Summary
Her præsenterer vi en protokol for fluorescerende antistofmedieret påvisning af proteiner i hele præparater af zebrafiskembryoner og larver.
Abstract
Immunhistokemi er en udbredt teknik til at udforske protein udtryk og lokalisering under både normal udviklingsmæssige og sygdomstilstande. Selv om mange immunhistokemi protokoller er blevet optimeret til pattedyr væv og væv sektioner, disse protokoller kræver ofte ændring og optimering for ikke-pattedyr model organismer. Zebrafisk bruges i stigende grad som et modelsystem inden for grundlæggende, biomedicinsk og translationel forskning for at undersøge de molekylære, genetiske og cellebiologiske mekanismer i udviklingsprocesser. Zebrafisk tilbyder mange fordele som modelsystem, men kræver også modificerede teknikker for optimal proteindetektion. Her leverer vi vores protokol for hel-mount fluorescens immunhistokemi i zebrafisk embryoner og larver. Denne protokol beskriver desuden flere forskellige monteringsstrategier, der kan anvendes, og en oversigt over de fordele og ulemper, som hver strategi giver. Vi beskriver også ændringer af denne protokol for at gøre det muligt at påvise kromogene substrater i hele mount væv og fluorescens detektion i opdelt larvevæv. Denne protokol finder stort set anvendelse på studiet af mange udviklingsstadier og embryonale strukturer.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) har vist sig som en stærk model for studiet af biologiske processer af flere årsager, herunder kort produktionstid, hurtig udvikling og faciliteter over for genetiske teknikker. Som et resultat, zebrafisk er almindeligt anvendt i høj gennemløb små molekyle skærme til toksikologisk forskning og narkotika opdagelse. Zebrafisk er også en attraktiv model for studiet af udviklingsprocesser, da en enkelt kvinde rutinemæssigt kan producere 50-300 æg ad gangen, og de optisk klare embryoner udvikler sig eksternt, hvilket giver mulighed for effektiv visualisering af udviklingsprocesser. Men tidlig forskning var mest baseret på fremadrettede genetiske skærme ved hjælp af N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) eller andre mutagener på grund af udfordringer i etableringen af omvendt genetiske teknikker. Omkring to årtier siden, morpholinos blev første gang brugt i zebrafisk til knockdown målrettede gener1. Morpholinos er små antisense oligonucleotider, der hæmmer oversættelsen af mål mRNA efter mikroinjektion til et foster på et tidligt udviklingsstadie. En stor svaghed ved morfoinos er, at de er fortyndet som cellerne kløft og generelt mister effektivitet med 72 timer efter-befrugtning (hpf). Mens morfoinos fortsat er et kraftfuldt værktøj til zebrafisk genforstyrrelser, transskription aktivator-lignende effector nucleases (TALENs), zink-finger nucleases (ZFNs), og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromic gentagelser (CRISPRs) er for nylig bruges til direkte at målrette zebrafisk genom2,3. Disse omvendte genetiske strategier, i kombination med fremgenetik og høj gennemløb skærme, har etableret zebrafisk som en kraftfuld model til at studere genekspression og funktion.
Evnen til at studere genfunktion kræver generelt en evaluering af den spatio-tidsmæssige fordeling af gen- eller genproduktekspression. De to mest almindeligt anvendte teknikker til at visualisere sådanne udtryksmønstre under tidlig udvikling er in situ hybridisering (ISH) og hele mount immunhistokemi (IHC). In situ hybridisering blev først udviklet i 1969 og er afhængig af brugen af mærket antisense RNA sonder til at detektere mRNA udtryk i en organisme4. I modsætning hertil anvendes mærkede antistoffer i immunhistokemi til at visualisere proteinekspression. Ideen om mærkning af proteiner til påvisning går tilbage til 1930'erne5 og det første IHC-eksperiment blev offentliggjort i 1941, da FITC-mærkede antistoffer blev brugt til at detektere patogene bakterier i inficeret væv6. ISH og IHC har udviklet sig og forbedret betydeligt i de efterfølgende årtier og anvendes nu begge rutinemæssigt i det molekylære og diagnostiske forskningslaboratorium7,8,9,10,11. Mens begge teknikker har fordele og ulemper, IHC tilbyder flere fordele i forhold til ISH. Praktisk, IHC er langt mindre tidskrævende end ISH og er generelt billigere afhængigt af omkostningerne ved den primære antistof. Desuden er mRNA-udtryk ikke altid en pålidelig metrisk proteinekspression, da det er blevet påvist hos mus og mennesker, at kun omkring en tredjedel af proteintæthedsvariationen kan forklares ved mRNA-tæthed12. Af denne grund, IHC er et vigtigt supplement til at bekræfte ISH data, når det er muligt. Endelig kan IHC levere subcellulære og co-lokaliseringsdata , der ikke kan bestemmes af ISH13,14,15. Her beskriver vi en trinvis metode til pålideligt at opdage proteiner ved immunhistokemi i hele mount zebrafisk embryoner og larver. Formålet med denne teknik er at bestemme det rumlige og tidsmæssige udtryk for et protein af interesse for hele fosteret. Denne teknologi anvender antigenspecifikke primære antistoffer og fluorescerende mærkede sekundære antistoffer. Protokollen kan let tilpasses til brug på glidemonterede vævssektioner og til brug med kromoogenesubstrater i stedet for fluorescens. Ved hjælp af denne protokol, Vi viser, at udvikle zebrafisk skeletmuskulatur udtrykker ionotropic glutamat receptorer, ud over acetylcholin receptorer. NMDA-type glutamat receptor underenheder kan påvises på langsgående muskel på 23 hpf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerne for arbejde med zebrafisk avl voksne og embryoner, der er beskrevet i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Murray State University.
