Summary
Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.
Abstract
Immunohistochemie is een veel gebruikte techniek om eiwitexpressie en lokalisatie te verkennen tijdens zowel normale ontwikkelings- als ziektetoestanden. Hoewel veel immunohistochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor weefsel- en weefselsecties van zoogdieren, vereisen deze protocollen vaak modificatie en optimalisatie voor niet-zoogdiermodelorganismen. Zebravissen worden steeds vaker gebruikt als een modelsysteem in fundamenteel, biomedisch en translationeel onderzoek om de moleculaire, genetische en celbiologische mechanismen van ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Zebravissen bieden veel voordelen als modelsysteem, maar vereisen ook aangepaste technieken voor optimale eiwitdetectie. Hier bieden we ons protocol voor de gehele mount fluorescentie immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven. Dit protocol beschrijft bovendien verschillende montagestrategieën die kunnen worden gebruikt en een overzicht van de voor- en nadelen die elke strategie biedt. We beschrijven ook wijzigingen in dit protocol om detectie van chromogene substraten in hele mountweefsel en fluorescentiedetectie in gesectioneerd larveweefsel mogelijk te maken. Dit protocol is in grote lijnen van toepassing op de studie van vele ontwikkelingsstadia en embryonale structuren.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) is ontstaan als een krachtig model voor de studie van biologische processen om verschillende redenen, waaronder korte generatie tijd, snelle ontwikkeling, en beaambaarheid aan genetische technieken. Als gevolg hiervan worden zebravissen vaak gebruikt in hoge doorvoer kleine molecuul schermen voor toxicologisch onderzoek en drugs ontdekking. Zebravissen zijn ook een aantrekkelijk model voor de studie van ontwikkelingsprocessen, aangezien één vrouwtje routinematig 50-300 eieren tegelijk kan produceren en de optisch heldere embryo's zich extern ontwikkelen, waardoor ontwikkelingsprocessen efficiënt kunnen worden gevisualerd. Echter, vroeg onderzoek baseerde zich meestal op voorwaartse genetische schermen met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of andere mutageens als gevolg van uitdagingen bij het vaststellen van omgekeerde genetische technieken. Ongeveer twee decennia geleden werden morpholinos voor het eerst gebruikt bij zebravissen om gerichte genen neer te halen1. Morpholinos zijn kleine antisense oligonucleotiden die de vertaling van doelmRNA remmen na micro-injectie in een embryo in een vroeg ontwikkelingsstadium. Een grote zwakte van morpholinos is dat ze worden verdund als de cellen te verdelen en over het algemeen verliezen effectiviteit door 72 uur na de bevruchting (hpf). Terwijl morpholinos een krachtig instrument blijven voor verstoring van het zebravisgen, worden transcriptionor-achtige effector nucleases (TALENs), zink-vinger nucleases (ZFNs), en geclusterd regelmatig interspaced korte palindromic herhalingen (CRISPRs) meer recent gebruikt om direct gericht op de zebravis genoom2,3. Deze omgekeerde genetische strategieën, in combinatie met voorwaartse genetica en hoge doorvoerschermen, hebben de zebravissen vastgesteld als een krachtig model om genexpressie en functie te bestuderen.
De capaciteit om genfunctie te bestuderen vereist over het algemeen een evaluatie van de spatio-tijdelijke distributie van gen of genproductuitdrukking. De twee meest gebruikte technieken om dergelijke expressiepatronen te visualiseren tijdens de vroege ontwikkeling zijn in situ hybridisatie (ISH) en hele mount immunohistochemie (IHC). In situ hybridisatie werd voor het eerst ontwikkeld in 1969 en is gebaseerd op het gebruik van gelabelde antisense RNA sondes om mRNA expressie in een organisme te detecteren4. In tegenstelling, gelabelde antilichamen worden gebruikt in immunohistochemie om eiwitexpressie te visualiseren. Het idee van het etiketteren van eiwitten voor detectie dateert uit de jaren 19305 en de eerste IHC experiment werd gepubliceerd in 1941 toen FITC-gelabelde antilichamen werden gebruikt om pathogene bacteriën in geïnfecteerde weefsels op te sporen6. ISH en IHC zijn in de daaropvolgende decennia sterk geëvolueerd en verbeterd en worden nu zowel routinematig gebruikt in het moleculaire en diagnostische onderzoekslaboratorium7,8,9,10,11. Hoewel beide technieken voor- en nadelen hebben, biedt IHC verschillende voordelen ten opzichte van ISH. Praktisch, IHC is veel minder tijdrovend dan ISH en is over het algemeen minder duur, afhankelijk van de kosten van de primaire antilichaam. Bovendien, mRNA expressie is niet altijd een betrouwbare metrische van eiwitexpressie als het is aangetoond bij muizen en mensen dat slechts ongeveer een derde van de eiwit overvloed variatie kan worden verklaard door mRNA overvloed12. Om deze reden is IHC een belangrijk supplement om ISH-gegevens te bevestigen, indien mogelijk. Ten slotte kan IHC subcellulaire en co-lokalisatiegegevens verstrekken die niet kunnen worden bepaald door ISH13,14,15. Hier beschrijven we een stapsgewijze methode om eiwitten betrouwbaar te detecteren door immunohistochemie in hele mount zebravisembryo's en larven. Het doel van deze techniek is het bepalen van de ruimtelijke en temporele expressie van een eiwit van belang in het hele embryo. Deze technologie maakt gebruik van antigeenspecifieke primaire antilichamen en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. Het protocol is gemakkelijk aan te passen aan gebruik op dia-gemonteerde weefselsecties en voor gebruik met chromogene substraten in plaats van fluorescentie. Met behulp van dit protocol, we aantonen dat de ontwikkeling van zebravissen skeletspier drukt ionotropische glutamaat receptoren, in aanvulling op acetylcholine receptoren. NMDA-type glutamaat receptor subunits zijn detecteerbaar op de longitudinale spier op 23 pkf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedures voor het werken met zebravis fokken volwassenen en embryo's beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Murray State University.
