Summary
Aquí, describimos un método simple y barato que permite la cuantificación de células tumorales adhesivas a criosecciones de ganglios linfáticos (LN). Las células tumorales adsemiantes con LN se identifican fácilmente mediante microscopía de luz y se confirman mediante un método basado en fluorescencia, lo que proporciona un índice de adhesión que revela la afinidad de unión celular tumoral al parénquima LN.
Abstract
Los ganglios linfáticos que drenan tumores (LN) no son meros filtros de desechos producidos por tumores. Son uno de los sitios regionales más comunes de residencia provisional de células tumorales diseminadas en pacientes con diferentes tipos de cáncer. La detección de estas células tumorales que residen LN es un biomarcador importante asociado con malas decisiones de pronóstico y terapia adyuvante. Los modelos de ratón recientes han indicado que las células tumorales que residen LN podrían ser una fuente sustancial de células malignas para metástasis distantes. La capacidad de cuantificar la adhesividad de las células tumorales al parénquima LN es un indicador crítico en la investigación experimental que se centra en la identificación de genes o vías de señalización relevantes para la diseminación linfática/metastásica. Debido a que los LN son estructuras 3D complejas con una variedad de apariencias y composiciones en secciones de tejido dependiendo del plano de sección, sus matrices son difíciles de replicar experimentalmente in vitro de una manera totalmente controlada. Aquí, describimos un método simple y barato que permite la cuantificación de células tumorales adhesivas a criosecciones LN. Utilizando secciones seriales del mismo LN, adaptamos el método clásico desarrollado por Brodt para utilizar etiquetas no radioactivas y contar directamente el número de células tumorales adherentes por superficie LN. Las células tumorales lN-adherentes son fácilmente identificadas por microscopía de luz y confirmadas por un método basado en fluorescencia, dando un índice de adhesión que revela la afinidad de unión celular al parénquima LN, lo que es evidencia sugestiva de alteraciones moleculares en la unión de afinidad de integrinas a sus lN-ligands correlacionados.
Introduction
La metástasis del cáncer es la razón principal del fracaso del tratamiento y el aspecto dominante que pone en riesgo la vida del cáncer. Como se postuló hace 130 años, la propagación metastásica se produce cuando una élite de células tumorales diseminadas (DTCs, las "semillas") adquieren habilidades biológicas específicas que les permiten evadir los sitios primarios y establecer un crecimiento maligno en sitios distantes (el "suelo")1. Recientemente, han surgido varios conceptos novedosos sobre las relaciones de "semillas y suelos", como la inducción de nichos premetastáticos (conceptualizados como un "suelo fértil" necesario para que prosperen las "semillas"), la autosiembra de tumores primarios por los TDC, la latencia "semilla" en los órganos secundarios y el modelo de progresión paralela de la metástasis2.
Para la mayoría de las neoplasias malignas sólidas, los Centros de Derechos DeN pueden residir y detectarse en muchos órganos mesenquimales, como la médula ósea y los ganglios linfáticos (LN) en pacientes con o sin evidencia de metástasis clínica. Debido a que los LN que drenan tumores son la primera ubicación de la propagación regional de los CENTROS de Libre Desarrollo, el estado del LN es un indicador de pronóstico importante y a menudo se asocia con las decisiones de terapia adyuvante3. Para algunos tipos de tumores, la correlación entre el estado de LN y los peores resultados es fuerte, incluyendo la cabeza y el cuello4,5, mama6, próstata7, pulmón8, gástrico9, colorrectal10,11 y cánceres de tiroides12.
