Summary
在这里，我们提出了一个方案，荧光抗体介导检测蛋白质在斑马鱼胚胎和幼虫的整个制剂。
Abstract
免疫组织化学是一种广泛使用的技术，用于在正常发育和疾病状态下探索蛋白质表达和定位。尽管许多免疫组织化学方案已针对哺乳动物组织和组织部分进行了优化，但这些协议通常需要对非哺乳动物模型生物体进行修改和优化。斑马鱼越来越多地作为基础、生物医学和转化研究的模型系统，用于研究发育过程的分子、遗传和细胞生物学机制。斑马鱼作为模型系统具有许多优点，但也需要经过修改的技术来优化蛋白质检测。在这里，我们提供斑马鱼胚胎和幼虫全装荧光免疫基化学方案。该协议还描述了可以使用的几种不同的安装策略，并概述了每种策略提供的优缺点。我们还描述了对该协议的修改，以允许检测整个安装组织中的染色体基质和切片幼虫组织的荧光检测。该议定书广泛适用于许多发育阶段和胚胎结构的研究。
Introduction
斑马鱼（达尼奥再鱼）已成为研究生物过程的有力模型，原因包括发电时间短、发展迅速、遗传技术的可及性等。因此，斑马鱼通常用于高通量小分子屏幕的毒理学研究和药物发现。Zebrafish 也是研究发育过程的一个有吸引力的模型，因为单个雌性可以一次正常生产 50-300 个卵子，而光学清晰的胚胎在外部发育，从而能够有效地可视化发育过程。然而，由于在建立反向遗传技术方面的挑战，早期研究主要依靠使用N-乙基-N-硝基苏雷亚（ENU）或其他诱变基因的正向遗传屏幕。大约20年前，斑马鱼首次使用变形金刚来敲除靶向基因1。形态诺是一种小的反义寡核苷酸，在早期发育阶段将微注射到胚胎后抑制目标mRNA的转化。形态软糖的一个主要弱点是，当细胞分裂时，它们被稀释，通常在受精后72小时（hpf）时失去效力。虽然形态动物仍然是斑马鱼基因破坏的有力工具，但转录活化样核酸酶（TALEN）、锌指核酸酶（ZFNs）和定期聚因间隔短回溯重复（CRISPRs）最近被用于直接靶向斑马鱼基因组2，3。这些反向遗传策略，结合正向遗传学和高通量屏幕，建立了斑马鱼作为研究基因表达和功能的强大模型。
研究基因功能的能力通常需要评估基因或基因产物表达的时空分布。在发育早期可视化这种表达模式的两种最常用的技术是原位杂交（ISH）和全装载免疫组织化学（IHC）。原位杂交于1969年首次开发，依靠使用标记的反义RNA探针来检测生物体4中的mRNA表达。相反，标记抗体用于免疫组织化学，以可视化蛋白质表达。标记蛋白质进行检测的想法可追溯到20世纪30年代的5世纪，1941年，第一个IHC实验发表于1941年，当时FITC标记的抗体被用来检测受感染组织中的致病细菌。ISH和IHC在随后几十年中已经发展并显著改善，现在都常规地用于分子和诊断研究实验室7，8，9，10，11。虽然这两种技术都有优点和缺点，但 IHC 比 ISH 具有若干优点。实际上，IHC 比 ISH 耗费少得多，并且根据原抗体的成本通常较低。此外，mRNA表达并不总是蛋白质表达的可靠指标，正如在小鼠和人类中已经证明的，只有大约三分之一的蛋白质丰度变异可以通过mRNA丰度12来解释。因此，IHC 是确认 ISH 数据的重要补充，如果可能的话。最后，IHC可以提供亚细胞和共同本地化数据，这些数据不能由ISH13、14、15确定。在这里，我们描述了一个分步法，通过免疫性化学在整座斑马鱼胚胎和幼虫中可靠地检测蛋白质。这项技术的目的是确定整个胚胎中感兴趣的蛋白质的时空表达。该技术利用抗原特异性原抗体和荧光标记的二级抗体。该协议易于适应，适用于滑动安装的组织部分，并与致变色基质一起用于荧光。使用这个协议，我们证明，除了乙酰胆碱受体外，开发斑马鱼骨骼肌表达的有益性谷氨酸受体。NMDA型谷氨酸受体亚单位在23 hpf的纵向肌肉上可检测到。
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Protocol
本议定书中描述的斑马鱼繁殖成人和胚胎的手术程序得到了默里州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 胚胎收集和固定
- 通过将成年斑马鱼混合性对或组放入装有系统水的网状或槽内衬的水箱中，准备产卵池。
- 在亮起灯时，将产卵罐水更换为新鲜系统水，以清除粪便。使用 14 小时/10 小时暗循环，上午 9 点亮起灯。
- 一旦产卵，让大人回到家里的水箱。
- 收集鸡蛋，通过绘制他们使用转移移液或倒入网格过滤器。