1. Embryoverzameling en fixatie
- Bereid paaitanks voor door volwassen zebravis gemengde seksparen of groepen in tanks te plaatsen met een gaas of sleuvenvoering gevuld met systeemwater 's nachts.
- Bij lichten aan, verander de paaitank water voor vers systeemwater om uitwerpselen te verwijderen. Gebruik een 14 h/10 h lichte donkere cyclus met lichten die aangaan om 9 uur.
- Zodra eieren zijn gelegd, terug te keren de volwassenen naar huis tanks.
- Verzamel eieren door ze op te maken met behulp van een transfer pipet of gieten ze in een mesh zeef.
- Breng de eieren over naar petrischaaltjes die halverwege met embryomedium zijn gevuld (zoals 30% Danieau of E2-embryomedium met 0,5 mg/L methyleenblauw), waardoor het aantal embryo's per schotel wordt beperkt tot 50.
- Verwijder alle eieren die dood zijn of niet te verdelen.
OPMERKING: Dode embryo's kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als ze ondoorzichtig worden en vaak "troebel" lijken. Als methyleenblauw aan embryomedium wordt toegevoegd, krijgen de dode embryo's een donkerblauw uiterlijk. - Broed gerechten van eieren bij 28,5 °C tot ze het gewenste stadium bereiken. Voor dit experiment, verhogen van de embryo's tot 23 pkf.
- Optioneel) Breng de embryo's op 24 pk fin naar 200 μM 1-fenyl 2-thiourea (PTU) in embryomedium om melanogenese16,17te voorkomen . Als alternatief bleekmiddelen na fixatie (zie optioneel punt 5).
- Verander embryo medium of PTU medium per dag.
- Dechorionate onuitgebroede embryo's met behulp van ultra-fijne-tip tangen onder een stereomicroscoop. Als alternatief, chemisch dechorionate embryo's door uitte broeden in 1 mg/mL Pronase in embryo medium gedurende enkele minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de embryo's uit Pronase en was drie keer met embryomedium.
- Gedechorionated embryo's blijven bij plastic. Bewaar ze in glas of plastic petrischaaltjes bedekt met 1-2% agarose opgelost in embryomedium. Verplaats gedechorionated embryo's met behulp van brandgepolijste Pasteur pipten om schade te minimaliseren.
- Breng de embryo's over op centrifugebuizen van 1,5 mL met behulp van een plastic of brandgepolijste pipet.
- Verwijder embryomedium met een micropipet. Laat alleen genoeg vloeistof om alleen de embryo's te dekken na elke vloeistofverandering.
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een chemische rookkap.
LET OP: PFA is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden. - Bevestig de embryo's in 4% PFA voor 1-2 uur met zacht schommelen bij kamertemperatuur. U ook de embryo's 4 uur vastzetten tot 's nachts bij 4 °C.
- Was drie keer in 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) gedurende 5 min.
- Gebruik de embryo's onmiddellijk of bewaar maximaal 1 week op 4 °C.
- Voor langdurige opslag dehydrateert u de embryo's in 100% methanol (MeOH) 2 uur of 's nachts bij -20 °C. Bewaar de embryo's enkele maanden op -20 °C in MeOH.
LET OP: MeOH is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden.
2. Embryopreparaat
- Rehydrateer de embryo's door middel van seriële incubatie bij kamertemperatuur.
- Incubeer in 75% MeOH/25% 1x PBS voor 5 min, rocken.
- Incubeer in 50% MeOH/50% 1x PBS voor 5 min, rocken.
- Incubeer in 25% MeOH/75% 1x PBS voor 5 min, rocken.
- Incubeer in 100% PBTriton voor 5 min, rocken.
- (Optioneel) Bereid een verse eiwitase K-werkoplossing (10 μg/mL in PBTriton) op ijs door 10 μL vers ontdooide eiwitase K-bouillon (10 mg/mL) toe te voegen.
- Permeabilize de embryo's door tot 30 min te verteren in Proteinase K.