1. Indsamling og fiksering af embryoner
- Forbered gydetanke ved at placere voksne zebrafisk blandet køn par eller grupper i tanke med en maske eller slidset liner fyldt med systemvand natten over.
- Ved lys tændt, ændre gydetank vand til frisk system vand for at fjerne afføring. Brug en 14 h/10 h lys mørk cyklus med lys kommer på kl 9.
- Når æggene er lagt, returnere de voksne til hjem tanke.
- Indsamle æg ved at trække dem op ved hjælp af en overførsel pipet eller hælde dem i en maske si.
- Overfør æggene til petriskåle fyldt halvvejs med embryonmedium (såsom 30% Danieau eller E2 embryo medium med 0,5 mg/ L methylenblåt), hvilket begrænser antallet af embryoner pr. skål til 50.
- Fjern alle æg, der er døde eller undlader at opdele.
BEMÆRK: Døde embryoner kan nemt identificeres, når de bliver uigennemsigtige og ofte vises "overskyet". Hvis methylenblåt tilsættes til embryonmedium, får de døde embryoner et mørkeblåt udseende. - Inkubere æg retter ved 28,5 °C, indtil de når det ønskede trin. Til dette eksperiment hæves embryonerne indtil 23 hkf.
- Valgfrit) Overfør embryonerne ved 24 hkf til 200 μM 1-phenyl 2-thiourea (PTU) i embryomedium for at forhindre melanogenese16,17. Alternativt kan blege embryoner efter fiksering (se valgfri afsnit 5).
- Skift embryo medium eller PTU medium dagligt.
- Dechorionate uudklækkede embryoner ved hjælp af ultra-fine-tip pincet under et stereomikroskop. Alternativt, kemisk dechorionat embryoner ved at inkubere i 1 mg/ml Pronase i embryo medium i flere minutter ved stuetemperatur. Fjern embryonerne fra Pronase og vask tre gange med embryo medium.
- Dechorionated embryoner vil holde sig til plast. Opbevar dem i glas eller plast Petri skåle belagt med 1-2% agarose opløst i embryo medium. Flyt dechorionated embryoner ved hjælp af brand-poleret Pasteur pipetter for at minimere skader.
- Fostrene overføres til 1,5 ml centrifugerør ved hjælp af en plast- eller brandpoleret pipet.
- Fjern embryomedium med en mikropipette. Lad kun nok væske til bare at dække embryonerefter hver væskeændring.
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x fosfat-buffered saltvand (PBS) i en kemisk røg hætte.
FORSIGTIG: PFA er et farligt materiale. Bær handsker og bortskaf forurenede væsker og faste stoffer i udpegede områder. - Fastgør embryonerne i 4% PFA for 1-2 timer med blid rokkende ved stuetemperatur. Alternativt kan embryonerne fastgøres 4 timer til natten ved 4 °C.
- Vask tre gange i 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) i 5 min.
- Brug straks embryonerne eller opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
- Ved langtidsopbevaring skal embryonerne dehydreres i 100 % methanol (MeOH) 2 timer eller natten over ved -20 °C. Embryonerne opbevares ved -20 °C i MeOH i flere måneder.
FORSIGTIG: MeOH er et farligt materiale. Bær handsker og bortskaf forurenede væsker og faste stoffer i udpegede områder.
2. Embryo Forberedelse
- Rehydrere embryonerne gennem serielle inkubationer ved stuetemperatur.
- Inkuberi i 75% MeOH/25% 1x PBS i 5 min, vuggende.
- Inkuberi i 50% MeOH/50% 1x PBS i 5 min, vuggende.
- Inkuberi i 25% MeOH/75% 1x PBS i 5 min, vuggende.
- Inkuberi i 100% PBTriton i 5 min, vuggende.