- 将卵子移植到培养皿中，半途而废，填充胚胎培养基（如 30% Daniau 或 E2 胚胎培养基，含有 0.5 mg/L 亚甲蓝），将每盘的胚胎数量限制在 50 个。
- 取出任何死亡或无法分割的鸡蛋。
注：死亡胚胎变得不透明，经常出现"阴云"，因此很容易识别。如果将亚甲蓝添加到胚胎培养基中，则死胚胎呈现出深蓝色的外观。 - 在28.5°C下孵育鸡蛋菜肴，直到它们达到所需的阶段。对于这个实验，将胚胎培养到23 hpf。
- 可选） 在胚胎培养基中以24 hpf至200μM 1-苯基2-硫尿（PTU）将胚胎移植，以防止黑色素发生16，17。或者，漂白胚胎固定后（见可选的第5节）。
- 每天更换胚胎培养基或PTU介质。
- 在立体显微镜下使用超细尖钳子的未孵化胚胎。或者，在室温下，在胚胎培养基中孵育1mg/mL Pronase，进行化学分离胚胎。从普里昂酶中取出胚胎，用胚胎培养基洗涤三次。
- 被移植的胚胎会粘在塑料上。将它们保存在玻璃或塑料培养皿中，涂上1-2%的甘蔗糖溶解在胚胎培养基中。使用火抛光巴斯德移液器移动被击灭的胚胎，以尽量减少损伤。
- 使用塑料或火抛光移液将胚胎转移到 1.5 mL 离心管中。
- 用微移液器去除胚胎培养基。每次液体更换后，只留下足够的液体来覆盖胚胎。
- 在化学烟气罩中制备1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的4%甲醛（PFA）。
注意：PFA 是一种危险材料。戴手套，在指定区域处理受污染的液体和固体。 - 将胚胎固定在4%PFA中1-2小时，在室温下轻轻摇动。或者，将胚胎固定在4小时至4°C过夜。
- 在 1x PBS 中洗涤三次 = 1% Triton-X （PBTriton） 5 分钟。
- 立即使用胚胎或在4°C下储存长达1周。
- 对于长期储存，在100%甲醇（MeOH）2小时或过夜-20°C时脱水胚胎。将胚胎在-20°C处储存在MeOH中数月。
注意：MeOH 是一种危险材料。戴手套，在指定区域处理受污染的液体和固体。
2. 胚胎制备
- 通过在室温下通过连续孵育对胚胎进行再水化。
- 孵育在75%MeOH/25% 1x PBS 5分钟，摇动。
- 在 50% MeOH/50% 1x PBS 中孵育 5 分钟，摇动。
- 在 25% MeOH/75% 1x PBS 中孵育 5 分钟，摇动。
- 孵育在100%PBTriton 5分钟，摇动。
- （可选）在冰上加入10μL新鲜解冻蛋白酶K库存（10mg/mL），在冰上制备新鲜的蛋白酶K工作溶液（PBTriton为10μg/mL）。
- 通过在蛋白酶K中消化长达30分钟，使胚胎渗透。
注： 建议的时间是 <24 hpf： 没有消化;24马力：15分钟消化;和7天大：30分钟消化。 - 在PBTriton中冲洗渗透胚胎，在室温下重新固定在4%PFA中20分钟。
- 在室温下用轻柔的摇动在PBTriton中清洗胚胎三次5分钟。
- 通过在蛋白酶K中消化长达30分钟，使胚胎渗透。
3. 初级抗体孵化
- 选择与二级抗体宿主物种（如 PBTriton 中的 10% 山羊血清）匹配的商业阻断溶液或血清，无论是否包含 2 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA）。
- 在室温下或摇动时在4°C下将胚胎阻断溶液1-3小时。
- 在4°C的PBTriton中，在阻断溶液或1%血清中孵育在原原抗体中，同时摇动。在本实验中，主要抗体为抗NMDAR1、抗泛AMPA受体和抗磷-异色H3，每个抗体在PBTriton的1%山羊血清中稀释到最终浓度为1：500。
- 在 PBTriton 中洗涤 5 次，在室温下洗涤 10 分钟，同时摇动。
4. 二次抗体孵育
- 根据主抗体的宿主种类和所需波长选择二级抗体。
- 在二级抗体中孵育，在阻滞溶液中稀释，或1%血清在室温下孵育2小时（或在4°C下过夜），同时摇动。
注：荧光二级抗体对光敏感。我们使用1：500山羊抗小鼠Alexa488稀释在1%山羊血清在PBTriton。 - 用铝箔盖住管子，或用防光箱盖住管子，以便执行所有后续步骤。
- 在PBTriton中洗涤三次，在室温下洗涤10分钟，同时摇动。
- 将胚胎转移到PBS中的50%甘油溶液中，在胚胎培养基中2%的甘蔗糖床上，然后进行记录或进行以下进一步处理步骤。
可选步骤
5. 漂白
- 在 1.5 mL 管中加入漂白剂溶液，加入 810.7 μL 的 ddH2O、89.3 μL （2 M KOH） 和 100 μL 的 30% H2O2.