Los LN son pequeños órganos ovoides del sistema linfático, que están cubiertos con células reticulares y encerrados con vasos linfáticos. Estos órganos son absolutamente necesarios para el funcionamiento del sistema inmunológico13. Los LN actúan como plataformas de atracción para las células circulantes inmunes, reuniendo los linfocitos y las células que presentan antígenos14. Sin embargo, los LN también atraen las células tumorales circulantes. Durante décadas, los LN fueron fotografiados como rutas pasivas de transporte para las células tumorales metastásicas. Sin embargo, estudios recientes han indicado que las células tumorales también pueden ser guiadas hacia LN por señales quimiotácticas (quimioquinas) y/o hátotácticas (elementos de matriz extracelular) secretadas por el endotelio linfático15. Como ejemplos, la sobreexpresión del receptor CCR7 en las células tumorales facilita la orientación de las células de melanoma metastásico hacia los LNs16que drenan tumores. Además, las proteínas LN extracelulares proporcionan un andamio adhesivo para el reclutamiento y la supervivencia de las células tumorales circulantes17. De hecho, los LN de drenaje de tumores proporcionan suelo fértil para la sembración de DTCs, que puede mantenerse en estados proliferativos o latentes mediante señales microambientales LN específicas18. El destino final de estos TUC que residen en el LN es controvertido; algunas obras sugieren que estas células son indicadores pasivos de progresión metastásica19, mientras que otros proponen que son más probables fundadores de la resistencia (por sitios primarios auto-siembra) y / o actúan como reservorios celulares para metástasis (difundir "semillas" para el crecimiento terciario del cáncer)20,21. Recientemente, utilizando modelos preclínicos, se ha demostrado que una fracción de estos CNL que residen invadieron activamente los vasos sanguíneos, entraron en la circulación sanguínea y colonizaron los pulmones21.
Teniendo en cuenta que la presencia de células cancerosas en los LNs es un marcador de agresividad e invasividad del cáncer, en este estudio, optimizamos un método clásico desarrollado por Brodt22 para medir cuantitativamente la adhesión de células tumorales a Los LN in vitro. El uso de un ensayo basado en la fluorescencia nos permitió desarrollar un protocolo de bajo costo, rápido, sensible y respetuoso con el medio ambiente (no radioactivo) para la detección de alteraciones adhesivas entre células tumorales y criosecciones LN. Utilizando las células de cáncer de mama MCF-7 que expresan diferentes niveles de expresión génica NDRG4 y secciones congeladas de LN de rata para ejemplificar el método, mostramos que este protocolo permitía una buena correlación entre la adhesión de las células tumorales a los LN in vitro y la metástasis LN observada en pacientes con cáncer de mama24.
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Protocol
Los LN fueron recuperados de cadáveres frescos de ratas Wistar adultas sanas sacrificadas por luxación cervical. Seguimos las Directrices de los NIH para el dolor y la angustia en animales de laboratorio y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética y la investigación animal del Instituto de Investigación y Educación del hospital Sírio-Libanés (CEUA P 2016-04).
NOTA: Todos los tejidos congelados frescos se consideran biopeligrosos y deben manipularse con las precauciones de bioseguridad adecuadas.
1. Lymphadenectomía y Criosección
- Coloque cadáveres frescos de ratas Wistar adultas (180-220 g) recostadas en la recumbencia dorsal sobre una placa de disección limpia a temperatura ambiente.
NOTA: Los LN deben recogerse hasta 30 minutos después de la eutanasia. - Rocíe la carcasa de la rata con un 70% de alcohol isopropílico y utilice instrumentos esterilizados para la cosecha de LN.
- Levante la piel abdominal con la ayuda de pinzas y abra una cavidad con una incisión medial sin dañar el tejido subyacente, exponiendo las vísceras abdominales. Extraiga el intestino y los LN torácicos y abdominales se vuelven visibles(Figura 1).
- Ensusia cuidadosamente los LN de cada rata con el uso de tijeras de punta contundente para evitar lesionar la arteria mesentérica superior que se encuentra detrás.
NOTA: Dependiendo de la ubicación del ganglio linfático resecado, es necesario limpiar otros tejidos adheridos a él, como el tejido mesentérico. - Cosecha LNs en tubos cónicos de 15 ml que contienen 5 ml de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS).
- Deseche correctamente las carcasas de las ratas.
