Summary
Здесь мы описываем простой и недорогой метод, который позволяет количественно количественно клеевых опухолевых клеток криосекций лимфатических узлов (LN). LN-приверженных опухолевых клеток легко идентифицируются с помощью световой микроскопии и подтверждены методом, основанным на флуоресценции, давая индекс адгезии, который показывает сродство опухолевых клеток к LN parenchyma.
Abstract
Опухолевые лимфатические узлы (ЛН) – это не просто фильтры опухолевых отходов. Они являются одним из наиболее распространенных региональных сайтов временного проживания рассеянных опухолевых клеток у пациентов с различными видами рака. Обнаружение этих LN-проживающих опухолевых клеток является важным биомаркером, связанным с плохим прогнозом и адъювантной терапии решений. Последние модели мыши показали, что LN-проживающих опухолевых клеток может быть существенным источником злокачественных клеток для далеких метастазах. Способность к количественной оценке клея опухолевых клеток к LN parenchyma является критическим датчиком в экспериментальных исследованиях, который фокусируется на выявлении генов или сигнальных путей, имеющих отношение к лимфатическому/метастатическому распространению. Поскольку LNs являются сложными 3D-структурами с различными проявлениями и композициями в секциях тканей в зависимости от плоскости секции, их матрицы трудно воспроизвести экспериментально in vitro полностью контролируемым способом. Здесь мы описываем простой и недорогой метод, который позволяет количественно йоховых опухолевых клеток в LN криосекций. Используя последовательные разделы того же LN, мы адаптируем классический метод, разработанный Бродтом, для использования нерадиоактивных меток и непосредственно подсчитываем количество примыкающих опухолевых клеток на поверхность LN. LN-приверженных опухолевых клеток легко идентифицируются с помощью световой микроскопии и подтверждаются методом, основанным на флуоресценции, давая индекс адгезии, который показывает клеточной связывания с LN parenchyma, что является наводящим свидетельством молекулярных изменений в сродстве связывания интехрин с их коррелятl LN-лигандами.
Introduction
Метастазы рака является основной причиной неудачи лечения и доминирующей опасной для жизни аспект рака. Как постулируется 130 лет назад, метастатическое распространение результатов, когда элита рассеянных опухолевых клеток (DTCs, "семена") приобретают конкретные биологические способности, которые позволяют им уклоняться от первичных участков и установить злокачественный рост в отдаленных местах ("почва")1. В последнее время появилось несколько новых концепций, касающихся отношений "семени и почвы", таких как индукция преметастатических ниш (концептуальная как "плодородная почва", необходимая для процветания "семеней", самопосев основе первичных опухолей с помощью ДТК, "семя" в вторичных органах и параллельная модель прогрессирования метастаза2.
Для большинства твердых злокачественных новообразований, DTCs может проживать и быть обнаружены во многих мезенхимальных органов, таких как костный мозг и лимфатические узлы (ЛН) у пациентов с или без доказательств клинических метастазов. Потому что опухолевые LNs являются первым местом регионального распространения DTCs, Статус LN является важным прогностичным показателем и часто ассоциируется с адъювантной терапии решений3. Для некоторых типов опухоли, корреляция между статусом LN и худшие исходы сильна, в том числе головы и шеи4,5, грудь6, простата7, легких8, желудочный9, колоректальный10,11 и рака щитовидной железы12.