- 反转管三次以混合。
- 移液器1mL的漂白溶液方向到胚胎。
- 打开胚胎管盖，让气体逸出。轻轻敲击长凳上的管子，去除气泡。
- 监控漂白过程（必要时使用显微镜），并在颜料完全去除时停止反应（约 5 分钟，24 hpf，10 分钟，72 hpf）。
- 用微移液器小心地去除漂白溶液，并在 1 mL 的 PBTriton 中冲洗胚胎三次。
注：在此步骤中，胚胎是粘的。 - 继续下面的文档或进一步处理步骤。
6. 胚胎解剖和脱脂
- 要去除蛋黄，将 1x PBS 的少量（±200 μL 或足够完全覆盖胚胎，但限制到足以限制其浮动位置）转移到凹陷滑块或普通玻璃幻灯片上。
- 使用塑料转移移液器将 1 个或更多胚胎移动到 PBS 液滴。
- 使用超细钳子和00昆虫针，以打破蛋黄和非常轻轻地刮蛋黄颗粒从胚胎的腹腔表面（另见程等人，2014年）18。
- 去除蛋黄颗粒，并根据需要补充PBS。
- 重复，直到胚胎完全没有蛋黄。
7. 平面安装在幻灯片上
- 将脱焦胚胎转移到带塑料移液器的带电玻璃滑块上，或带有修剪尖端的 1 mL 微移液器（以降低剪切应力）。使用 200 μL 微移液器尖或昆虫销进行定向。
- 用金巾或纸巾将多余的PBS吸走。
- 将 2-3 滴安装介质添加到幻灯片和盖玻片中。
- 空气干燥约 5 到 10 分钟。
- 用透明指甲油将盖玻璃密封在幻灯片上。
注：盖玻璃的边缘必须完全覆盖一层薄而连续的指甲油。 - 在成像前约 10 分钟等待干燥。
8. 安装在阿加罗斯
- 在胚胎培养基中加入0.5克角胶，在微波安全烧瓶或比预期体积至少3倍的烧杯中加入50mL的胚胎培养基，在胚胎培养基中制备1%的甘蔗。
- 在微波炉中加热，每30s旋转一次，直到甘蔗完全溶解。
- 在 1.5 mL 离心管中制造 1 mL 等分。在室温下储存等分。
- 加热前用盖锁盖住管盖。
- 将角玫瑰管放在一个浮管支架中，放在半装满水的烧杯中。
- 用浮动管将烧杯微波2-3分钟，或直到角质完全融化。
- 使用塑料移液器或带修剪尖端的 200 μL 微移液器将胚胎移植到桥接滑块上（以降低剪切应力）。
- 使用昆虫销将胚胎放在矩形盖玻上，并将大约 20 μL 融化的甘蔗直接添加到胚胎中。
- 使用 00 个昆虫销快速定位最接近盖玻片的感兴趣区域。
注：这是一个倒置的安装件。 - 根据需要，将甘蔗管返回到热水管浮动在每次使用和微波之间。
- 当甘蔗硬化时，使用显微镜成像。将安装的胚胎倒置，用于倒置显微镜。翻转盖玻片（使甘蔗在盖玻片下），用于直立显微镜。
9. 安装在桥接幻灯片上
- 要制作桥接幻灯片，请使用一小点超级胶将胶方形盖玻片贴在玻璃幻灯片上。
注： 盖玻片之间应至少有 5 mm 宽的槽。两个#1盖唇高通常适用于 24-48 hpf 胚胎，而 3 个盖唇高可能需要 72 hpf。 - 将1-2个脱焦胚胎转移到桥接滑块上，使用塑料移液器或带修剪尖端的200μL微移液器（以降低剪切应力）。
- 用金巾或纸巾清除多余的液体。
- 将一滴+80%甘油直接添加到胚胎中。
- 盖上矩形盖玻璃。甘油滴应接触盖玻璃。
- 在盖玻璃之间的空间中加入更多的甘油，并根据需要滑动，以在胚胎两侧用甘油边缘完全覆盖胚胎。
- 轻轻滑动矩形盖玻璃，将胚胎卷入成像位置。
10. DAB 染色
注： 本节开始于上述步骤 4.2 之后，并替换步骤 4 的其余部分。
- 用过氧化物酶结合的二级抗体在室温下孵育胚胎2小时，或在4°C摇动时过夜。
- 在PBTriton中洗三次，在室温下洗10分钟。
- 将胚胎转移到培养板或带转移移液器的凹陷滑动。