- Retire los LN frescos del PBS, enrolle y seque el nodo en un papel de filtro seco. Colóquelo en un plato pequeño de Petri y agregue la solución de incrustación para muestras de tejido congelado (O.C.T.) durante 2 min.
- Transfiera y oriente el LN boca abajo en la posición deseada en la base de un criomold, con suficiente O.C.T para cubrirlo. Evite las burbujas cerca del tejido. La superficie de seccionamiento es la parte inferior del criomold.
- Inmediatamente congele el criomold en un enfriador de espuma de poliestireno con hielo seco. Cuando todavía haya una pequeña parte de O.C.T. sin congelar (20-35 s), transfiera la muestra a papel de aluminio y colóquela en un refrigerador con hielo seco mientras continúa congelando otras muestras. Al final, almacene todas las muestras a -80 oC hasta su seccionamiento.
- Seccione el LN con un espesor de sección de ajuste de criostato a 5-8 m. Transfiera las secciones de cristoensa en las diapositivas del microscopio.
NOTA: Antes de la sección, retire las muestras congeladas del congelador de -80 oC y permítales equilibrarse a la temperatura en la cámara de microtome criostato a -22 oC durante aproximadamente 30 minutos.
2. Etiquetado celular con colorantes fluorescentes
NOTA: Los colorantes fluorescentes son ampliamente utilizados en la biología celular. Preferimos utilizar el etiquetado de dialkylcarbocyaninas de cadena larga (DiI(C18), excitación 549 nm, Emisión 565 nm) porque son brillantes, estables y se pueden añadir directamente a los medios de cultivo, no afecta a la viabilidad celular o propiedades de adhesivo celular25,26.
- Disociar las células que crecen en condiciones ideales (es decir, en medio completo) y resuspender en un medio libre de suero a una densidad de 106 células/ml.
- Añadir 1 ml de suspensión celular (106 celdas) a un tubo cónico de 15 ml y etiquetar con Dil(C18) (2 g/mL) durante 10 min a 37 oC.
NOTA: Después de 5 min, agitar suavemente los tubos para evitar la sedimentación celular y el submanchas de las células sedimentadas. Las densidades más grandes requieren tiempos de incubación más largos para una tinción uniforme. Un tiempo óptimo de incubación para la tinción celular varía con la línea celular. Se puede cuantificar mejor utilizando el canal de detección de citometría de flujo FL2 convencional(Figura 2A). - Centrifugar los tubos de suspensión etiquetados a 300 x g durante 4 min.
- Retire el sobrenadante y lave dos veces en 10 ml de medio libre de suero. Recuperar las células como pellets rojos. Resuspenda las células a 106 células/ml en un medio libre de suero con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1%.
3. Pre-revestir platos con solución de poli-l-lisina o BSA como control de sembrado (opcional)
NOTA: Utilizamos platos de cultivo celular recubiertos con PLL como superficies de control de carga positivas para garantizar que diferentes grupos experimentales de células tumorales se sembraron al mismo número, así como superficies recubiertas de BSA como controles negativos.
- En condiciones estériles, para preparar pozos recubiertos con PLL o BSA, añadir 300 l de PLL (0,1% p/v en H2O) o BSA (diluido al 2,5% p/v en H2O) directamente a la placa de 24 pocillos e incubar durante la noche a 4oC.
- Retire la solución por aspiración, enjuague suavemente la superficie con PBS estéril y seque al aire la placa a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejido antes de la sembración celular.
NOTA: Los volúmenes finales de PLL o BSA deben ajustarse según el área de diferentes placas de pozo.
4. Sembrar células tumorales con etiqueta fluorescente en criosecciones LN o pozos recubiertos con PLL/BSA
NOTA: Como controles experimentales, utilizamos (1) platos de cultivo celular recubiertos con PLL o BSA y (2) secciones consecutivas del mismo LN por experimento (ver este detalle en la Figura 2D),donde este último minimizará las variaciones regionales en la composición de la matriz extracelular (ECM) de cada sección LN, que a su vez puede dictar la tasa de adhesión celular. Para el siguiente ensayo de adhesión de células tumorales, seleccione criosecciones LN secuenciales y de alta calidad.