LNs являются мелкими яйцеклетки органов лимфатической системы, которые покрыты ретикулярных клеток и заключены с лимфатических сосудов. Эти органы абсолютно необходимы для функционирования иммунной системы13. LNs выступать в качестве привлекательных платформ для иммунных циркулирующих клеток, в результате чего лимфоциты и антиген-представления клеток вместе14. Тем не менее, LNs также привлекают циркулирующие опухолевые клетки. На протяжении десятилетий, LNs были изображены как пассивные маршруты транспортировки для метастатических опухолевых клеток. Тем не менее, недавние исследования показали, что опухолевые клетки могут также направляться к LNs хемотаксией (хемокины) и/или гатотактическими (внеклеточными матричными элементами) сигналами, выделяемыми лимфатическим эндотелием15. В качестве примеров, переэкспрессия рецептора CCR7 в опухолевых клетках облегчает руководство метастатическими клетками меланомы к опухолево-дренажным LNs16. Кроме того, внеклеточные белки LN обеспечивают клеевую эшафот для набора и выживания циркулирующих опухолевых клеток17. В самом деле, опухолевые LNs обеспечивают плодородную почву для посева DTCs, которые могут быть сохранены в пролиферирующих или спящих состояний по конкретным LN микроэкологических сигналов18. Окончательная судьба этих LN-проживающих DTCs является спорным; некоторые работы предполагают, что эти клетки являются пассивными показателями метастатического прогрессирования19, в то время как другие предполагают, что они, скорее всего, основатели сопротивления (путем самостоятельного посева первичных сайтов) и / или выступать в качестве клеточных резервуаров для метастазах (распространение "семена" для роста третичного рака)20,21. В последнее время, используя доклинические модели, было продемонстрировано, что часть этих LN-проживающих DTCs активно вторглись кровеносные сосуды, вошел в кровообращение и колонизировал легкие21.
Учитывая, что наличие раковых клеток в LNs является маркером для агрессивности рака и инвазивности, в этом исследовании, мы оптимизировали классический метод, разработанный Brodt22 для количественного измерения опухолевых клеток адгезии для LNs in vitro. Использование флуоресценции на основе асссе позволило нам разработать недорогой, быстрый, чувствительный и экологически чистый (нерадиоактивный) протокол для обнаружения клеевых изменений между опухолевыми клетками и LN криосекций. Использование MCF-7 раковых клеток молочной железы, выражающих различные уровни экспрессии гена NDRG4 и крысl LN замороженных разделов для примера метода, мы показали, что этот протокол позволил хорошую корреляцию между опухолевой клетки адгезии к LNs in vitro и LN метастазировать наблюдается у больных раком молочной железы24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LNs были извлечены из свежих туш здоровых взрослых крыс Wistar жертвуя шейки матки дислокации. Мы следовали Рекомендациям NIH по боли и бедствию в лабораторных животных, и все процедуры были одобрены Комитетом по этике и исследованиям животных Научно-образовательного института больницы Серио-Либанес (CEUA P 2016-04).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все свежие замороженные ткани считаются биоопасными и должны быть обработаны с использованием соответствующих мер предосторожности биобезопасности.
1. Лимфаденэктомия и криосекция
- Поместите свежие туши взрослых крыс Wistar (180-220 г), лежащих в подошве на чистую доску для вскрытия при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: LNs должны быть собраны до 30 мин после эвтаназии. - Спрей тушу крыс с 70% изопропиловый спирт и использовать стерилизованные инструменты для сбора LN.
- Поднимите брюшной кожи с помощью пинцета и открыть полость с медиальным разрезом, не повреждая основные ткани, подвергая брюшной внутренности. Вытяните кишечник и грудной клетки и брюшной половины становятся видимыми(рисунок 1).
- Тщательно акцизных LNs от каждой крысы с использованием тупых ножницами кончик, чтобы избежать ранения верхней мезентерической артерии, лежащей позади.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от расположения резеченного лимфатического узла, необходимо очистить прилагаемые к нему другие ткани, такие как мезентерическая ткань. - Урожай LNs в 15 мл конических труб, содержащих 5 мл стерильных фосфатов буферного солей (PBS).
- Правильно отбросить туши крыс.
- Удалить свежие LNs из PBS, свернуть и высушить узел на сухой фильтруебумаги. Поместите его в небольшое блюдо Петри и добавьте встраивающий раствор для замороженных образцов тканей (O.C.T.) в течение 2 мин.