- (Valgfrit) Der fremstilles en frisk proteinase K-arbejdsopløsning (10 μg/ml i PBTriton) på is ved at tilsætte 10 μL friskoptøet proteinase K-lager (10 mg/ml).
- Gennemtrænge embryonerne ved at fordøje op til 30 min i Proteinase K.
BEMÆRK: Foreslået timing er <24 hpf: ingen fordøjelse; 24 hkf: 15 min fordøjelse; og 7 dage gammel: 30 min fordøjelse. - Skyl permeabiliserede embryoner i PBTriton og re-fix i 4% PFA i 20 min ved stuetemperatur.
- Vask embryonerne tre gange i PBTriton i 5 min ved stuetemperatur med blid vuggende.
- Gennemtrænge embryonerne ved at fordøje op til 30 min i Proteinase K.
3. Primær antistofinkubation
- Vælg en kommerciel blokeringsopløsning eller serum, der matcher de sekundære antistofværtsarter (f.eks. 10 % gedeserum i PBTriton) med eller uden 2 mg/ml kvægserumalbumin (BSA).
- Bloker embryonerne i blokeringsopløsning i 1-3 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C, mens de rokkes.
- Inkuber i primært antistof fortyndet i blokeringsopløsning eller 1% serum i PBTriton natten over ved 4 °C under rokkende. I dette eksperiment var de primære antistoffer, der blev anvendt, anti-NMDAR1, anti-pan-AMPA-receptor og antifosfor-Histone H3, hver fortyndet til en endelig koncentration på 1:500 i 1% gedeserum i PBTriton.
- Vask fem gange i PBTriton i 10 minutter ved stuetemperatur, mens du rokker.
4. Sekundær antistofinkubation
- Vælg et sekundært antistof baseret på værtsarterne i det primære antistof og den ønskede bølgelængde.
- Inkuber i sekundært antistof fortyndet i blokeringsopløsning eller 1% serum i 2 timer ved stuetemperatur (eller natten over ved 4 °C), mens du rokker.
BEMÆRK: Fluorescerende sekundære antistoffer er lysfølsomme. Vi brugte 1:500 ged-anti-mus Alexa488 fortyndet i 1% gedeserum i PBTriton. - Dæk rørene med aluminiumsfolie eller dække med en lys-blokering boks til dette og alle efterfølgende trin.
- Vask tre gange i PBTriton i 10 minutter ved stuetemperatur, mens du rokker.
- Overfør embryonerne til en 50% glycerolopløsning i PBS over en seng på 2% agarose i embryo medium og gå videre til dokumentation eller gå videre til yderligere behandling trin nedenfor.
Valgfrie trin
5. Blegning
- Blegemiddelopløsningen fremstilles i et 1,5 ml rør ved tilsætning af 810,7 μL ddH2O, 89,3 μL 2 M KOH og 100 μL 30% H2O2.
- Inverter røret tre gange for at blande.
- Pipette 1 ml blegemiddelopløsningsretning til embryonerne.
- Åbn embryotubehætten for at tillade gas at slippe ud. Tryk forsigtigt på røret på bænken for at løsne bobler.
- Overvåg blegningsprocessen (brug om nødvendigt et mikroskop) og stop reaktionen, når pigmentet er tilstrækkeligt fjernet (ca. 5 min for 24 hkf eller 10 min for 72 hkf).
- Fjern forsigtigt blegningsopløsningen med en mikropipette og skyl embryoner tre gange i 1 ml PBTriton.
BEMÆRK: Embryoner er klistret i dette trin. - Fortsæt til dokumentation eller yderligere behandling nedenfor.
6. Embryo Dissektion og deyolking
- For at fjerne æggeblomme, overføre en lille mængde (~ 200 μL eller nok til helt at dække fosteret, men restriktivnok til at begrænse, hvor det kan flyde) af 1x PBS til en depression dias eller en almindelig glas dias.
- Brug en plastoverførselspipet til at flytte 1 eller flere embryoner til PBS-dråben.
- Brug ultrafine pincet og 00 insektstifter til at bryde æggeblomme fra hinanden og skænke forsigtigt æggeblommegranulat fra embryoets ventrale overflade (se også Cheng et al., 2014)18.
- Fjern blommegranulat og genopfyld PBS efter behov.
- Gentag indtil fosteret er tilstrækkeligt fri for æggeblomme.
7. Flad montering på slides
- Overfør deyolked embryoner til en opladet glasslide med en plastikpipette eller en 1 ml mikropipette med en trimmet spids (for at reducere forskydningsstress). Orienter som ønsket med en 200 μL mikropipettespids eller insektnål.
- Wick væk overskydende PBS med en Kim tørre eller køkkenrulle.
- Tilføj 2-3 dråber monteringsmedier til diaset og dæksslip.
- Lufttørres i ca. 5 til 10 min.