LET OP: Voorgestelde timing is <24 pkf: geen spijsvertering; 24 pkf: 15 min spijsvertering; en 7 dagen oud: 30 min spijsvertering. - Spoel gepermeabiliseerde embryo's in PBTriton en bevestig in 4% PFA gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Was de embryo's drie keer in PBTriton gedurende 5 min op kamertemperatuur met zacht schommelen.
- Permeabilize de embryo's door tot 30 min te verteren in Proteinase K.
3. Primaire antilichaam incubatie
- Selecteer een commerciële blokkeringsoplossing of serum dat overeenkomt met de secundaire antilichaamgastheersoorten (bijvoorbeeld 10% geitenserum in PBTriton) met of zonder 2 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA).
- Blokkeer de embryo's in blokkerende oplossing voor 1-3 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen.
- Incubeer in primair antilichaam verdund in blokkerende oplossing of 1% serum in PBTriton 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen. In dit experiment, de primaire antilichamen gebruikt waren anti-NMDAR1, anti-pan-AMPA receptor, en anti-fosfo-Histone H3, elk verdund tot een laatste concentratie van 1:500 in 1% geit serum in PBTriton.
- Was vijf keer in PBTriton gedurende 10 minuten op kamertemperatuur tijdens het schommelen.
4. Secundaire antilichaam incubatie
- Selecteer een secundair antilichaam op basis van de gastheersoorten van het primaire antilichaam en de gewenste golflengte.
- Incubeer in secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing of 1% serum gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (of 's nachts bij 4 °C) tijdens het schommelen.
OPMERKING: Fluorescerende secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. We gebruikten 1:500 geit-anti-muis Alexa488 verdund in 1% geitenserum in PBTriton. - Bedek de buizen met aluminiumfolie of bedek met een lichtblokkerende doos voor deze en alle volgende stappen.
- Was drie keer in PBTriton gedurende 10 min op kamertemperatuur tijdens het schommelen.
- Breng de embryo's over naar een 50% glyceroloplossing in PBS over een bed van 2% agarose in embryomedium en ga verder naar documentatie of ga verder naar verdere verwerkingsstappen hieronder.
Optionele stappen
5. Bleken
- Bereid bleekoplossing in een buis van 1,5 mL voor door 810,7 μL ddH2O, 89,3 μL van 2 M KOH en 100 μL van 30% H2O2toe te voegen.
- Omkeren van de buis drie keer te mengen.
- Pipetteer 1 mL bleekoplossing richting aan de embryo's.
- Open de embryobuisdop om gas te laten ontsnappen. Tik voorzichtig op de buis op de bank om bubbels los te maken.
- Monitor het bleekproces (gebruik indien nodig een microscoop) en stop de reactie wanneer pigment voldoende wordt verwijderd (ongeveer 5 min voor 24 pk f of 10 min voor 72 pkf).
- Verwijder de bleekoplossing voorzichtig met een micropipet en spoel embryo's drie keer in 1 mL PBTriton.
LET OP: Embryo's zijn plakkerig in deze stap. - Ga hieronder verder naar documentatie of verdere verwerkingsstappen.
6. Embryodissectie en Deyolking
- Om de dooier te verwijderen, breng je een kleine hoeveelheid (~ 200 μL of genoeg om het embryo volledig te bedekken, maar beperkend genoeg om te beperken waar het kan zweven) van 1x PBS naar een depressieglijbaan of een gewone glazen glijbaan.
- Gebruik een plastic overdracht pipet om 1 of meer embryo's te verplaatsen naar de PBS druppel.
- Gebruik ultrafijne tangen en 00 insectenpennen om de dooier uit elkaar te halen en heel voorzichtig dooierkorrels van het ventrale oppervlak van het embryo te schrapen (zie ook Cheng et al., 2014)18.
- Verwijder dooierkorrels en vul PBS indien nodig aan.
- Herhaal dit totdat het embryo voldoende vrij is van dooier.
7. Vlakke montage op glijbanen
- Breng dedooierembryo's over op een geladen glazen schuif met een plastic pipet of een micropipet te met 1 mL met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen). Oriënteer naar wens met een 200 μL micropipett tip of insectenpin.
- Wick weg overtollige PBS met een Kim doekje of papieren handdoek.
- Voeg 2-3 druppels montagemedium toe aan de glijbaan en de coverslip.
- De lucht droogt ongeveer 5 tot 10 min.
- Sluit het dekselglas op de glijbaan met duidelijke nagellak.
LET OP: De randen van het afdekglas moeten volledig bedekt zijn met een dunne, doorlopende laag nagellak. - Laat ongeveer 10 minuten drogen voordat u beeldgeeft.
8. Montage in Agarose
- Bereid 1% agarose in embryomedium door 0,5 g agarose toe te voegen aan 50 mL embryomedium in een microgolfveilige kolf of beker van ten minste 3x groter volume dan gewenst.
- Verwarm in een magnetron, wervelend om de 30 s, totdat agarose volledig is opgelost.
- Maak 1 mL aliquots in centrifugebuizen van 1,5 mL. Bewaar de aliquots op kamertemperatuur.
