Summary
ここでは、接着性腫瘍細胞をリンパ節(LN)凍結片に定量化できる簡単で安価な方法について説明する。LN付着性腫瘍細胞は、光顕微鏡によって容易に同定され、蛍光ベースの方法で確認され、LNパレンチマに対する腫瘍細胞結合親和性を明らかにする接着指数を与える。
Abstract
腫瘍排出リンパ節(LN)は、腫瘍が産生する廃棄物のフィルターだけではありません。彼らは、異なるタイプの癌患者における播種腫瘍細胞の暫定的な居住地の最も一般的な地域サイトの1つである。これらのLN存在性腫瘍細胞の検出は、予後不良およびアジュバント療法の決定に関連する重要なバイオマーカーである。最近のマウスモデルは、LN-常駐腫瘍細胞が遠隔転移のための悪性細胞の実質的な供給源であり得る可能性を示している。LN parenchymaに対する腫瘍細胞の接着性を定量化する能力は、リンパ/転移に関連する遺伝子またはシグナル伝達経路の同定に焦点を当てた実験研究において重要なゲージである。LNは、断面の平面に応じて組織セクション内の様々な外観および組成物を有する複雑な3D構造であるため、それらの行列は完全に制御された方法で実験的にインビトロで複製することは困難である。ここでは、粘着腫瘍細胞をLN凍結片に定量化できる簡単で安価な方法について説明する。同じLNのシリアルセクションを使用して、我々は非放射性ラベルを使用し、直接LN表面積あたりの接着腫瘍細胞の数を数えるためにBrodtによって開発された古典的な方法を適応させます。LN付着性腫瘍細胞は、光顕微鏡によって容易に同定され、蛍光ベースの方法で確認され、LNパレンチマに対する細胞結合親和性を明らかにする接着性を示す接着指数を与え、インテグリンとそれらの相関性LN-リガンドへの結合における分子変化の示唆的証拠である。
Introduction
癌転移は、治療の失敗の主な理由であり、癌の支配的な生命を脅かす側面である。130年前に仮定したように、転移性拡散は、普及した腫瘍細胞(DTC、種子)のエリートが、彼らが一次部位を回避し、遠くの部位(「土壌」)で悪性成長を確立することを可能にする特定の生物学的能力を獲得したときに生じる(「土壌」)1。近年、前転移性ニッチの誘導(「種子」が繁栄するために必要な「肥沃な土壌」として概念化された)、DCによる原発性腫瘍の自己播種、二次臓器での「種子」休眠、転移2の並行進行モデルなど、「種子と土壌」関係に関するいくつかの新しい概念が出現している。
ほとんどの固形悪性腫瘍では、DTCは、臨床転移の有無にかかわらず、骨髄およびリンパ節(LN)のような多くの間葉器官に存在し、検出することができる。腫瘍流出のLNは、DTCの地域的な広がりの最初の場所であるため、LNステータスは重要な予後指標であり、しばしばアジュバント療法の決定に関連付けられている3。いくつかの腫瘍タイプに対して、LNの状態と悪い結果との間の相関は強く、頭頸部4、5、乳房6、前立腺7、肺8、胃9、大腸10、11および甲状腺癌12を含む。
LNは、網状細胞で覆われ、リンパ管で囲まれたリンパ系の小さな卵器官である。これらの器官は、免疫系13の機能のために絶対に必要である。LNは、免疫循環細胞の誘引プラットフォームとして機能し、リンパ球と抗原提示細胞を14個集める。しかし、LNはまた、循環腫瘍細胞を引き付ける。何十年もの間、Nは転移性腫瘍細胞の受動的な輸送ルートとして描かれました。しかし、最近の研究では、腫瘍細胞は、リンパ系内皮15によって分泌される化学療法(ケモカイン)および/またはハプトタクティク(細胞外マトリックス要素)キューによってLNに誘導される可能性も示されている。例として、腫瘍細胞におけるCCR7受容体の過剰発現は、腫瘍流出性LN16に対する転移性黒色腫細胞の誘導を容易にする。また、細胞外LNタンパク質は、循環腫瘍細胞17のリクルートおよび生存のための接着足場を提供する。実際、腫瘍流出LNは、特定のLN微小環境信号18によって増殖状態または休眠状態で維持することができるDTCの播種のための肥沃な土壌を提供する。LN に居住するこれらの DTC の最終的な運命は議論の余地があります。いくつかの作品は、これらの細胞が転移進行19の受動的な指標であることを示唆しているが、他の人は、彼らが抵抗性の創始者である可能性が高いことを提案する(自己播種一次部位によって)および/または転移のための細胞貯蔵所として作用する(第三次癌の成長のための「種子」を広げる)20、21。最近、前臨床モデルを用いて、これらのLN居住DCの一部が積極的に血管に侵入し、血液循環に入り、肺21を植民地化することが実証されている。