- Forsegle dækslet glas på diaset med klar neglelak.
BEMÆRK: Dækglassets kanter skal være helt dækket med et tyndt, kontinuerligt lag neglelak. - Lad det tørre ca. 10 minutter før billeddannelse.
8. Montering i Agarose
- Der fremstilles 1 % agarose i embryonmedium ved at tilsætte 0,5 g agarose til 50 ml embryonmedium i en mikrobølgesikker kolbe eller bægerglas med mindst 3 x større volumen end ønsket.
- Varm i en mikrobølgeovn, hvirvlende hver 30 s, indtil agarose er helt opløst.
- Lav 1 ml aliquots i 1,5 ml centrifugerør. Opbevar aliquoterne ved stuetemperatur.
- Dækrørshætter med hættelåse før opvarmning.
- Læg agaroserør i en flydende rørholder i et bægerglas, der er halvt fyldt med vand.
- Mikrobølgeovn bægeret med flydende rør i 2-3 min, eller indtil agarose er helt smeltet.
- Overfør et foster til det broførte dias med en plastikpipette eller en 200 μL mikropipette med en trimmet spids (for at reducere forskydningsstress).
- Placer fosteret på en rektangulær dækslip ved hjælp af insektstifter og tilsæt ca. 20 μL smeltet agarose direkte til fosteret.
- Orienter hurtigt den interesseregion, der er tættest på dæksgningen, ved hjælp af 00 insektnåle.
BEMÆRK: Dette er en opvendt holder. - Returner agaroserøret til varmtvandsrøret flyder mellem hver brug og mikrobølgeovn efter behov.
- Billede ved hjælp af et mikroskop, når agarose hærder. Hold det monterede embryo nup på hovedet til brug på et omvendt mikroskop. Vend dækselover (så agarose er under dæksel) til brug på opretstående mikroskoper.
9. Montering på brodedias
- For at gøre bro dias, lim firkantede coverslips til glasset dias ved hjælp af en lille prik af superlim.
BEMÆRK: Der skal være et trug, der er mindst 5 mm bredt mellem dækslipsene. To #1 coverslips høj er typisk passende for 24-48 hpf embryoner, mens tre coverslips høj kan være nødvendigt for 72 hpf. - Overfør 1-2 deyolked embryoner til den brolagte dias med en plastik pipette eller en 200 μL mikropipette med en trimmet spids (for at reducere forskydning stress).
- Wick væk overskydende væske med en Kim tørre eller køkkenrulle.
- Tilføj en dråbe ≥80% glycerol direkte til fosteret.
- Dæk med rektangulært dækselglas. Dråbe glycerol en snu ræs ning sglas.
- Tilføj mere glycerol til rummet mellem dækslet glas og dias efter behov for helt at dække fosteret med en margen af glycerol på siderne af fosteret.
- Skub det rektangulære dækglas forsigtigt for at rulle fosteret på plads til billeddannelse.
10. DAB-farvning
BEMÆRK: Dette afsnit begynder efter trin 4.2 ovenfor og erstatter resten af trin 4.
- Inkuber embryonerne i en blokerende opløsning med et peroxidasekonjugeret sekundært antistof i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C, mens de rokker.
- Vask tre gange i PBTriton i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør embryonerne til en kulturplade eller depressionsrutsjebane med en overførselspipette.
- Bland 50 μL 1% DAB (3,3'-diaminobenzidin) opløst i ddH2O og 50 μL 0,3% hydrogenperoxid og bring til 1 ml med PBS.
FORSIGTIG: DAB er et farligt materiale. Bær handsker og bortskaf DAB forurenede væsker og faste stoffer i udpegede områder. - Dæk HRP-farvede embryoner med DAB-opløsningen forberedt ovenfor og skærm til farveudvikling (typisk 1-5 min) under et mikroskop.
- Efter at have nået det ønskede niveau af farveudvikling, skyl embryonerne kortvarigt i PBS.
- Fostrene overføres til et 1,5 ml rør før fiksering.
- Ret embryonerne igen i 15-20 min i 4% PFA ved stuetemperatur.
- Embryonerne vaskes tre gange i PBTriton i 5 min.
- Fortsæt til dokumentation.
11. Ændret protokol for farvning sektionsopdeltvæv, der er monteret på Slides
- Omcirkel væv, der skal farves med en pap pen.
- Overfør rutsjebanerne til et fugtigt kammer.
- Tilføj 1 mlPBS direkte til sliden.
- Inkuber7 min ved stuetemperatur for at fjerne indlejringsmedium.
- Hæld PBS af ved at vende diaset.
- Rehydrere 1 min i op til 1 ml TNT buffer (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
- Bloker i op til 1 ml blokeringsopløsning (kommercielt eller 10% serum + 2% BSA) i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkubernatten i primært antistof fortyndet i 1% serum eller blokerende opløsning ved 4 °C.