- Lave suavemente las criosecciones dos veces con PBS y rehidrate con PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Bloquear la adhesión inespecífica a criosecciones con 2,5% de BSA durante 30 min a 37 oC. Utilice cámaras de lavado de inmunohistoquímica y cunas de lámina para asegurarse de que se extrajo todo el O.C.T durante lavados e incubaciones.
- Escurra el exceso de BSA en una toalla de papel seco, seque el contorno de las secciones LN con un hisopo de algodón y circule las secciones con un bolígrafo PAP.
- Para el ensayo de adhesión de células tumorales, añadir 100 ml de suspensión celular (del paso 2.4) a cada sección de LN o pozo rodeado en las placas recubiertas de PLL de 24 pocillos y colocarlo en un estante de cámara humidificado durante 1-2 h a 37 oC en la incubadora de cultivo celular convencional.
NOTA: El volumen final de la suspensión celular debe ajustarse de acuerdo con el área de diferentes LNs rodeados. - Lave suavemente las células no adherentes cuatro veces con PBS. Fijar las células fluorescentes adherentes restantes con 3.7% de formaldehído en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
5. Cuantificación manual del índice adhesivo
NOTA: El índice adhesivo (es decir, células tumorales/LN mm2) se logró utilizando un objetivo 10 veces y contando manualmente el número de células tumorales, fácilmente identificadas por microscopía de luz y confirmadas por una microscopía de fluorescencia(Figura 2D),por áreas de ganglios linfáticos de varios campos independientes (obtenidos utilizando el software ImageJ/FIJI) del Instituto Nacional de Salud).
- Utilice un microscopio fluorescente con un objetivo 10x para tomar imágenes TIFF separadas en dos canales correspondientes a los campos brillantes y rojo-fluorescentes(Figura 2D). Asigne un nombre y guarde estas imágenes sistemáticamente.
- Inicie ImageJ/FIJI, abra las imágenes y establezca la escala. Es necesario utilizar una escala de calibración (por ejemplo, una regla micrométrica de 1 mm)(Figura 2C).
- Abra la foto de la regla micrométrica (o un micrómetro de etapa), seleccione la herramienta Línea recta y dibuje una línea recta que defina una distancia conocida.
- En el menú Analizar, seleccione Establecer escala. La distancia en píxeles se rellenará en función de la longitud (en píxeles) de la línea dibujada en el paso 5.3. La distancia conocida se rellenará con la distancia real (en este caso, en milímetros) y la unidad de longitud en el campo Unidad de longitud (en este caso, en milímetros).
- Haga clic en Global (esta calibración se aplica a todas las imágenes abiertas en esta sesión de ImageJ/FIJI) y pulse OK.
- Cuantificación del área de nodo linfático: Seleccione la herramienta Varita y, haciendo doble clic, abra la configuración de la herramienta Varita. Establezca el modo en 8 conectados. Haga clic en la foto y establezca la tolerancia hasta seleccionar todos los ganglios linfáticos de la foto y pulse OK. Para medir el área, abra Analizar ? Medida (CTRL + M). El área se expresa en las unidades establecidas anteriormente.
- Cuantificación de células tumorales: Abra las imágenes de microscopía/fluorescencia de luz en el software FIJI. Seleccione Plugins (Plugins) Analizar ? Contador de celdas ? Contador de celdas. Haga clic en la foto que desea cuantificar y pulse el botón Inicializar en la ventana del contador de celdas. Seleccione el tipo de contador (1-8) y haga clic en las celdas de la foto. Para inicializar la siguiente foto, presione el botón Restablecer en la ventana del contador de celdas, abra la nueva foto y repita todos los pasos.
NOTA: El índice de adhesión de LN se expresa como el número de células tumorales adherentes por área cubierta de LN (células/mm2).