- 将 50 μL 的 1% DAB（3，3'-二氨基苯甲胺）溶解在 ddH2O 和 50 μL 的 0.3% 过氧化氢中溶解，用 PBS 将至 1 mL。
注意：DAB 是一种危险材料。在指定区域戴上手套并处理 DAB 污染的液体和固体。 - 用上面准备的DAB溶液覆盖HRP染色胚胎，并在显微镜下监测颜色发育（通常为1-5分钟）。
- 达到所需颜色发育水平后，在PBS中短暂冲洗胚胎。
- 在固定前将胚胎移植回1.5 mL管。
- 在室温下，在4%PFA中重新固定胚胎15-20分钟。
- 在PBTriton中清洗胚胎三次5分钟。
- 继续文档。
11. 安装在幻灯片上的染色切片组织的修改协议
- 将纸巾包围，用纸笔染色。
- 将幻灯片转移到潮湿室。
- 将 1 mL 的PBS直接添加到幻灯片中。
- 在室温下孵育7分钟，去除嵌入介质。
- 通过反转滑块将 PBS 倒入。
- 在高达 1 mL 的 TNT 缓冲液（100 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、0.1% Tween20）中补充 1 分钟。
- 在室温下，在高达 1 mL 的阻隔溶液（商业或 10% 血清 + 2% BSA）中堵塞 1 小时。
- 在1%血清中稀释的原发抗体中孵育过夜，或在4°C下阻断溶液。
- 在室温下，在高达 1 mL 的 TNT 缓冲液中洗涤 5 次。
- 在二级抗体中孵育2小时，在室温下或在4°C过夜。用铝箔盖住腔室或使用深色盖子。
- 在室温下用TNT洗涤五次。倒掉最后一次洗。
- 安装时，安装介质和盖玻片有 2-3 滴。坐5-10分钟。
- 使用透明指甲油将盖玻璃密封在滑轨上。成像前请完全干燥。
12. 文档
- 在实验室笔记本中记录整个过程和任何偏差。
- 记录主要抗体的浓度、名称、目录号、制造商和批号。
- 将适当安装的样品放在显微镜台上。找到感兴趣的区域。
- 选择一个相对明亮的示例。设置摄像机曝光和增益，使信号足够明亮而不饱和。
- 在比较实验抗体标记胚胎和控制抗体（例如 IgG）胚胎时，使用相同的暴露设置比较相同感兴趣区域的染色强度。
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Representative Results
全装免疫组织化学利用抗体检测完整动物中蛋白质表达的空间模式。免疫组织化学的基本工作流程（如图1所示）包括繁殖斑马鱼、培育和制备胚胎、阻断非特异性抗原、使用抗原特异性原抗体靶向感兴趣的蛋白质、检测带有标记的次级抗体的初级抗体、安装标本和记录表达。
全山免疫性化学是研究斑马鱼发育过程中空间和时间蛋白表达的宝贵工具。斑马鱼表现出自发收缩介导的间隙结开始于19hpf之前 - 在运动神经元接触19之前。斑马鱼神经肌肉结，像其他脊椎动物一样，由乙酰胆碱在尼古丁乙酰胆碱受体上作用。这些组装的受体首先在大约16 hpf被检测到，当神经元形成接触20时，表达会膨胀和重塑。对青蛙21和大鼠22的研究表明，脊椎动物的骨骼肌肉也可以表达碘化谷氨酸受体。NMDA型谷氨酸受体的GluN1亚单位的全装装免疫组织化学显示谷氨酸受体亚单位的表达，在整个斑马鱼肌肉发育过程中，在23 hpf（图2）。这大约与运动神经元内侧运动的时间相对应。将表达与无原发对照胚胎进行比较，以确定鱼和二次抗体的背景荧光，并将表达与2μg/mL小鼠IgG进行比较，以确定非特异性抗原结合的相对贡献。在发育的这个阶段，在肌肉中未检测到AMPA型谷氨酸受体。抗体浓度列于表1。为了生成这些图像，这些胚胎按照本协议中所述进行处理，除了去黄否则没有任何可选步骤。胚胎是扁平安装和盖板 （图 3B）.