- Dek buisdoppen af met dopsloten voor het verwarmen.
- Plaats agarose buizen in een drijvende buis houder in een beker half gevuld met water.
- Magnetron het bekerglas met drijvende buizen voor 2-3 min, of totdat agarose volledig is gesmolten.
- Breng een embryo over op de overbrugde glijbaan met een plastic pipet of een 200 μL micropipette met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen).
- Plaats het embryo op een rechthoekige coverslip met insectenpinnen en voeg ongeveer 20 μL gesmolten agarose direct toe aan het embryo.
- Oriënteer snel de regio van belang het dichtst bij de coverslip met behulp van 00 insecten pinnen.
LET OP: Dit is een omgekeerde mount. - Breng de agarose buis terug naar de warmwaterbuis vlotter tussen elk gebruik en magnetron als dat nodig is.
- Beeld dat een microscoop gebruikt wanneer agarose uithardt. Houd het gemonteerde embryo ondersteboven voor gebruik op een omgekeerde microscoop. Draai de coverslip om (zodat de agarose onder de coverslip ligt) voor gebruik op rechtopstaande microscopen.
9. Montage op overbrugde glijbanen
- Om overbrugde glijbanen te maken, lijm vierkante coverslips aan de glazen glijbaan met behulp van een kleine stip van superlijm.
OPMERKING: Er moet een trog van ten minste 5 mm breed tussen de coverslips. Twee #1 coverslips hoog is meestal geschikt voor 24-48 pkf embryo's, terwijl drie coverslips hoog nodig kan zijn voor 72 pkf. - Breng 1-2 deyolked embryo's over naar de overbrugde glijbaan met een plastic pipet of een 200 μL micropipette met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen).
- Wick weg overtolligvocht met een Kim doekje of papieren handdoek.
- Voeg een daling van ≥80% glycerol direct toe aan het embryo.
- Dek af met een rechthoekig dekselglas. De druppel glycerol moet het dekselglas raken.
- Voeg meer glycerol toe aan de ruimte tussen het dekselglas en de dia als dat nodig is om het embryo volledig te bedekken met een marge van glycerol aan de zijkanten van het embryo.
- Schuif het rechthoekige dekselglas voorzichtig om het embryo in positie te rollen voor beeldvorming.
10. DAB-kleuring
OPMERKING: Deze sectie begint na stap 4.2 hierboven en vervangt de rest van stap 4.
- Bebroed de embryo's in een blokkerende oplossing met een geperoxideerd secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen.
- Was drie keer in PBTriton gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Breng de embryo's over op een kweekplaat of depressieplaat met een transferpipet.
- Meng 50 μL van 1% DAB (3,3'-diaminobenzidine) opgelost in ddH2O en 50 μL van 0,3% waterstofperoxide en breng tot 1 mL met PBS.
LET OP: DAB is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi dab-verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden. - Bedek met HRP bevlekte embryo's met de hierboven opgestelde DAB-oplossing en monitor onder een microscoop op kleurontwikkeling (meestal 1-5 min).
- Na het bereiken van het gewenste niveau van kleurontwikkeling, spoel de embryo's kort in PBS.
- Breng de embryo's terug naar een buis van 1,5 mL voor fixatie.
- Bevestig de embryo's opnieuw voor 15-20 min in 4% PFA bij kamertemperatuur.
- Was de embryo's drie keer in PBTriton gedurende 5 min.
- Ga naar documentatie.
11. Gewijzigd protocol voor kleuring sectioned tissue dat is gemonteerd op dia's
- Omring weefsel om te worden bevlekt met een pap pen.
- Breng de glijbanen naar een vochtige kamer.
- Voeg 1 mL PBS direct toe aan de dia.
- Incubeer 7 min bij kamertemperatuur om inbeddingmedium te verwijderen.
- Giet PBS af door dia om te keren.
- Rehydrateer 1 min in maximaal 1 mL TNT buffer (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
- Blokkeer in maximaal 1 mL blokkeringsoplossing (commercieel of 10% serum + 2% BSA) voor 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer 's nachts in primair antilichaam verdund in 1% serum of blokkeringsoplossing bij 4 °C.
- Was vijf keer in maximaal 1 mL TNT-buffer bij kamertemperatuur.
- Incubeer in secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Bedek de kamer met folie of gebruik een donker deksel.
- Was vijf keer in TNT bij kamertemperatuur. Giet de laatste wasaf.
- Monteer met 2-3 druppels montagemedium en coverslip. Laat 5-10 min zitten.
- Sluit het dekselglas op de glijbaan met behulp van duidelijke nagellak. Laat volledig drogen voordat beeldvorming.
12. Documentatie
- Neem de volledige procedure en eventuele afwijkingen op in een labnotebook.
- Neem de concentratie, naam, catalogusnummer, fabrikant en lotnummer van het primaire antilichaam op.
- Plaats de juiste gemonteerde monster op de microscoop fase. Zoek de regio van belang.