この研究では、RNにおけるがん細胞の存在が癌の攻撃性と侵襲性のマーカーであることを考慮して、Brodt22が開発した古典的な方法を最適化し、インビトロでのLNに対する腫瘍細胞接着を定量的に測定した。蛍光ベースのアッセイを使用することで、腫瘍細胞とLN凍結細胞間の接着変化の検出のための低コスト、迅速、高感度、環境に優しい(非放射性)プロトコルを開発することができました。この方法を例示するために異なるレベルのNDRG4遺伝子発現およびラットLN凍結切片を発現するMCF−7乳癌細胞を用いて、このプロトコルが乳癌患者24で観察されたインビトロにおけるLNsとLN転移に対する腫瘍細胞接着との良好な相関関係を認めた。
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Protocol
LNは、頸部脱臼によって犠牲にされた健康な成人ウィスターラットの新鮮な死骸から回収された。我々は、実験動物の痛みと苦痛に関するNIHガイドラインに従い、すべての手順は、シリオ・リバネス病院の研究教育研究所の倫理委員会と動物研究によって承認されました(CEUA P 2016-04)。
注:すべての新鮮な凍結組織はバイオ危険とみなされ、適切なバイオセーフティの注意を使用して処理する必要があります。
1. リンパ節切除術と凍結切除
- 室温で清潔な解剖板の上に後部の弁明に横たわっている成虫のWistarラット(180-220 g)の新鮮な死骸を置きます。
注:LNは、30分の安楽死後まで収集する必要があります。 - ラットの死骸に70%のイソプロピルアルコールを噴霧し、LN収穫のために滅菌器具を使用します。
- ピンセットの助けを借りて腹部の皮膚を持ち上げ、下層組織を損傷することなく内側切開で空洞を開き、腹部内臓を露出させる。腸を抜き出し、胸部と腹部のLNが見えるようになる(図1)。
- 後ろに横たわっている上腸間膜動脈を傷つけることを避けるために、鈍い先端はさみを使用して各ラットからLNを慎重に切除する。
注:切除されたリンパ節の位置によっては、腸間膜組織など、それに付着した他の組織を清掃する必要があります。 - 5 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩基(PBS)を含む15 mL円錐形チューブにLNを収穫する。
- 適切にラットの死体を破棄します。
- PBSから新鮮なLNを取り出し、乾燥したろ紙にノードを転がして乾燥させます。小さなペトリ皿に入れ、2分間冷凍組織標本(O.C.T.)の埋め込み溶液を加えます。
- LNを移動し、それをカバーするのに十分なO.C.Tで、クライオマールのベースに所望の位置にLNの顔を配ります。組織の近くで気泡を避けてください。断面面は、クライオマールの底です。
- すぐにドライアイスで発泡スチロールクーラーでクライオマールをスナップフリーズします。凍結していないO.C.T.のごく一部(〜20〜35s)がまだある場合は、サンプルをアルミニウム箔に移し、他のサンプルを凍結し続けながらドライアイスでクーラーに入れます。最後に、全てのサンプルを-80°Cで切り離すまで保管します。
- クリオスタットでLNを5-8 μmに調整するセクションの厚さを切り離します。
注:切り離す前に、-80°C冷凍庫から冷凍サンプルを取り出し、-22°Cのクライオスタットミクロトーム内の温度に約30分間平衡させます。
2. 蛍光色素による細胞標識
注:蛍光色素は細胞生物学で広く使用されています。我々は、長鎖diallcarbocyaニン標識(DiI(C18)、励起549nm、エミッション565nm)を使用することを好むのは、明るく安定しており、培養培地に直接添加することができるため、細胞生存率または細胞接着性に影響を与えない25、26。
- 理想的な条件下で成長する細胞を解離し(すなわち、完全培地中)、106細胞/mLの密度で無血清培地中で再懸濁する。
- 1 mLの細胞懸濁液(106細胞)をa15 mL円錐形チューブに加え、37°Cで10分間Dil(C 18)(2μg/mL)で標識します。