分裂细胞表达不同的组蛋白修饰与静默细胞，可以通过免疫组织化学检测使用抗体识别特定修饰，如蛋白质磷酸化。丝氨酸10处组蛋白3的磷酸化与细胞分裂23相关。本协议对安装在幻灯片上的切片组织进行免疫组织化学的适应，用于检测幼虫斑马鱼大脑中增殖细胞。72 hpf胚胎的冷冻部分被安装在幻灯片上，并用于p-H3的免疫染色（图4）。几个细胞表达p-H3，表达在心室区域最为显著。将表达与无原发控制胚胎和2μg/mL小鼠IgG进行比较，以确定非特异性抗原结合的相对贡献。
| 抗体 | 目标 | 浓度 |
| 鼠标 IgG 等型控制 | 非特异性抗原 | 2 μg/mL |
| 鼠标抗 NMDAR1 | GluN1 子单元 | 1:1,000 |
| 山羊抗鼠标 Alexa488 | 鼠标 IgG | 1:500 |
| 鼠标抗磷-H3 | 磷酸酯组蛋白H3 | 1:500 |
| 小鼠抗泛AMPA受体 | 格鲁R1-4 | 1:500 |
表1：使用的抗体和浓度清单。
图1：全装装免疫性-化学过程流程图。程序的基本工作流程是养鱼;收集和制备胚胎;阻断非特异性抗原;在一级和二级抗体中连续孵育;安装组织;和文件。可选步骤在工作流中的相应点用小箭头指示。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：拉瓦原理图和NMDA受体IHC代表结果。使用全装免疫性-化学测试谷氨酸受体表达在开发肌肉。指示 23 hpf 处的感兴趣方向和区域。当不包括初级抗体时，没有信号可检测到。小鼠IgG控制抗体显示低水平的非特异性表达。NMDA型谷氨酸受体（NMDAR）的GluN1亚单位在发育中的肌肉中表达，在索米特边界（箭头）时浓度较高。AMPA型谷氨酸受体（AMPAR）在此阶段不表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：安装方案的原理图。（A） 沉入50%甘油的胚胎很容易重新定位.（B） 在安装介质的幻灯片上平装的胚胎，可在日后保存及影像。（C） 安装在1%甘蔗滴中的胚胎可以固定到观察困难区域的位置。（D） 安装在桥接滑梯上的甘油的胚胎可以滚动和重新定位。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：切片组织中IHC的代表性结果。使用可选步骤中的方案修改，免疫组织化学测试在斑马鱼幼虫脑中增殖细胞在72 hpf。小鼠IgG控制抗体，排除原抗体，显示低水平的非特异性表达。作为增殖细胞的标记，p-H3以离散位置表示，包括心室区域（箭头）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
免疫组织化学是一种多功能的工具，可用于描述生物体中几乎所有感兴趣的蛋白质的时空表达。免疫组织化学用于各种组织和模型生物体。该协议已针对斑马鱼的使用进行了优化。不同物种的免疫组织化学可能需要不同的固定和处理技术，根据物种和内源性过氧化物酶的存在阻塞溶液，以及由于组织的厚度和组成而孵育的时间。斑马鱼中的IHC在增进我们对癌症24、代谢性疾病25、神经紊乱26以及许多与人类健康密切相关的其他领域的理解方面起起不可或缺的作用。IHC 的一个主要优点是，与其他技术（如 ISH）相比，该过程相对较短，且技术要求不高。然而，有许多步骤需要根据标本的年龄、被靶向的抗原和使用的抗体进行优化。