- Vask fem gange i op til 1 ml TNT-buffer ved stuetemperatur.
- Inkuber i sekundært antistof i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C. Dæk kammeret med folie eller brug et mørkt låg.
- Vask fem gange i TNT ved stuetemperatur. Hæld sidste vask af.
- Monter med 2-3 dråber monteringsmedium og dæksel. Lad sidde 5-10 min.
- Forsegle dækslet glas på diaset ved hjælp af klar neglelak. Lad det tørre helt før billeddannelse.
12. Dokumentation
- Registrer den fulde procedure og eventuelle afvigelser i en laboratorienotesbog.
- Registrer koncentrationen, navnet, katalognummeret, producenten og lotnummeret på det primære antistof.
- Anbring en passende monteret prøve på mikroskopstadiet. Find interesseområdet.
- Vælg et relativt lyst eksempel. Indstil kameraeksponering og forstærkning, så signalet er tilstrækkeligt lyst uden at mætte.
- Sammenlign farvningsintensiteten for samme interesseregion ved hjælp af de samme eksponeringsindstillinger, når der sammenlignes mellem eksperimentelle antistofmærkede embryoner og kontrolantistof (f.eks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele mount immunhistokemi bruger antistoffer til at detektere det rumlige mønster af protein udtryk i intakt e-dyr. Den grundlæggende arbejdsgang for immunhistokemi (afbildet i figur 1) omfatter avl af zebrafisk, opdræt og forberedelse af embryoner, blokering af ikke-specifikke antigener, brug af et antigenspecifikt primært antistof til at målrette proteinet af interesse, detektere, at primære antistof med et mærket sekundært antistof, montering af prøven og dokumentationsudtryk.
Hele mount immunhistokemi er et værdifuldt redskab til studiet af rumlige og tidsmæssige protein udtryk under zebrafisk udvikling. Zebrafisk udviser spontane sammentrækninger medieret af mellemrumskryds, der begynder ved før 19 hkf - før motorneuronkontakt19. Zebrafisk neuromuskulære kryds, ligesom andre hvirveldyr, medieres af acetylcholin handler på nikotin acetylcholin receptorer. Disse samlede receptorer er først opdaget på ca 16 hpf og udtryk udvider og remodels som neuroner danne kontakter20. Undersøgelser i frøer21 og rotter22 tyder på, at skeletmuskulaturen af hvirveldyr også kan udtrykke ionotropic glutamat receptorer. Hele mount immunhistokemi for GluN1 subunit af NMDA-type glutamat receptor afslører udtryk for glutamat receptor underenheder under udvikling zebrafisk muskel på 23 hkf (Figur 2). Dette svarer omtrent med timingen af motorneuron innervation. Udtrykket blev sammenlignet med ingen primære kontrolembryoner til bestemmelse af fiskens og det sekundære antistofs baggrundsfluorescens og med en IgG med 2 μg/ml mus for at bestemme de relative bidrag fra uspecifik antigenbinding. AMPA type glutamat receptorer blev ikke opdaget i musklerne på dette stadium af udviklingen. Antistofkoncentrationer er anført i tabel 1. For at generere disse billeder blev disse embryoner behandlet som beskrevet i denne protokol uden nogen af de valgfrie trin bortset fra deyolking. Embryonerne var fladmonterede og beslagne (figur 3B).
Dividere celler udtrykke forskellige histone ændringer fra quiescent celler, der kan påvises ved immunhistokemi ved hjælp af antistoffer, der genkender specifikke ændringer, såsom protein fosforylering. Fosforylering af histone 3 ved serin 10 er forbundet med celledeling23. De ændringer, der præsenteres for denne protokol til tilpasning af immunhistokemi til sektionsopdelt væv, der er monteret på dias blev brugt til at opdage prolifererende celler i larve zebrafisk hjernen. Frosne dele af 72 hkf embryoner blev monteret på dias og immunplettet for p-H3 (figur 4). Flere celler udtrykker p-H3, og udtryk er mest bemærkelsesværdigt på ventrikelzonerne. Udtrykket blev sammenlignet med ingen primære kontrolembryoner og med en 2 μg/ml mus IgG for at bestemme de relative bidrag fra uspecifik antigenbinding.
| Antistof | Mål | Koncentration |
| Kontrolelement til muse-IgG-isotype | Ikke-specifikke antigener | 2 μg/ml |
| Mus anti-NMDAR1 | GluN1-underenhed | 1:1,000 |
| Ged anti-mus Alexa488 | Muse-IgG | 1:500 |
| Mus Anti-fosfor-H3 | phosphorylated Histone H3 | 1:500 |
| Mus Anti-pan-AMPA receptor | GluR1-4 | 1:500 |
Tabel 1: Liste over anvendte antistoffer og koncentrationer.