- Selecteer een relatief helder voorbeeld. Stel camerabelichting in en gain, zodat het signaal voldoende helder is zonder te verzadigen.
- Vergelijk de kleurintensiteit van dezelfde interesseregio met dezelfde blootstellingsinstellingen wanneer u vergelijkt tussen experimentele embryo's met antilichamen en controleantilichamen (ex. IgG) embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele mount immunohistochemie maakt gebruik van antilichamen om het ruimtelijke patroon van eiwitexpressie in het intacte dier te detecteren. De basisworkflow van immunohistochemie (afgebeeld in figuur 1)omvat het fokken van zebravis, het kweken en voorbereiden van embryo's, het blokkeren van niet-specifieke antigenen, het gebruik van een antigeenspecifiek primair antilichaam om het eiwit van belang te targeten, dat primaire antilichaam op te sporen met een gelabeld secundair antilichaam, het monteren van het monster en het documenteren van expressie.
Hele mount immunohistochemie is een waardevol instrument voor de studie van ruimtelijke en temporele eiwitexpressie tijdens de ontwikkeling van zebravissen. Zebravissen vertonen spontane samentrekkingen bemiddeld door gap knooppunten vanaf vóór 19 pkf - vóór motorneuron contact19. De zebravis neuromusculaire kruising, net als andere gewervelde dieren, wordt bemiddeld door acetylcholine die optreedt bij nicotinische acetylcholine receptoren. Deze geassembleerde receptoren worden eerst gedetecteerd bij ongeveer 16 pkf en expressie breidt uit en remodels als neuronen vormen contacten20. Studies bij kikkers21 en ratten22 suggereren dat de skeletspier van gewervelde dieren ook ionotropische glutamaatreceptoren kan uitdrukken. Hele mount immunohistochemie voor de GluN1 subeenheid van de NMDA-type glutamaat receptor onthult expressie van glutamaat receptor subunits tijdens de ontwikkeling van zebravissen spier op 23 hpf (Figuur 2). Dit beantwoordt ongeveer met de timing van motorneuron innervation. Expressie werd vergeleken met geen primaire controle embryo's om de achtergrond fluorescentie van de vis en het secundaire antilichaam te bepalen en een 2 μg/mL muis IgG om de relatieve bijdragen van niet-specifieke antigeen binding te bepalen. AMPA type glutamaat receptoren werden niet gedetecteerd in de spieren in dit stadium van ontwikkeling. De concentraties antilichamen zijn opgenomen in tabel 1. Om deze beelden te genereren, werden deze embryo's verwerkt zoals beschreven in dit protocol met geen van de optionele stappen, behalve voor deyolking. De embryo's waren plat gemonteerd en bedekt (figuur 3B).
Het verdelen van cellen drukt verschillende histonwijzigingen uit van rustige cellen die door immunohistochemie kunnen worden gedetecteerd met behulp van antilichamen die specifieke wijzigingen herkennen, zoals eiwitfosforylatie. Fosforylatie van histon 3 bij serine 10 wordt geassocieerd met celdeling23. De wijzigingen gepresenteerd aan dit protocol voor aanpassing van immunohistochemie aan gesectioneerd weefsel dat is gemonteerd op dia's werd gebruikt om zich vermenigvuldigende cellen in de larvale zebravissen hersenen te detecteren. Bevroren delen van 72 pkf embryo's werden gemonteerd op dia's en immunostained voor p-H3 (Figuur 4). Verschillende cellen uitdrukken p-H3, en expressie is het meest opmerkelijk op de ventriculaire zones. Expressie werd vergeleken met geen primaire controle embryo's en een 2 μg/mL muis IgG om de relatieve bijdragen van niet-specifieke antigeen binding te bepalen.
| Antilichaam | Doel | Concentratie |
| Muis IgG Isotype Control | Niet-specifieke antigenen | 2 μg/mL |
| Muis anti-NMDAR1 | Subeenheid GluN1 | 1:1,000 |
| Geit anti-muis Alexa488 | Muis IgG | 1:500 |
| Muis anti-fosfo-H3 | fosforylated Histone H3 | 1:500 |
| Muis anti-pan-AMPA receptor | GluR1-4 | 1:500 |
Tabel 1: Lijst van gebruikte antilichamen en concentraties.