该协议中几个步骤的持续时间是灵活的。为上述灵活步骤提供的持续时间通常表示所需的最短时间。一般来说，每当胚胎在PBTriton中洗涤三次或三次以上时，如果需要，在最后一次洗涤时，可以在4°C下过夜。渗透和固定时间不太灵活，应只是出于故障排查策略的一部分，特意进行调整。我们注意到协议中的几个要点是可选的，以显示这些步骤如何像实验上那样集成到工作流中。例如，如果色素沉着干扰信号检测，通过PTU治疗或漂白固定胚胎防止黑色素。漂白会损害组织，因此必须小心尽量减少胚胎在漂白剂中的时间。然而，漂白可能比PTU治疗更可取，这可能会影响发展的某些方面27，28，29，30。我们还提供了荧光和色化检测选项。如果不需要荧光，或者如果抗原产生的信号太弱，无法通过荧光显微镜充分检测，则可以使用马萝卜过氧化物酶 （HRP） 结合抗体和 DAB 实现致色检测。
IHC在斑马鱼中的最大挑战是找到合适的抗体。事实上，当商业抗体不能用于感兴趣的蛋白质时，ISH通常被用作蛋白质表达的代理。许多商业抗体被设计成针对哺乳动物的目标，而表皮并不总是在斑马鱼中保存。如果可用，请选择在斑马鱼中测试的市售抗体。我们发现，识别斑马鱼和目标物种之间保存的抗原的抗体通常在斑马鱼中起作用。我们还发现，除了哺乳动物之外，在鸟类和/或两栖动物身上被证明起作用的抗体通常也适用于斑马鱼，即使斑马鱼的疗效尚未测试。通常，针对哺乳动物抗原而开发的多克隆抗体比单克隆抗体更有可能检测斑马鱼同源性，因为它们的特异性较低。每当测试新的抗体时，使用交叉链接的目标肽、哺乳动物组织或已知表达蛋白质的细胞或表达报告器构造的细胞进行正对照实验是有好处的。抗体也可以由西方印子测试，以验证目标抗原的大小。
虽然大多数商业抗体为IHC提供了建议的稀释范围，但从经验上确定效果最佳的稀释物非常重要。抗体浓度过高通常会导致非特异性染色和背景增加，而抗体太少无法提供可识别的信号。根据抗体和抗原的不同，如上文步骤 3.2 所述，首先渗透胚胎可能是有益的，但是，此步骤可能没有必要，在某些情况下可能会导致信号降低。该协议使用Triton-X-100作为渗透细胞的洗涤剂，这可能足以用于薄组织或表面表达。深层或厚组织，如深脑区域或较老的幼虫，可能需要蛋白酶渗透。相反，当仅需要免疫染色细胞表面的蛋白质而不是标记细胞内蛋白质时，应排除Triton-X-100。阻止步骤的持续时间以及商业阻滞溶液的选择与血清和BSA相比，也可以进行调整，以纠正抗体敏感性和背景染色。用于阻断的血清高浓度（本协议中为 10%）可以减少背景染色，但当存在抗体时应稀释，以尽量减少掩蔽抗体结合位点。如果背景信号持续高，即使在低抗体稀释（<1：1，000）中，基于植物的阻断溶液可能是有益的。最后，灵敏度可以通过处理的严格性进行微调。可能需要增加或减少抗体后洗涤步骤的持续时间，以及调整 PBTriton 中的 Triton-X-100 的量。PBTriton 的典型工作范围为 0.2% 到 1.0% Triton-X-100。使用新的抗体用原发IgG和标记的二级抗体染色阴性对照胚胎，以确定抗体特异性和识别潜在的假阳性信号时，这是一种好的做法。
如果抗体优化未能产生正信号，可能是由于抗原的固定屏蔽。一般来说，在4%PFA的固定不掩盖抗原位点，以防止抗体结合，虽然抗原掩蔽偶尔发生与一些抗体。抗原的检索可能导致胚胎受损，但伊努埃和维特布罗德31描述了一个工作协议。或者，如果选定的抗体与4%PFA不相容，或者如果PFA导致细胞形态变化，甲醇，2%三氯乙酸，或glyoaxal可用于修复样品27。抗体与甲醛固定的相容性必须根据经验确定。如果在PFA固定后无法获得正控制信号，则可能值得尝试一种替代固定剂，如甲醇。对于针对偶联抗原（如 GABA-BSA）提出的初级抗体，可能也有必要使用替代固定方案。
