olmaz, özellikle saflaştırılmış ECM proteinleri kullanarak.
Yöntemin ek sınırlamaları (1) LN'ler tarafından salgılanan faktörlerin kemotaktik potansiyelinin değerlendirilmesine izin vermez ve (2) LN bölümlerine hücreye özgü yapışmanın ECM proteinlerine, hücrelere veya LN bölümlerinde bulunan diğer yapılara tercihli bağlanmasonucu olup olmadığı konusunda bilgi vermez. Ancak, bu yaklaşımın ilgili olabileceğini ve belirli uygulamalar için ciddi olarak düşünülmesi gerektiğini, ancak bu makalenin kapsamı dışında olduğunu düşündük. Örneğin, yakın zamanda yapılan bir çalışmada, meme tümörlerinde LN metastazının mekanistik biyobelirteci olarak N-Myc aşağı akım regüle gen 4 (NDGR4) tespit ettik24. Mekanistik olarak, NDRG4 ekspresyonu olmayan tümör hücreleri meme tümör hücrelerinin önde gelen kenarında β1-integrin reseptörlerinin biraraya erdirilmesi lehine LNs kriyositelerine yapışmayı artırır. Ayrıca, saflaştırılmış ECM proteinleri ile kaplanmış yemekler gibi ek kontroller kullanarak, LN bölümlerine diferansiyel yapışma vitroneksin24ile seçici ilişki sonucu olduğunu ortaya çıkardı.
Son olarak, bu yöntemin LNs bölümleri ile sınırlı değildir ve dalak veya akciğer kriyokesitleri gibi farklı canlı organlara hücre yapışmasını değerlendirmek için kurulabilir dikkati çekiyor. Metastatik hücreler organotropizm ve in vitro farklı organların dondurulmuş bölümlerinde yapışkan gücü ölçümleri sergilemek, organa özgü kanser yayılmasını tahmin etmek için yararlı bir ortalama olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz teknik yardım için Dr Rosana De Lima Pagano ve Ana Carolina Pinheiro Campos teşekkür ederiz. Bu çalışma: FAPESP - São Paulo Araştırma Vakfı (2016/07463-4) ve Ludwig Kanser Araştırma Enstitüsü (LICR) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