- Передача и ориентация LN лицом вниз в нужном положении в базе криомолд, с достаточно O.C.T, чтобы покрыть его. Избегайте пузырьков вблизи ткани. Поверхность секции – дно криомолда.
- Немедленно заморозьте криомольд в холодильнике пенополистирола с сухим льдом. Когда есть еще небольшая часть размороженной O.C.T. (20-35 с), перенесите образец в алюминиевую фольгу и поместите его в кулер с сухим льдом, продолжая замораживать другие образцы. В конце храните все образцы при -80 градусов по Цельсию до раздела.
- Раздел LN с криостатом регулирующей толщины секции до 5-8 мкм. Передача крисекций на микроскоп слайды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед секцией, удалите замороженные образцы из морозильной камеры -80 градусов и дайте им уравновесить температуру в криостатной камере микротомов при температуре -22 градусов по Цельсию в течение примерно 30 мин. LN-содержащие слайды могут храниться при -80 градусов по Цельсию в течение одного месяца.
2. Клеточная маркировка с флуоресцентными красителями
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные красители широко используются в клеточной биологии. Мы предпочитаем использовать длинноцепочечную маркировку диалилкарбоцианов (DiI (C18),возбуждение 549 нм, эмиссии 565 нм), потому что они яркие, стабильные и могут быть добавлены непосредственно в культурные носители, не влияющие на жизнеспособность клеток или клеевые клеитные свойства25,26.
- Диссоциативные клетки, растущие в идеальных условиях (т.е. в полной среде) и повторно прикрепляемые в среде, свободной от сыворотки, при плотности 106 клеток/мл.
- Добавьте 1 мл клеточной суспензии (106 ячеек) в коническую трубку 15 мл и наклейте этикетку дил (C18) (2 мкг/мл) в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 5 мин, осторожно агитировать трубки, чтобы избежать отложения клеток и недостаточное замедленное количество клеток. Более крупные плотности требуют более длительного времени инкубации для равномерного окрашивания. Оптимальное время инкубации для окрашивания клеток зависит от клеточной линии. Это может быть лучше количественно с помощью обычного канала обнаружения цитометрии потока FL2(Рисунок 2A). - Centrifuge помечены подвесной трубки на 300 х г в течение 4 мин.
- Удалить супернатант и вымыть дважды в 10 мл сыворотки свободной среде. Восстановить клетки, как красные гранулы. Resuspend клетки на 106 клеток/мл в сыворотке свободной среде с 0,1% бычьего сыворотки альбумина (BSA).
3. Предварительное покрытие Блюда с поли-L-лизин решение или BSA как посевной контроль (необязательно)
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали блюда культуры клеток, предварительно покрытые PLL в качестве положительных поверхностей контроля нагрузки, чтобы гарантировать, что различные экспериментальные группы опухолевых клеток были посеяны в том же количестве, а также BSA покрытием поверхностей в качестве отрицательного контроля.
- В стерильных условиях, чтобы подготовить PLL- или BSA покрытием скважин, добавить 300 л PLL (0,1% Ж / V в H2O) или BSA (разбавленный на 2,5% ж / вар в H2O) непосредственно к 24-хорошо пластины и инкубировать ночь на 4 градуса по Цельсию.
- Удалить раствор путем аспирации, аккуратно промыть поверхность стерильным PBS и высушить пластину при комнатной температуре в тканевой культуры капот перед посевом клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные тома PLL или BSA должны быть скорректированы в зависимости от области различных пластин скважины.
4. Посев флуоресцентные опухолевые клетки на LN Криосекции или PLL / BSA покрытием Уэллс
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве экспериментального контроля, мы использовали (1) клеточной культуры блюда предварительно с PLL или BSA и (2) последовательных разделов того же LN за эксперимент (см. эту деталь на рисунке 2D), где последний будет минимизировать региональные изменения в внеклеточной матрицы (ECM) состав каждого раздела LN, который, в свою очередь, может диктовать скорость сцепения клеток. Для следующего контроля опухолевых клеток, выберите высокое качество и последовательные криосекции LN.