Figur 1: Rutediagram over hele mount immunhistokemi procedure. Den grundlæggende arbejdsgang for proceduren er at avle fisk; indsamle og forberede embryoner blokere ikke-specifikke antigener inkubere i primære og sekundære antistoffer i serier mount væv; og dokument. Valgfrie trin angives med små pile på det relevante punkt i arbejdsprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Larver skematisk og NMDA receptor IHC repræsentative resultater. Brugen af hele mount immunhistokemi testet glutamat receptor udtryk i udviklingen af muskler. Orienteringog interesseregion på 23 hkf er angivet. Intet signal kunne detekterbare, når primære antistoffer ikke blev medtaget. Muse-IgG-kontrolantistof viser det lave ikke-specifikke udtryk. GluN1-underenhed af nmda-typen glutamatreceptoren (NMDAR) udtrykkes på tværs af de udviklende muskler med højere koncentrationer ved somitgrænser (pilespidser). AMPA-type glutamat receptorer (AMPAR) er ikke udtrykt på nuværende tidspunkt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skema af monteringsordninger. (A) Et foster sænket i 50% glycerol kan nemt flyttes. (b) Et foster, der er fladt monteret på et dias i monteringsmedium, kan bevares og afbildes på et senere tidspunkt. C) Et embryon monteret i en dråbe på 1% agarose kan fastsættes i stand til at se en vanskelig region. (D) Et foster monteret i glycerol på en brodias kan rulles og flyttes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af IHC i sektionsopdelt væv. Ved hjælp af protokollen ændringer i de valgfrie trin, immunhistokemi testet for prolifererende celler i zebrafisk larve hjernen på 72 hkf. Muse-IgG-kontrolantistof og undtagen primære antistoffer afslører et lavt niveau af ikke-specifikt udtryk. Som en markør for spredning af celler udtrykkes p-H3 på diskrete steder, herunder ventrikelzonerne (pilespids). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunhistokemi er et alsidigt værktøj, der kan bruges til at karakterisere spatio-tidsmæssige udtryk for stort set ethvert protein af interesse i en organisme. Immunhistokemi anvendes på en bred vifte af væv og model organismer. Denne protokol er optimeret til brug i zebrafisk. Immunhistokemi hos forskellige arter kan kræve forskellige fikserings- og håndteringsteknikker, blokeringsopløsninger afhængigt af arter og tilstedeværelsen af endogenperoxidaser og inkubationstider på grund af vævs tykkelse og sammensætning. IHC i zebrafisk har været en integreret del i at fremme vores forståelse af kræft24, metabolisk sygdom25, neurologiske lidelser26, og mange andre områder af stor relevans for menneskers sundhed. En stor fordel for IHC er, at proceduren er forholdsvis kort i forhold til andre teknikker såsom ISH og ikke er teknisk krævende. Der er dog mange trin, der kræver optimering baseret på prøvernes alder, at antigenet målrettes, og de antistoffer, der anvendes.
Varigheden af flere trin i denne protokol er fleksibel. Varigheder, der gives for fleksible trin som nævnt, repræsenterer minimale tider, der generelt kræves. Når embryoner vaskes tre eller flere gange i PBTriton, kan de generelt opbevares natten over ved 4 °C i sidste vask, hvis det er nødvendigt. Permeabiliserings- og fikseringstider er mindre fleksible og bør kun justeres med bevidst hensigt som led i en fejlfindingsstrategi. Vi bemærkede flere punkter i protokollen, der er valgfrie for at vise, hvordan disse trin kan integreres i arbejdsgangen, som det er eksperimentelt relevant. For eksempel, hvis pigmentering forstyrrer signaldetektering, forhindre melanogense ved PTU behandling eller blege middelmiddel faste embryoner. Blegning kan beskadige væv, så der skal udvises forsigtighed for at minimere den tid, embryoner tilbringer i blegemiddel. Blegning kan dog være at foretrække frem for PTU-behandling, som kan påvirke visse aspekter af udviklingen27,28,29,30. Vi præsenterer også muligheder for fluorescerende og kromotisk detektion. Hvis fluorescens ikke ønskes, eller hvis antigenet frembringer et signal, der er for svagt til at blive påvist tilstrækkeligt ved fluorescensmikroskopi, kan kromogen påvisning opnås ved hjælp af en peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret antistof og DAB.