注:5分後、細胞沈沈沈や沈積細胞の沈留を避けるためにチューブを静かに攪拌します。密度が大きいほど、均一な染色にはより長いインキュベーション時間が必要です。細胞染色に最適なインキュベーション時間は、細胞株によって異なる。従来のFL2フローサイトメトリー検出チャネル(図2A)を用いてより良い定量化が可能である。 - 標識された懸濁管を300 x gで4分間遠心分離する。
- 上清を取り出し、10mLの無血清培地で2回洗います。赤いペレットとして細胞を回復します。.無血清培地中の106細胞/mLで、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて細胞を再懸濁した。
3. ポリL-リジン溶液またはBSAをシーディングコントロールとして事前コーティング(オプション)
注:PLLで事前にコーティングされた細胞培養皿を正のローディングコントロール表面として使用し、異なる実験グループの腫瘍細胞を同じ数で播種し、BSAコーティングされた表面を陰性対照として播種しました。
- 滅菌条件下では、PLLまたはBSAコーティングされた井戸を準備するために、300 μLのPLL(H2Oで0.1%w/v)またはBSA(H2Oで2.5%w/vで希釈)を24ウェルプレートに直接加え、4°Cで一晩インキュベートします。
- 吸引により溶液を除去し、滅菌PBSで表面を静かにすすい、細胞播種前の組織培養フードの室温でプレートをエアドライします。
注: PLL または BSA の最終体積は、異なるウェルプレートの面積に応じて調整する必要があります。
4. LNの凍結セクションまたはPLL/BSAで塗られた井戸の蛍光標識腫瘍細胞を播種する
注:実験コントロールとして、(1)PLLまたはBSAと(2)実験ごとに同じLNの(2)連続したセクションを事前にコーティングした細胞培養皿を使用しました(図2Dのこの詳細を参照)。後者は各LNセクションの細胞外マトリックス(ECM)組成の局所的な変動を最小限に抑え、細胞接着率を決定することができます。以下の腫瘍細胞接着アッセイに対しては、高品質および連続LN凍結片を選択する。
- PBSで2回クライオセクションを軽く洗い、室温でPBSで15分間水分補給します。
- 37 °Cで30分間2.5%BSAで凍結する非特異的接着をブロックします。免疫組織化学洗浄室と単層発祥地を使用して、洗浄およびインキュベーション中にO.C.T全体が除去されたことを確認します。
- 余分なBSAを乾いたペーパータオルに水切りし、綿棒でLNセクションの輪郭を乾かし、PAPペンを使用してセクションを囲みます。
- 腫瘍細胞接着アッセイの場合、100 μLの細胞懸濁液(ステップ2.4から)を24ウェルPLLコートプレート内の各囲まれたLNセクションまたはウェルに加え、従来の細胞培養インキュベーターで37°Cで1〜2時間加湿チャンバーラックに入れます。
注:セルサスペンションの最終容積は、異なる包囲されたLNの面積に応じて調整する必要があります。 - 非接着細胞をPBSで4回やさしく洗い流します。残りの付着蛍光細胞を、室温で15分間PBSで3.7%ホルムアルデヒドで固定します。
5. 接着剤指数の手動定量化
注:接着指数(すなわち、腫瘍細胞/LNmm2)は、10倍の目的を使用して達成され、手動で腫瘍細胞の数を数え、光顕微鏡で容易に同定され、蛍光顕微鏡(図2D)、いくつかの独立した分野のリンパ節領域(国立衛生研究所ImageJ/FIJIソフトウェアを使用して得られた)によって確認された。
- 10倍の目的を持つ蛍光顕微鏡を使用して、明るい蛍光フィールドと赤色蛍光場に対応する2つのチャネルで別々のTIFF画像を撮ります(図2D)。これらの画像に体系的に名前を付けて保存します。
- ImageJ/FIJIを起動し、画像を開き、スケールを設定します。キャリブレーションスケール(例えば、マイクロメトリックルーラー1mm)を使用する必要があります(図2C)。
- マイクロメートルルーラー(またはステージマイクロメータ)の写真を開き、直線ツールを選択し、既知の距離を定義する直線を描きます。
- [分析] メニューで、[スケールの設定] を選択します。[ピクセル単位の距離] は、手順 5.3 で描画された線の長さ (ピクセル単位) に基づいて塗りつぶされます。既知の距離は、実際の距離 (この場合はミリメートル) と長さの単位の長さの単位 (この場合はミリメートル) で埋められます。