- Аккуратно мыть криосекции дважды с PBS и регидратируетс PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Блок неспецифической прилипки к криосекциям с 2,5% BSA в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия. Используйте иммуногистохимии мыть камеры и колыбели ламина, чтобы убедиться, что весь O.C.T был удален во время стирки и инкубаций.
- Слейте избыток BSA на сухое бумажное полотенце, высушите контуры секций LN ватным тампоном и окружите секции с помощью пера PAP.
- Для оценки спайков опухолевых клеток добавьте 100 кЛ клеточной подвески (от шага 2.4) к каждому окруженному разделу LN или хорошо в 24-хорошей пластине с покрытием PLL и поместите его в увлажненную камеру стойки для 1-2 ч при 37 градусах по Цельсию в обычном инкубаторе культуры клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем суспензии клеток должен быть скорректирован в зависимости от области различных окруженных LNs. - Аккуратно смойте неадекторные клетки четыре раза с помощью PBS. Исправьте оставшиеся флуоресцентные клетки с 3,7% формальдегида в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
5. Ручная количественная оценка индекса клея
ПРИМЕЧАНИЕ: Клейиндекс (т.е. опухолевые клетки/ LN мм2) был достигнут с помощью 10X цели и вручную подсчета числа опухолевых клеток, легко определить светмикроскопии и подтверждены флуоресценционной микроскопии (Рисунок 2D), на лимфатические области узла нескольких независимых полей (получено с помощью Национального института здравоохранения ImageJ / программное обеспечение).
- Используйте флуоресцентный микроскоп с целью 10-кратный способ, чтобы взять отдельные изображения TIFF в двух каналах, соответствующих ярким и красно-флуоресцентным полям(рисунок 2D). Назовите и сохраните эти изображения систематически.
- Запустите ImageJ/FIJI, откройте изображения и установите шкалу. Необходимо использовать калибровозаваемую шкалу (например, микрометрическую линейку 1 мм)(рисунок 2С).
- Откройте фотографию микрометрической линейки (или микрометра сцены), выберите инструмент "Прямая линия" и нарисуйте прямую линию, определяющую известное расстояние.
- В меню «Анализ» выберите шкалу набора. Расстояние в пикселях будет заполнено в зависимости от длины (в пикселях) линии, нарисованной в шаге 5.3. Известное расстояние будет заполнено реальным расстоянием (в данном случае, в миллиметрах) и единицей длины в блоке длинного поля (в данном случае в миллиметрах).
- Нажмите на Global (эта калибровка относится ко всем изображениям, открытым в этой сессии ImageJ/FIJI) и нажмите OK.
- Количественная оценка области лимфатических узлов: Выберите инструмент Wand и путем двойного нажатия, откройте настройки инструмента Wand. Установите режим до 8-подключаемых. Нажмите на фото и установите допуск до тех пор, пока не выберите все лимфатические узлы на фотографии и нажмите OK. Для измерения площади, открытый анализ Мера (CTRL и M). Область выражается в единицах, установленных ранее.