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Representative Results
Ilustramos el ensayo evaluando el potencial adhesivo LN de las células de cáncer de mama MCF-7 fluorescentes rojos que expresan diferentes niveles del gen NDRG4 (denominados células n.o NDRG4 positivas y NDRG4-negativas), un modulador negativo de la agrupación de beta1-integrina en la superficie celular24,examinando las fracciones de las células tumorales LN-adherentes de rata. Ejemplos de las imágenes sin procesar de este protocolo se muestran en la Figura 2. Como se observa en la Figura 2B,la morfología de las células adherentes es redondeada en forma, y se dispersan heterogéneamente a lo largo del LN. El índice de adhesivo LN es 2 veces mayor en células MCF-7 negativas de NDRG4 (877 a 124 células/mm2 de LN) en comparación con el de las células correspondientes de MCF-7 positivas de NDRG4 (412 a 76 celdas/mm2 de LN, p a 0,03)(Figura 2D).
Figura 1: Procedimiento escalonado para el aislamiento de los LN mesentéricos de rata. (A) Incisión cutánea de línea media ventral: las ratas eutanasiadas se colocaron en posición de recumbencia dorsal y se hizo una incisión de línea media de 30-50 mm en la piel que cubre el abdomen medio, exponiendo las vísceras abdominales (hígado, intestino delgado, cecum y vejiga). (B) El intestino delgado se extraió suavemente de la cavidad abdominal exponiendo LN mescéricos de rata incrustados en tejido adiposo visceral. (C) Anatomía bruta del tracto gastrointestinal diseccionado después de la extracción. (D) Diseccionar los ganglios linfáticos mesentéricos del tejido adiposo que se conecta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de la adhesión de las células tumorales a las secciones de los ganglios linfáticos de ratas. (A) Análisis de citometría de flujo ilustrativo que muestra la intensidad del etiquetado DiI(C18) (cuadrante superior) en comparación con las células no etiquetadas (cuadrante inferior). (B) Imágenes de microscopía de luz (izquierda) y fluorescentes (derecha) de células MCF-7 etiquetadas en rojo adherentes a secciones LN después del paso de lavado. (C) Después del ensayo de adhesión, las células adheridas en los cubreobjetos se cuantifican manualmente mediante una escala de calibración para estimar el área de los ganglios linfáticos y la microscopía fluorescente para dirigir el recuento de células. (D) El derribo de NDRG4 en las células tumorales mamarias MCF-7 aumenta la adhesión de los ganglios linfáticos. Imágenes representativas de células fluorescentes rojas MCF-7 (células con etiqueta DiIC18 negativa sNDRG4 o NDRG4) 30 minutos después de la sembración en secciones de ganglios linfáticos de ratas de 5 m. El índice adhesivo LN se expresa como el número de células tumorales adherentes por área cubierta de LN (células/mm2). Barra de escala a 200 m. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La diseminación del sistema linfático de las células cancerosas requiere una variedad de eventos complejos impulsados por células. Inician con el desprendimiento celular del tumor primario y la remodelación de la arquitectura de la matriz extracelular (ECM), y están apoyados por la quimiotaxis persistente y la migración activa a través de los linfáticos aferent en el camino a los LN centinelas. Si las células cancerosas se adhieren y sobreviven en los LN, pueden propagarse fácilmente a otros órganos secundarios. Aquí describimos un método fácil para el análisis funcional rápido y de bajo costo de interacciones adhesivas específicas entre células tumorales y LNcongelados.
Estructuralmente, los LN son masas discretas similares a esponjas de redes densas y extensas de fibras ECM, frecuentemente conocidas como "fibras reticulares", que actúan como caminos para la migración celular y como conductos para la entrega rápida de factores solubles (antígenos y/o quimiocinas) dentro del parénquimaLN 27. Las fibras reticulares conservadas de los LN congelados del ensayo apoyan las señales haptotácticas y proporcionan andamios para la adhesión de células tumorales in vitro. Estas fibras se componen principalmente de proteínas estructurales, como colágenos I y III, y por elementos secundarios de ECM, como fibronectina, tenascina, laminina, vitronectina y proteoglicanos de heparan28,29. Después de la adhesión celular, la mayoría de estos factores ECM derivados de LN proporcionan señales moleculares que determinan la supervivencia celular (estados proliferativos o de latencia) o la muerte celular (anoikis) a través de señales mediadas por integrina.