- [グローバル] をクリックし (このキャリブレーションは、この ImageJ/FIJI セッションで開いたすべての画像に適用されます) をクリックし、[OK] をクリックします。
- リンパ節面積の定量化:杖ツールを選択し、ダブルクリックして、杖ツールの設定を開きます。モードを8 接続に設定します。写真内でクリックし、写真内のすべてのリンパ節を選択し、OKを押すまで許容範囲を設定します。面積を測定するには、[分析 |メジャー (CTRL + M)領域は、前に設定した単位で表されます。
- 腫瘍細胞定量:フィジーソフトウェアで光顕微鏡/蛍光画像を開きます。プラグインを選択 |分析 |セルカウンター |セル カウンタ。数値化する写真をクリックし、セルカウンターウィンドウで初期化ボタンを押します。カウンタータイプ(1-8)を選択し、写真のセルをクリックします。次の写真を初期化するには、セルカウンタウィンドウのリセットボタンを押し、新しい写真を開き、すべてのステップを繰り返します。
注:LN接着指数は、LN被覆領域(細胞/mm2)当たりの接着性腫瘍細胞数として表されます。
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Representative Results
このアッセイは、細胞表面24でβ1-インテグリンクラスタリングの陰性変調であるNDRG4遺伝子(NDRG4陽性およびNDRG4陰性細胞と呼ばれる)の異なるレベルを発現する赤蛍光MCF-7乳癌細胞のLN接着電位を評価し、ラットLN付着腫瘍細胞の画分を調べることによって説明する。このプロトコルの生画像の例を、図2に示します。図2Bに見られたように、付着細胞の形態は形状で丸められ、LN全体に異種分散されている。LN接着指数は、対応するNDRG4陽性MCF-7細胞(412±76セル/mm 2 LNの412±76セル/mm2、p = 0.03)と比較して、NDRG4陰性MCF-7細胞(LNの877±124細胞/mm2)で2倍高くなっています(図2D)。
図1:ラット腸間膜Lの分離のためのステップワイズ手順。(A)腹筋中性皮膚切開:安楽死ラットを経尿したラットを経時粘膜位置に置き、30〜50mmの中中線切開を腹部に覆い、腹部内臓(肝臓、小腸、盲腸および膀胱)を露出させた。(B) 小腸を腹腔から優しく引き抜き、内臓脂肪組織に埋め込まれたラット腸間膜LNを露出させた。(C) 摘出後の消化管の総解剖。(D) 接続脂肪組織から腸間膜リンパ節を解剖した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ラットリンパ節切片に対する腫瘍細胞接着の代表的な結果。(A) DiI(C18)標識(上象限)の強度を非ラベル化細胞(下象限)と比較した図示流サイトメトリー分析。(B)洗浄工程後のLN切片に付着した赤色標識MCF-7細胞の光(左)および蛍光(右)顕微鏡画像。(C)接着アッセイ後、カバースリップ上に付着した細胞は、較正スケールを用いて手動で定量し、リンパ節面積と蛍光顕微鏡を直接細胞計数に推定する。(D) MCF-7乳房腫瘍細胞におけるNDRG4ノックダウンはリンパ節接着を増加させる。赤蛍光MCF-7細胞(NDRG4陽性またはNDRG4陰性DiIC18標識細胞)の代表的な画像は、5μmのラットリンパ節切片で播種後30分。LN接着指数は、LN被覆面積(細胞/mm2)当たりの接着性腫瘍細胞数として表されます。スケールバー = 200 μm. *p < 0.05.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
がん細胞のリンパ系普及には、さまざまな複雑な細胞駆動の事象が必要です。原発性腫瘍からの細胞剥離と細胞外マトリックス(ECM)アーキテクチャの再構築を開始し、センチネルLNへの途中で持続性走化と積極的なリンパ球を介した活発な移動によって支えられている。がん細胞が付着して、NNで生き残った場合、他の二次臓器に容易に広がることができます。ここでは、腫瘍細胞と凍結したLNとの特異的接着相互作用を迅速かつ低コストで機能解析するための容易な方法を説明する。