- Количественная оценка опухолевых клеток: Откройте световые микроскопии/флуоресценции в программном обеспечении FIJI. Выберите плагины Анализ (ru) Счетчик ячеек Счетчик ячейки. Нажмите на фотографию, чтобы быть количественно и нажмите кнопку Инициализация в окне счетчика ячейки. Выберите тип счетчика (1-8) и нажмите на ячейки на фотографии. Чтобы инициализировать следующую фотографию, нажмите кнопку Сбросить в окне счетчика ячейки, откройте новую фотографию и повторите все шаги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс слипа LN выражается как количество опухолевых клеток приверженцев на площадь LN (клетки/мм2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы иллюстрируем анализ, оценивая LN клей потенциал красных флуоресцентных MCF-7 раковых клеток молочной железы, выражающих различные уровни гена NDRG4 (именуемые NDRG4-положительных и NDRG4-отрицательных клеток), отрицательный модулятор бета1-инегрин кластеризации на поверхности клетки24, путем изучения фракций крысы LN-придерживающихся клеток опухоли. Примеры необработанных изображений этого протокола показаны на рисунке 2. Как видно на рисунке 2B, морфология клеток адептов округляется в форме, и они неоднородно рассеиваются по всему LN. Индекс клея LN в 2 раза выше в клетках NDRG4-отрицательных MCF-7 (877 и 124 ячейки/мм2 LN) по сравнению с соответствующими NDRG4-положительными клетками MCF-7 (412 и 76 ячеек/мм2 LN, р 0,03)(рисунок 2D).
Рисунок 1: Пошаговая процедура для изоляции крыс ывентерных LNs. (A) Ventral средней линии разреза кожи: усыпленные крысы были помещены в положение посуды recumbency и 30-50 мм средней линии разрез был сделан в коже над середине живота, подвергая брюшной внутренности (печень, тонкий кишечник, cecum и мочевого пузыря). (B) Тонкий кишечник был аккуратно вытащил из брюшной полости подвергая крысы брюшной lNs встроенных в висцеральной жировой ткани. (C) Грубая анатомия расчлененных желудочно-кишечного тракта после удаления. (D) Расчлененные мезентерические лимфатические узлы из соединительной жировой ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель результаты опухолевых клеток адгезии крысиных лимфатических узлов разделов. (A) Иллюстративный анализ цитометрии потока, показывающий интенсивность маркировки DiI (C18)по сравнению с немаркированными клетками (нижний квадрант). (B) Легкие (слева) и флуоресцентные (справа) микроскопические изображения красно-маркированных клеток MCF-7, придерживающихся разделов LN после стирки. (C) После ассезии анализ, прикрепленные клетки на крышках поддаются количественной оценке с помощью калибровочной шкалы для оценки области лимфатических узлов и флуоресцентной микроскопии для прямого подсчета клеток. (D) NDRG4 нокдаун в MCF-7 опухолевых клеток молочной железы увеличивает сливовые узлы. Репрезентативные изображения красных флуоресцентных клеток MCF-7 (NDRG4-положительные или NDRG4-отрицательные DiIC18-маркированные клетки) 30 мин после посева на 5 мкм крысиных лимфатических узлов разделов. Индекс клея LN выражается как количество опухолевых клеток приверженцев на площадь LN (клетки/мм2). Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Распространение лимфатических систем раковых клеток требует различных сложных клеточных событий. Они инициируются с отслоение клеток от первичной опухоли и ремоделирования внеклеточной матрицы (ECM) архитектуры, и поддерживаются стойкими хемотаксиса и активной миграции через афферентных лимфатических на пути к дозорной LNs. Если раковые клетки придерживаются и выжить в LNs, они могут легко распространиться на другие вторичные органы. Здесь мы описываем простой метод быстрого и недорогого функционального анализа специфических клеевых взаимодействий между опухолевыми клетками и замороженными LNs.
Структурно, LNs дискретные губки, как массы плотных и обширных сетей ECM волокон, часто называют "ретикулярных волокон", которые выступают в качестве путей для миграции клеток и в качестве каналов для быстрой доставки растворимых факторов (антигенов и / или хемокинов) в LN parenchyma27. Сохраненные ретикулярные волокна замороженных LNs анализа поддерживают гактотактические сигналы и обеспечивают леса для стыковки опухолевых клеток in vitro. Эти волокна состоят в основном из структурных белков, таких как коллагены I и III, а также вторичные элементы ECM, такие как фибронектин, тенеацин, ламинин, витронектин и гепаран сульфат протеогликанов28,29. После клеточной адгезии, большинство из этих LN-производных eCM факторов обеспечивают молекулярные сигналы, которые определяют выживание клеток (пролиферативной или спящих состояний) или клеточной смерти (anoikis) через комплекс-опосредованных сигналов.