Aquí, demostramos el ensayo usando LNs de rata xenógenos y una línea celular tumoral de mama humana. Alternativamente, se podrían utilizar otras fuentes de LN. La composición de LNs de rata, ratón o humanos incluye las mismas proteínas estructurales y funcionales que forman parte de ECM de mamíferos nativos, todos preservando sitios de unión similares que son necesarios para la adhesión celular23. Es importante destacar que el único paso crítico es utilizar rebanadas consecutivas del mismo LN por experimento para minimizar las variaciones regionales en la composición de ECM de cada sección LN, lo que a su vez podría dictar la tasa de adhesión celular.
Un inconveniente del ensayo es que no recapitula los primeros pasos de la diseminación linfática, reflejando sólo la fuerza adhesiva de las células tumorales a los LN. Por ejemplo, la sembración de células tumorales de mama menos agresivas en secciones de LN, como el MCF-7(Figura 2)o las líneas24de células tumorales T47D, conducen a una fuerte adhesión a las secciones de LN in vitro, a niveles similares a los observados para las células tumorales MDA-MB-231 de alta agresión (datos no mostrados). Sin embargo, es bien sabido que los tumores ortotópicos MCF-7 xenoinjertos no pueden alcanzar LNcentinela centinela, mientras que los tumores MDA-MB-231 se metástasis espontáneamente a ellos30. Claramente, el cuello de botella principal para la formación de LN-metástasis de células MCF-7 ocurre en pasos antes de que alcancen y se adhieran a los LN, como la incapacidad de las células MCF-7 se escapan eficientemente de los tumores primarios. Por lo tanto, la fuerza del ensayo descrito aquí no es establecer correlaciones directas con el potencial LN-metastásico, pero es un método simple para cuantificar las propiedades adhesivas de una célula tumoral en un ECM más realista in vitro. Mediante el uso de tejidos congelados, las criosecciones representan la complejidad natural de los LN en términos de estructura y composición, lo que sería imposible de recrear utilizando técnicas sintéticas, particularmente aquellas que utilizan proteínas ECM purificadas.
Las limitaciones adicionales del método son (1) que no permite la evaluación del potencial quimiotáctico de los factores secretados por los LN y que (2) no informa sobre si la adhesión específica de la célula a las secciones LN es el resultado de la unión preferencial a proteínas ECM, células o cualquier otra estructura presente en las secciones LN. Sin embargo, consideramos que este enfoque podría ser pertinente y debe considerarse seriamente para aplicaciones particulares, pero está fuera del alcance de este manuscrito en particular. Por ejemplo, en un estudio reciente, identificamos el gen 4 regulado por N-Myc regulado aguas abajo (NDGR4) como un biomarcador mecanicista de metástasis LN en tumores de mama24. Mecanísticamente, las células tumorales que carecen de expresión NDRG4 aumentan la adhesión a las criosecciones de LN favoreciendo el ensamblaje de receptores de integrina n.o 1 en el borde principal de las células tumorales mamarias. Además, utilizando controles adicionales, como platos recubiertos con proteínas ECM purificadas, descubrimos que la adhesión diferencial a las secciones LN es el resultado de la asociación selectiva con vitronectina24.
Por último, vale la pena señalar que este método no está restringido a las secciones de LNs y podría ser configurado para evaluar la adhesión celular a diferentes órganos vivos, como criosecciones de bazo o pulmones. Las células metastásicas exhiben organotropismo y las mediciones de la fuerza adhesiva en secciones congeladas de diferentes órganos in vitro, podrían ser un medio útil para predecir la diseminación del cáncer específico de órganos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Dra. Rosana De Lima Pagano y A Ana Carolina Pinheiro Campos por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de: FAPESP - Sao Paulo Research Foundation (2016/07463-4) y Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
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