構造的には、LNは、細胞移動の経路として、およびLN parenchyma27内の可溶性因子(抗原および/またはケモカイン)の迅速な送達のための導管として機能するECM繊維の密かつ広範なネットワークの離散的なスポンジ状の塊である。アッセイの凍結されたRNの保存された網状繊維は、ハプトタクティク信号を支持し、インビトロで腫瘍細胞接着のための足場を提供する。これらの繊維は、主にコラーゲンIおよびIIIなどの構造タンパク質から構成され、フィブロネクチン、テナシン、ラミニン、ビトロネクチンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン28、29などの二次ECM要素によって構成される。細胞接着に続いて、これらのLN由来ECM因子のほとんどは、インテグリン媒介シグナルを介して細胞生存(増殖状態または休眠状態)または細胞死(アノイキス)を決定する分子手掛かりを提供する。
ここでは、異種ラットのLNとヒト乳房腫瘍細胞株を用いたアッセイを例示する。また、他の LN ソースを使用することもできます。ラット、マウスまたはヒトのLNの組成物は、天然哺乳動物ECMの一部である同じ構造および機能的タンパク質を含み、細胞接着に必要な類似の結合部位を保持する全て23。重要な点は、実験ごとに同じLNの連続スライスを使用して、各LNセクションのECM組成の地域的変動を最小限に抑え、細胞接着率を決定する可能性がある点です。
アッセイの欠点は、リンパの普及の最初のステップを再現せず、腫瘍細胞の接着力をLNに反映することだけである。例えば、MCF-7(図2)またはT47D腫瘍細胞株24のようなLN切片に対するあまり積極的でない乳房腫瘍細胞の播種は、インビトロでのLN切片に対する強い接着をもたらし、高いアグレッシブなMDA-MB-231腫瘍細胞について観察されたレベルと同様のレベルで(データは示されていない)。しかし、正所性MCF-7異種移植片腫瘍がセンチネルLNに到達できず、MDA-MB-231腫瘍が30に自発的に転移することはよく知られている。明らかに、MCF-7細胞LN-転移形成の主なボトルネックは、MCF-7細胞が原発腫瘍から効率的に脱出できないように、LNに到達して付着する前のステップで起こる。従って、ここで説明するアッセイの強度は、LN転移電位との直接的な相関を確立するものではなく、より現実的なECMインビトロにおける腫瘍細胞の接着特性を定量化する簡単な方法である。凍結組織を使用することにより、凍結セクションは、構造および組成の観点から、RNの自然な複雑さを表し、合成技術、特に精製されたECMタンパク質を使用して再現することは不可能であろう。
この方法のさらなる制限は、(1)LNによって分泌される因子の走化電位の評価を許さないこと、および(2)LNセクションに対する細胞特異的接着性が、ECMタンパク質、細胞またはLNセクションに存在する他の構造への優先的な結合の結果であるかどうかについては知らせない。しかし、このアプローチは関連性があり、特定のアプリケーションに対して真剣に検討する必要があると感じましたが、この特定の原稿の範囲を超えています。例えば、最近の研究では、乳房腫瘍24におけるLN転移の機械系バイオマーカーとしてN-Myc下流制御遺伝子4(NDGR4)を同定した。機械学的には、NDRG4発現を欠く腫瘍細胞は、乳房腫瘍細胞の先端におけるβ1-インテグリン受容体の集合体を支持することによって、RNの凍結部への接着性を高める。さらに、精製されたECMタンパク質をコーティングした料理のような追加のコントロールを用いて、LN切片に対する差動接着がビトロネクチン24との選択的な関連の結果であることを明らかにした。
最後に、この方法は、LNsセクションに限定されず、脾臓や肺の凍結部のような異なる生きている器官への細胞接着を評価するために設定することができることは注目に値する。転移性細胞は、体外で異なる器官の凍結切片における有機栄養および接着強度の測定を示し、臓器特異的な癌の普及を予測するのに有用な意味となり得る。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
ロサナ・デ・リマ・パガーノ博士とアナ・カロライナ・ピニェイロ・カンポスの技術支援に感謝します。この研究は、FAPESP - サンパウロ研究財団(2016/07463-4)とルートヴィヒがん研究所(LICR)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
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