Figuur 1: Stroomdiagram van hele mount immunohistochemie procedure. De basisworkflow van de procedure is het kweken van vis; embryo's verzamelen en bereiden; niet-specifieke antigenen blokkeren; uitbroeden in primaire en secundaire antilichamen in reeksen; monterweefsel; en document. Optionele stappen worden aangegeven met kleine pijlen op het juiste punt in de werkstroom. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Larven schematische en NMDA receptor IHC representatieve resultaten. Het gebruik van hele mount immunohistochemie getest glutamaat receptor expressie in de ontwikkeling van spier. De oriëntatie en regio van belang bij 23 pkf is aangegeven. Er was geen signaal detecteerbaar toen primaire antilichamen niet werden opgenomen. Muis IgG controle antilichaam toont het lage niveau van niet-specifieke expressie. GluN1 subunit van de NMDA-type glutamaat receptor (NMDAR) wordt uitgedrukt in de zich ontwikkelende spier, met hogere concentraties bij somite grenzen (pijlpunten). Ampa-type glutamaat receptoren (AMPAR) worden niet uitgedrukt in dit stadium. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Schema van montageschema's. (A) Een embryo gezonken in 50% glycerol kan gemakkelijk worden verplaatst. (B) Een embryo plat gemonteerd op een plaat in montagemedium kan op een later tijdstip worden bewaard en in beeld worden gebracht. (C) Een embryo gemonteerd in een druppel van 1% agarose kan worden bevestigd in positie om een moeilijk gebied te bekijken. (D) Een embryo gemonteerd in glycerol op een overbrugde glijbaan kan worden gerold en verplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van IHC in gesectioneerd weefsel. Met behulp van het protocol wijzigingen in de optionele stappen, immunohistochemie getest op het verspreiden van cellen in de zebravissen larve hersenen op 72 hpf. Muis IgG controle antilichaam en met uitzondering van primaire antilichamen onthullen een laag niveau van niet-specifieke expressie. Als markering van vermenigvuldigende cellen wordt p-H3 uitgedrukt in afzonderlijke locaties, waaronder de ventriculaire zones (pijlpunt). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunohistochemie is een veelzijdig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de spatio-temporele expressie van vrijwel elk eiwit van belang in een organisme te karakteriseren. Immunohistochemie wordt gebruikt op een breed scala aan weefsels en modelorganismen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik bij zebravissen. Immunohistochemie bij verschillende soorten kan verschillende fixatie- en behandelingstechnieken vereisen, waardoor oplossingen worden geblokkeerd, afhankelijk van soorten en de aanwezigheid van endogene peroxie, en incubatietijden als gevolg van de dikte en samenstelling van weefsels. IHC in zebravissen is integraal in het bevorderen van ons begrip van kanker24, metabole ziekte25, neurologische aandoeningen26, en tal van andere gebieden van groot belang voor de menselijke gezondheid. Een groot voordeel voor IHC is dat de procedure relatief kort is in vergelijking met andere technieken zoals ISH en technisch niet veeleisend is. Er zijn echter tal van stappen die optimalisatie vereisen op basis van de leeftijd van de specimens, het antigeen wordt gericht en de antilichamen die worden gebruikt.
De duur van verschillende stappen in dit protocol is flexibel. De duur die wordt gegeven voor flexibele stappen zoals opgemerkt, vertegenwoordigen minimale tijdstippen die over het algemeen vereist zijn. In het algemeen kunnen embryo's, wanneer embryo's drie of meer keer in PBTriton worden gewassen, indien nodig 's nachts bij 4 °C worden bewaard. Permeabilisatie- en fixatietijden zijn minder flexibel en mogen alleen met opzet worden aangepast als onderdeel van een probleemoplossingsstrategie. We hebben verschillende punten in het protocol opgemerkt die optioneel zijn om aan te tonen hoe deze stappen kunnen worden geïntegreerd in de workflow, zoals experimenteel relevant is. Als pigmentatie bijvoorbeeld de signaaldetectie verstoort, voorkomt u melanogense door ptu-behandeling of bleekvaste embryo's. Bleken kan weefsel beschadigen, dus zorg moet worden genomen om de tijd embryo's doorbrengen in bleekmiddel te minimaliseren. Bleken kan echter de voorkeur krijgen boven ptu-behandeling, die bepaalde aspecten van ontwikkeling27,28,29,30kan beïnvloeden . We presenteren ook opties voor fluorescerende en chromogene detectie. Als fluorescentie niet gewenst is of als het antigeen een signaal produceert dat te zwak is om adequaat te worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie, kan chromogene detectie worden bereikt met behulp van een mierikswortel peroxidase (HRP)-geconjugeerd antilichaam en DAB.
De grootste uitdaging van IHC bij zebravis is het vinden van geschikte antilichamen. ISH wordt immers vaak gebruikt als proxy voor eiwitexpressie wanneer commerciële antilichamen niet beschikbaar zijn voor het gewenste eiwit van belang. Veel commerciële antilichamen zijn ontworpen om zoogdierdoelen te targeten en epitopen worden niet altijd bewaard in zebravis. Selecteer indien beschikbaar commercieel beschikbare antilichamen die zijn getest bij zebravis. We hebben geconstateerd dat antilichamen die antigenen herkennen die >80% worden geconserveerd tussen zebravissen en de doelsoorten werken over het algemeen bij zebravis. We hebben ook vastgesteld dat antilichamen waarvan wordt aangetoond dat ze werken bij vogels en/of amfibieën, naast zoogdieren over het algemeen ook werken bij zebravissen, zelfs wanneer de werkzaamheid bij zebravissen niet is getest. Typisch, polyklonale antilichamen ontwikkeld tegen een zoogdierantigeen hebben meer kans om zebravissen homologs dan monoklonale antilichamen te detecteren als gevolg van hun lagere specificiteit. Wanneer het testen van een nieuw antilichaam, is het gunstig om een positieve controle experiment uit te voeren met behulp van een cross-linked doel peptide, zoogdierweefsel of cellen waarvan bekend is dat het eiwit uitdrukken, of cellen die een reporter constructie uitdrukken. Antilichamen kunnen ook worden getest door westerse vlek om de grootte van het doelantigeen te controleren.