Здесь мы демонстрируем асссс с помощью ксеногенных крыс LNs и линии клеток опухоли молочной железы человека. Кроме того, могут использоваться другие источники LN. Состав крыс, мышей или человека LNs включает в себя те же структурные и функциональные белки, которые являются частью родной млекопитающих ECM, все сохранения аналогичных связывающих сайтов, которые необходимы для клеточной адгезии23. Важно отметить, что единственным важным шагом является использование последовательных ломтиков одного и того же LN в эксперименте, чтобы свести к минимуму региональные изменения в составе ECM каждого раздела LN, что, в свою очередь, может диктовать скорость сливк ячейки.
Недостатком асссея является то, что он не резюмирует первые шаги лимфатического распространения, только отражая клейкую силу опухолевых клеток к LNs. Например, посев менее агрессивных опухолевых клеток молочной железы на участках LN, как MCF-7(Рисунок 2) или T47D опухолевых клеток линий24, привести к сильной приливки к LN разделов в пробирке, на аналогичных уровнях, чем наблюдается для высоких агрессивных MDA-MB-231 опухолевых клеток (данные не показаны). Тем не менее, хорошо известно, что ортотопические опухоли MCF-7 ксенотрансплантата не могут достичь дозорных LNs, в то время как MDA-MB-231 опухоли спонтанно метастазировать к ним30. Очевидно, что основным узким местом для MCF-7 клеток LN-метастазирование формирования происходят в шагах, прежде чем они достигают и придерживаться LNs, как неспособность MCF-7 клеток эффективно бежать из первичных опухолей. Таким образом, сила анализа, описанного здесь, не устанавливает прямую корреляцию с LN-метастатическим потенциалом, а является простым методом количественной оценки клеевых свойств опухолевой клетки в более реалистичной ECM in vitro. Используя замороженные ткани, криосекции представляют естественную сложность LNs с точки зрения структуры и состава, которые было бы невозможно воссоздать с помощью синтетических методов, особенно тех, которые используют очищенные белки ECM.
Дополнительные ограничения метода (1) он не позволяет оценки хемотаксического потенциала факторов, выделяемых LNs и что (2) он не информирует о том, клеточной сливки к lN разделы является результатом преференциальной связывания с eCM белков, клеток или любых других структур, присутствующих в разделах LN. Однако мы сочли, что этот подход может быть актуальным и должен быть серьезно рассмотрен для конкретных применений, но выходит за рамки данной конкретной рукописи. Например, в недавнем исследовании, мы определили N-Myc вниз по течению регулируется ген 4 (NDGR4) как механистический биомаркер lN метастазов в опухолях молочной железы24. Механически опухолевые клетки, не имеющие экспрессии NDRG4, увеличивают адгезию криосекций ЛН, отдав предпочтение сборке рецепторов 1-итегрина на переднем крае опухолевых клеток молочной железы. Кроме того, используя дополнительные элементы управления, такие как блюда, покрытые очищенными белками ECM, мы обнаружили, что дифференциальная сливка к секциям LN является результатом селективной ассоциации с витрунектином24.
Наконец, стоит отметить, что этот метод не ограничивается lNs разделов и может быть создан для оценки клеточной сливки к различным живым органам, как криосекции селезенки или легких. Метастатические клетки демонстрируют органотропизм и измерения силы клея в замороженных участках различных органов in vitro, может быть полезным средним для прогнозирования органного распространения рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Розану Де Лима Пагано и Ана Каролина Пинейро Кампос за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами от: FAPESP - Сан-Паулу исследовательский фонд (2016/07463-4) и Людвиг Институт исследований рака (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