有几个有效的选择，用于安装免疫染色斑马鱼胚胎进行成像。胚胎可以转移到甘油的培养皿，定位与针或钳子，并与广泛的视野成像从上面或从下面的成像通过盘与倒置显微镜（图3A）。此方法简单、快速且临时。缺点包括胚胎在液体甘油中展开焦点的倾向、菜中甘油表面的潜在反射，以及通过厚盘成像的难度。胚胎可以平放在玻璃侧面 （图 3B） 与安装介质， 盖玻片， 和指甲油.这些支架可在直立或倒置显微镜上观察。以这种方式制备的胚胎可以提前制备，将幻灯片储存在 4°C，直到成像或稍后存储和重新映像。当成像时间有限时，这尤其有利。这种安装的缺点包括胚胎位置和组织厚度的选择有限，以及无法重新定位或恢复胚胎。以这种方式安装的胚胎通常需要脱脂，因为蛋黄颗粒在最常用的荧光通道中自自动荧光，安装后不能移动或移除。当感兴趣的区域需要难以定位的胚胎时，将胚胎安装在1%的甘蔗中最有利（图3C）。胚胎可以保持与昆虫针与最接近盖玻璃的感兴趣区域的位置，直到甘蔗冷却。Agarose将胚胎保持在位置，胚胎滚动至少几分钟。Agarose 安装最适合倒置显微镜，但盖玻璃可以小心倒置，用于立式显微镜。这种安装可能非常耗时，胚胎通常无法重新定位或恢复。在桥接的幻灯片上安装胚胎（图3D）在这些方法之间提供了某种折衷。桥接的安装是快速的，胚胎可以重新定位和恢复。与扁平坐骑相比，桥的高度可以在组织厚度和胚胎位置方面获得更大的灵活性，同时保持从上方或下方成像的能力。此方法需要提前准备桥接幻灯片。要安装的组织厚度决定了桥需要多少盖唇。桥接的幻灯片可以重复使用几次一天，但应在成像会话后处理，因为甘油很难清除幻灯片，它会慢慢去除粘附桥的胶水。
IHC 是确定生物体或组织中蛋白质表达的时间和模式的有效方法。IHC 与 ISH 相比有几个优势，即成本相对较低，只需 ISH 通常需要的一小部分（2-3 天对 5-8 天）。此外，IHC是基因产物表达的更好指标，因为mRNA水平的检测不能预测可能影响蛋白质表达的转录后和翻译后过程。IHC 还能够提供亚细胞定位数据（尽管在使用 DAB 染色时情况并非如此），而 ISH 不提供这些数据。可以在斑马鱼中执行双ISH/IHC。
IHC也有一些缺点，其中最重要的是抗体的可用性。虽然有许多抗体具有适合IHC的合适质量，但寻找专门在斑马鱼中起作用的抗体更具挑战性，并且通常需要对针对哺乳动物抗原产生的抗体进行测试和故障排除。然而，市场上通过验证的斑马鱼抗体越来越多，CRISPR/Cas9技术的出现使得通过基因组工程来表征标记内源性蛋白质成为可能。然而，这些过程既耗时又具有挑战性，需要验证蛋白质功能。
本报告中描述的方案可在任何阶段广泛用于斑马鱼胚胎和幼虫，也可以应用于成年动物的组织中。此外，该协议还允许染色冷冻或石蜡切片样品，几乎没有修改。全装免疫组织化学用于检查肌肉中的神经递质受体群体，揭示在开发斑马鱼肌肉中可口的NMDA谷氨酸受体强制性亚单位1的表达。这种相当广泛和扩散的染色在整个发展中的肌肉是符合同一受体亚单位的发育表达在开发异虫幼虫21。这表明谷氨酸受体在发育肌肉中的表达是进化保留的。总之，该协议对于通过IHC更好地了解基因表达有价值，并且为确定斑马鱼中蛋白质表达的时空分布提供了强有力的工具。
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Disclosures
作者没有信息要披露。
Acknowledgments
国家卫生研究院的资助赠款8P20GM103436 14。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
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