Hoewel de meeste commerciële antilichamen een voorgesteld verdunningsbereik voor IHC bieden, is het belangrijk om empirisch de verdunning te bepalen die het beste werkt. Antilichaamconcentraties die te hoog zijn, leiden vaak tot niet-specifieke vlekken en een verhoogde achtergrond, terwijl te weinig antilichamen geen waarneembaar signaal geven. Afhankelijk van het antilichaam en het antigeen kan het voordelig zijn om eerst de embryo's zoals beschreven in stap 3.2 te doorsijpelen, maar deze stap is mogelijk niet nodig en in sommige gevallen kan dit leiden tot een verminderd signaal. Dit protocol gebruikt Triton-X-100 als een wasmiddel dat cellen doorsijpelt, wat voldoende kan zijn voor dun weefsel of oppervlakkige expressie. Diep of dik weefsel, zoals diepe hersengebieden of oudere larven, kan eiwitase permeabilisatie vereisen. Omgekeerd moet Triton-X-100 worden uitgesloten van alle stappen wanneer immunostaining alleen eiwitten aan het celoppervlak gewenst is boven het labelen van intracellulaire eiwitten. De duur van de blokkeringsstap en de keuze van een commerciële blokkeringsoplossing versus het gebruik van serum en BSA kunnen ook worden aangepast om te corrigeren voor de gevoeligheid van antilichamen en achtergrondkleuring. Hoge concentraties serum die worden gebruikt bij het blokkeren (10% in dit protocol) kunnen achtergrondkleuring verminderen, maar moeten worden verdund wanneer het antilichaam aanwezig is om maskerende antilichaambindingsplaatsen te minimaliseren. Installatiegebaseerde blokkeringsoplossingen kunnen nuttig zijn als het achtergrondsignaal consistent hoog is, zelfs bij lage antilichaamverdunningen (<1:1.000). Ten slotte kan de gevoeligheid worden verfijnd door de strengheid van de wasbeurten. Het kan nodig zijn om de duur van de naantilichaamwasstappen te verhogen of te verlagen en de hoeveelheid Triton-X-100 in de PBTriton aan te passen. Typische werkbereiken van PBTriton beslaan 0,2% tot 1,0% Triton-X-100. Het is een goede gewoonte bij het gebruik van een nieuw antilichaam om negatieve controle embryo's te bevlekken met primaire IgG en gelabeldsecundaire antilichamen om de specificiteit van antilichamen te bepalen en potentiële vals-positieve signalen te identificeren.
Als antilichaamoptimalisatie er niet in slaagt een positief signaal te produceren, kan dit te wijten zijn aan het fixatieve maskeren van het antigeen. Over het algemeen maskeert fixatie bij 4% PFA geen antigeensites om antilichaambinding te voorkomen, hoewel antigeenmaskering af en toe optreedt bij sommige antilichamen. Antigeen ophalen kan leiden tot schade aan het embryo, maar een werkprotocol is beschreven door Inoue en Wittbrodt31. Als het geselecteerde antilichaam onverenigbaar is met 4% PFA of als PFA resulteert in cellulaire morfologieveranderingen, kan methanol, 2% trichloorazijnzuur of glyoaxal worden gebruikt om de monsters te repareren27. De verenigbaarheid van een antilichaam met formaldehydefixatie moet empirisch worden bepaald. Als een positief controlesignaal niet kan worden verkregen na PFA-fixatie, kan het de moeite waard zijn om een alternatief fixatief zoals methanol te proberen. Alternatieve fixatieprotocollen kunnen ook nodig zijn voor primaire antilichamen die tegen geconjugeerde antigenen (zoals GABA-BSA) zijn opgeworpen.