Den største udfordring af IHC i zebrafisk er at finde egnede antistoffer. Faktisk er ISH ofte bruges som en proxy for protein udtryk, når kommercielle antistoffer ikke er tilgængelige for det ønskede protein af interesse. Mange kommercielle antistoffer er designet til at målrette pattedyr mål og epitoper er ikke altid bevaret i zebrafisk. Når det er tilgængeligt, skal du vælge kommercielt tilgængelige antistoffer, der er blevet testet i zebrafisk. Vi har konstateret, at antistoffer, der genkender antigener, der er > 80% bevaret mellem zebrafisk og målarter generelt arbejder i zebrafisk. Vi har også konstateret, at antistoffer, der påvises at arbejde hos enten fugle og/eller padder ud over pattedyr generelt også arbejder i zebrafisk, selv når effekten hos zebrafisk ikke er blevet testet. Typisk, polyklonale antistoffer udviklet mod et pattedyr antigen er mere tilbøjelige til at opdage zebrafisk homologer end monoklonale antistoffer på grund af deres lavere specificitet. Når du tester et nyt antistof, er det gavnligt at køre et positivt kontroleksperiment ved hjælp af et krydsforbundet målpeptid, pattedyrvæv eller celler, der er kendt for at udtrykke proteinet, eller celler, der udtrykker en reporterkonstruktion. Antistoffer kan også testes med western blot for at kontrollere størrelsen af målantigenet.
Mens de fleste kommercielle antistoffer giver en foreslået fortynding rækkevidde for IHC, er det vigtigt at empirisk bestemme fortynding, der fungerer bedst. Antistofkoncentrationer, der er for høje, resulterer ofte i ikke-specifik farvning og øget baggrund, mens for lidt antistof ikke giver et mærkbart signal. Afhængigt af antistoffet og antigenet kan det være en fordel først at gennemtrænge embryonerne som beskrevet i trin 3.2 ovenfor, men dette trin er måske ikke nødvendigt og kan i nogle tilfælde resultere i reduceret signal. Denne protokol bruger Triton-X-100 som et vaskemiddel, der permeabilizes celler, som kan være tilstrækkelig til tyndt væv eller overfladisk udtryk. Dybt eller tykt væv, såsom dybe hjerneregioner eller ældre larver, kan kræve proteinase permeabilisering. Omvendt bør Triton-X-100 udelukkes fra alle trin, når der ønskes immunfarvning af proteiner på celleoverfladen frem for mærkning af intracellulære proteiner. Varigheden af blokeringstrinnet samt valget af en kommerciel blokeringsopløsning versus brug af serum og BSA kan også justeres, så det er korrekt for antistoffølsomhed og baggrundsfarvning. Høje koncentrationer af serum, der anvendes til blokering (10% i denne protokol) kan reducere baggrundsfarvning, men bør fortyndes, når antistof er til stede for at minimere maskering antistof bindingssteder. Plantebaserede blokeringsløsninger kan være gavnlige, hvis baggrundssignalet konsekvent er højt, selv ved lav antistoffortynding (<1:1.000). Endelig kan følsomhed finjusteres af vaskernes stringens. Det kan være nødvendigt at øge eller nedsætte varigheden af post-antistof vask trin samt justere mængden af Triton-X-100 i PBTriton. Typiske arbejdsområder af PBTriton spænder 0,2% til 1,0% Triton-X-100. Det er god praksis, når du bruger et nyt antistof til at plette negative kontrol embryoner med primære IgG og mærket sekundære antistoffer til at bestemme antistof specificitet og identificere potentielle falske positive signaler.
Hvis antistofoptimering ikke giver et positivt signal, kan det skyldes den fiksativ maskering af antigenet. Generelt maskerer fiksering i PFA på 4 % ikke antigensteder for at forhindre antistofbinding, selv om antigenmaskering af og til forekommer med visse antistoffer. Antigenudtagning kan medføre beskadigelse af fosteret, men en arbejdsprotokol er beskrevet af Inoue og Wittbrodt31. Alternativt, hvis det valgte antistof er uforeneligt med 4% PFA, eller hvis PFA resulterer i cellulære morfologi ændringer, methanol, 2% trichloreddikesyre, eller glyoaxal kan bruges til at fastsætte prøverne27. Et antistofs kompatibilitet med formaldehydfiksering skal bestemmes empirisk. Hvis der ikke kan opnås et positivt kontrolsignal efter PFA-fiksering, kan det være værd at prøve et alternativt fiksativt som f.eks. Alternative fikseringsprotokoller kan også være nødvendige for primære antistoffer, der er opdrættet mod konjugerede antigener (f.eks.