Er zijn verschillende effectieve opties voor het monteren van immuungekleurde zebravisembryo's voor beeldvorming. Embryo's kunnen worden overgebracht naar een petrischaaltje glycerol, geplaatst met pinnen of tangen, en afgebeeld met een breedveld beeld van boven of van onder beeldvorming door de schotel met een omgekeerde microscoop (Figuur 3A). Deze methode is eenvoudig, snel en tijdelijk. Nadelen zijn de neiging voor embryo's om uit te rollen van focus in de vloeibare glycerol, potentiële reflecties van het oppervlak van de glycerol in de schotel, en de moeilijkheid van beeldvorming door de dikke schotel. Embryo's kunnen plat aan glazen zijkanten worden gemonteerd(figuur 3B)met montagemedium, coverslips en nagellak. Deze mounts kunnen worden bekeken op een rechtopstaande of omgekeerde microscoop. Embryo's die op deze manier worden bereid, kunnen van tevoren worden bereid en de dia's die bij 4 °C worden opgeslagen totdat ze worden weergegeven of later kunnen worden opgeslagen en opnieuw kunnen worden weergegeven. Dit kan vooral voordelig zijn wanneer de beeldtijd beperkt is. De nadelen van deze houder zijn de beperkte opties voor embryopositie en weefseldikte, en het onvermogen om embryo's te herpositioneren of terug te winnen. Embryo's die op deze manier zijn gemonteerd, moeten vaak worden ontgeeld, omdat de dooierkorrels automatisch fluorescerend zijn in de meest gebruikte fluorescentiekanalen en na montage niet kunnen worden verplaatst of verwijderd. Wanneer het gebied van belang een moeilijke positionering van het embryo vereist, kan het het meest voordelig zijn om de embryo's in 1% agarose op een afdekglas te monteren (figuur 3C). Het embryo kan in positie worden gehouden met insectenpinnen met het gebied van belang dat het dichtst bij het dekselglas ligt totdat de agarose afkoelt. De agarose houdt het embryo op zijn plaats zonder dat het embryo minstens enkele minuten rolt. Agarose montage is het beste voor omgekeerde microscopen, hoewel de cover glas kan zorgvuldig worden omgekeerd voor gebruik op een rechtopstaande microscoop. Deze houder kan tijdrovend zijn en embryo's zijn over het algemeen niet herpositioneerbaar of te herstellen. Het monteren van embryo's op overbrugde glijbanen(figuur 3D)biedt enigszins een compromis tussen deze methoden. De overbrugde berg is snel en embryo's kunnen worden verplaatst en teruggewonnen. De hoogte van de brug kan een grotere flexibiliteit in weefseldikte en embryopositie mogelijk maken dan vlakke bevestigingen, met behoud van de mogelijkheid om van boven of onder te zien. Deze methode vereist het voorbereiden van de overbrugde dia's van tevoren. De dikte van het te monteren weefsel bepaalt hoeveel coverslips hoog de brug moet zijn. Overbrugde glijbanen kunnen meerdere keren worden hergebruikt voor een dag, maar moeten worden verwijderd na de imaging sessie, omdat de glycerol is moeilijk schoon te maken van de glijbanen en het zal langzaam verjagen de lijm die de brug.
IHC is een effectieve methode voor het bepalen van de timing en het patroon van eiwitexpressie in een organisme of weefsel. IHC heeft verschillende voordelen ten opzichte van ISH in dat is relatief lage kosten en kan worden voltooid in een fractie van de tijd die typisch nodig is voor ISH (2-3 dagen versus 5-8 dagen). Bovendien is IHC een betere indicator van genproductexpressie, omdat detectie van mRNA-niveaus geen posttranscriptie- en posttranslationele processen voorspelt die de eiwitexpressie kunnen beïnvloeden. IHC is ook in staat om subcellulaire lokalisatiegegevens te verstrekken (hoewel dit niet het geval is bij het gebruik van DAB-vlekken), wat niet wordt geboden door ISH. Het is mogelijk om een dubbele ISH/IHC uit te voeren in zebravissen.
IHC heeft ook een aantal nadelen, vooral onder hen zijn antilichaam beschikbaarheid. Hoewel er tal van antilichamen beschikbaar zijn die van geschikte kwaliteit zijn voor IHC, is het vinden van antilichamen die specifiek werken bij zebravis uitdagender en vereisen vaak testen en oplossen van problemen met antilichamen die worden gegenereerd tegen zoogdierantigenen. Er zijn echter steeds meer zebravissen gevalideerde antilichamen op de markt en de opkomst van CRISPR/Cas9-technologie heeft het mogelijk gemaakt om epitoop endogene eiwitten te epitoon door middel van genoomengineering. Deze processen zijn tijdrovend en uitdagend, echter, en vereisen validatie van eiwitfunctie.
Het in dit rapport beschreven protocol kan in elk stadium op zebravissenembryo's en larven worden gebruikt en kan ook worden toegepast op weefsels van volwassen dieren. Bovendien, dit protocol maakt het ook mogelijk voor het bevlekken van bevroren of paraffine gesectieerde monsters met weinig modificatie. Hele mount immunohistochemie werd gebruikt om neurotransmitter receptor populaties in spier te onderzoeken, onthullende expressie van de ionotropische NMDA glutamaat receptor verplichte subunit 1 bij de ontwikkeling van zebravissen spier. Deze nogal wijdverspreide en diffuse kleuring over de zich ontwikkelende spier komt overeen met de ontwikkelingsexpressie van dezelfde receptorsubeenheid bij het ontwikkelen van Xenopus larven21. Dit suggereert dat de expressie van glutamaat receptoren in het ontwikkelen van spieren evolutionair wordt bewaard. Al met al is dit protocol waardevol voor het verkrijgen van een beter begrip van genexpressie door het gebruik van IHC en biedt een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van de spatio-temporele verdeling van eiwitexpressie bij zebravissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatie te onthullen.
Acknowledgments
Financiering van NIH subsidie 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
References
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J.
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