Der er flere effektive muligheder for montering immunplettede zebrafisk embryoner til billeddannelse. Embryoner kan overføres til en petriskål af glycerol, placeret med stifter eller pincet, og afbildet enten med en widefield udsigt ovenfra eller nedefra billeddannelse gennem skålen med en omvendt mikroskop (Figur 3A). Denne metode er enkel, hurtig og midlertidig. Ulemper omfatter tilbøjelighed til embryoner til at rulle ud af fokus i væsken glycerol, potentielle refleksioner fra overfladen af glycerol i skålen, og vanskeligheden ved billeddannelse gennem den tykke skål. Embryoner kan monteres fladt på glassider(Figur 3B)med monteringsmedium, dækslips og neglelak. Disse mounts kan ses på et opretstående eller omvendt mikroskop. Embryoner, der fremstilles på denne måde, kan tilberedes i forvejen, og de dias, der opbevares ved 4 °C, indtil de billeddannelser eller kan opbevares og nybilledets senere. Dette kan især være fordelagtigt, når billedtiden er begrænset. Ulemperne ved dette beslag omfatter de begrænsede muligheder for embryo position og væv tykkelse, og den manglende evne til at flytte eller inddrive embryoner. Embryoner monteret på denne måde ofte brug for deyolking, som æggeblomme granulat er autofluorescerende i mest almindeligt anvendte fluorescens kanaler og kan ikke flyttes eller fjernes efter montering. Når interesseregionen kræver vanskelig placering af fosteret, kan det være mest fordelagtigt at montere embryonerne i 1% agarose på et dækglas (figur 3C). Fosteret kan holdes i position med insektstifter med den region af interesse tættest på dækglasset, indtil agarose køler. Agarose vil holde fosteret på plads uden embryodet rullende i mindst flere minutter. Agarose montering er bedst til inverterede mikroskoper, selvom dækslet glas kan vendes omhyggeligt til brug på en opretstående mikroskop. Denne holder kan være tidskrævende og embryoner er generelt ikke repositionable eller inddrives. Montering af embryoner på brodias(figur 3D)giver lidt af et kompromis mellem disse metoder. Den bromonterede mount er hurtig, og embryoner kan flyttes og inddrives. Højden af broen kan give større fleksibilitet i vævtykkelse og embryo position end flade mounts, samtidig med at evnen til at billedet fra oven eller under. Denne metode kræver forberedelse af brodiasene i forvejen. Tykkelsen af det væv, der skal monteres dikterer, hvor mange coverslips høj broen skal være. Brode dias kan genbruges flere gange for en dag, men bør bortskaffes efter billedbehandling session, fordi glycerol er vanskeligt at rense ud for dias, og det vil langsomt løsne limen holder broen.
IHC er en effektiv metode til bestemmelse af timingen og mønsteret af protein udtryk i en organisme eller væv. IHC har flere fordele i forhold til ISH i det er relativt lave omkostninger og kan udfyldes i en brøkdel af den tid, der typisk er nødvendig for ISH (2-3 dage versus 5-8 dage). Desuden er IHC en bedre indikator for genproduktekspression, da påvisning af mRNA-niveauer ikke forudsiger posttransktionelle og posttranslationelle processer, der kan påvirke proteinekspressionen. IHC er også i stand til at levere subcellulære lokaliseringsdata (selv om dette ikke er tilfældet, når du bruger DAB farvning), som ikke er fastsat af ISH. Det er muligt at udføre en dobbelt ISH / IHC i zebrafisk.
IHC har også nogle ulemper, først og fremmest blandt dem er antistof tilgængelighed. Mens der er mange antistoffer til rådighed, der er af passende kvalitet for IHC, at finde antistoffer, der specifikt arbejder i zebrafisk er mere udfordrende og ofte kræver test og fejlfinding antistoffer genereret mod pattedyr antigener. Der er imidlertid et stigende antal zebrafisk validerede antistoffer på markedet, og fremkomsten af CRISPR/Cas9-teknologi har gjort det muligt at epitope tag endogene proteiner gennem genomteknik. Disse processer er tidskrævende og udfordrende, dog, og kræver validering af protein funktion.
Den protokol, der er beskrevet i denne rapport, kan anvendes bredt på zebrafiskembryoner og -larver på ethvert tidspunkt og kan også anvendes på væv fra voksne dyr. Desuden giver denne protokol også mulighed for farvning af frosne eller paraffinsektionerede prøver med ringe ændring. Hele mount immunhistokemi blev brugt til at undersøge neurotransmitter receptor populationer i muskel, afslørende udtryk for ionotropic NMDA glutamat receptor obligatorisk subunit 1 i udviklingen zebrafisk muskel. Denne ret udbredte og diffuse farvning på tværs af de udviklende muskler er i overensstemmelse med den udviklingsmæssige udtryk for den samme receptor underenhed i udviklingen af Xenopus larver21. Dette tyder på, at udtrykket af glutamat receptorer i udviklingen af muskler er evolutionært bevaret. Alt i alt er denne protokol værdifuld for at få en bedre forståelse af genekspression gennem brug af IHC og giver et effektivt værktøj til bestemmelse af spatio-tidsmæssige fordeling af protein ekspression i zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger at videregive.
Acknowledgments
Finansiering fra NIH tilskud 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
References
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J.
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
