Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.
Abstract
Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Erforschung der Proteinexpression und Lokalisierung sowohl während der normalen Entwicklungs- als auch der Krankheitszustände. Obwohl viele Immunhistochemieprotokolle für Säugetiergewebe- und Gewebeabschnitte optimiert wurden, erfordern diese Protokolle häufig eine Modifikation und Optimierung für nicht-mammalianische Modellorganismen. Zebrafische werden zunehmend als Modellsystem in der Grundlagen-, Biomedizinischen und translationalen Forschung eingesetzt, um die molekularen, genetischen und zellbiologischen Mechanismen von Entwicklungsprozessen zu untersuchen. Zebrafische bieten viele Vorteile als Modellsystem, erfordern aber auch modifizierte Techniken für eine optimale Proteindetektion. Hier stellen wir unser Protokoll für die Fluoreszenzimmunhistochemie in Zebrafischembryonen und Larven zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt zusätzlich verschiedene Montagestrategien, die eingesetzt werden können, und einen Überblick über die Vor- und Nachteile, die jede Strategie bietet. Wir beschreiben auch Änderungen an diesem Protokoll, um den Nachweis von chromogenen Substraten im gesamten Mountgewebe und Fluoreszenznachweis im geschnittenen Larvengewebe zu ermöglichen. Dieses Protokoll ist weitgehend auf die Untersuchung vieler Entwicklungsstadien und embryonaler Strukturen anwendbar.
Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich als ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung biologischer Prozesse aus mehreren Gründen, einschließlich kurzer Erzeugungszeit, schnelle Entwicklung, und Freundlichkeit zu genetischen Techniken. Als Ergebnis, Zebrafische werden häufig in hohen Durchsatz kleine Molekül-Screens für toxikologische Forschung und Arzneimittelforschung verwendet. Zebrafische sind auch ein attraktives Modell für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, da ein einzelnes Weibchen routinemäßig 50-300 Eier gleichzeitig produzieren kann und die optisch klaren Embryonen extern entwickeln, was eine effiziente Visualisierung von Entwicklungsprozessen ermöglicht. Die frühe Forschung stützte sich jedoch hauptsächlich auf vorwärts gerichtete genetische Screens, die N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) oder andere Mutagene nutzten, da es herausforderungen war, umgekehrte genetische Techniken zu etablieren. Vor etwa zwei Jahrzehnten wurden Morpholinos zum ersten Mal in Zebrafischen verwendet, um gezielte Gene1abzuschlagen. Morpholinos sind kleine Antisense-Oligonukleotide, die die Translation von Ziel-mRNA nach Mikroinjektion in einen Embryo in einem frühen Entwicklungsstadium hemmen. Eine große Schwäche von Morpholinos ist, dass sie verdünnt werden, wenn sich die Zellen teilen und in der Regel durch 72 Stunden Nachbefruchtung (hpf) an Wirksamkeit verlieren. Während Morpholinos ein leistungsfähiges Werkzeug für Zebrafisch-Genstörungen bleiben, werden Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und gruppierte, regelmäßig interspaced short palindromic Repeats (CRISPRs) in jüngerer Zeit verwendet, um direkt auf das Zebrafischgenom2,3zu zielen. Diese umgekehrten genetischen Strategien, in Kombination mit Vorwärtsgenetik und Bildschirmen mit hohem Durchsatz, haben den Zebrafisch als ein leistungsfähiges Modell zur Erforschung der Genexpression und -funktion etabliert.
Die Fähigkeit, die Genfunktion zu untersuchen, erfordert in der Regel eine Bewertung der räumlich-zeitlichen Verteilung der Gen- oder Genproduktexpression. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken zur Visualisierung solcher Expressionsmuster während der frühen Entwicklung sind die In-situ-Hybridisierung (ISH) und die gesamte Mount-Immunhistochemie (IHC). Die In-situ-Hybridisierung wurde erstmals 1969 entwickelt und stützt sich auf die Verwendung von markierten Antisense-RNA-Sonden zum Nachweis der mRNA-Expression in einem Organismus4. Im Gegensatz dazu werden markierte Antikörper in der Immunhistochemie verwendet, um die Proteinexpression zu visualisieren. Die Idee, Proteine für den Nachweis zu kennzeichnen, geht auf die5. Jahre der 1930er Jahre zurück und das erste IHC-Experiment wurde 1941 veröffentlicht, als FITC-markierte Antikörper verwendet wurden, um pathogene Bakterien in infizierten Geweben zu erkennen6. ISH und IHC haben sich in den folgenden Jahrzehnten deutlich weiterentwickelt und verbessert und werden nun sowohl routinemäßig im molekularen als auch im diagnostischen Forschungslabor7,8,9,10,11eingesetzt. Während beide Techniken Vor- und Nachteile haben, bietet IHC mehrere Vorteile gegenüber der ISH. Praktisch ist IHC viel weniger zeitaufwändig als ISH und ist in der Regel weniger teuer, abhängig von den Kosten des primären Antikörpers. Darüber hinaus ist die mRNA-Expression nicht immer eine zuverlässige Metrik der Proteinexpression, da bei Mäusen und Menschen nachgewiesen wurde, dass nur etwa ein Drittel der Proteinüberflussvariation durch mRNA-Überfluss12erklärt werden kann. Aus diesem Grund ist IHC eine wichtige Ergänzung, um ISH-Daten zu bestätigen, wenn möglich. Schließlich kann IHC subzelluläre und Co-Lokalisierungsdaten bereitstellen, die nicht von ISH13,14,15bestimmt werden können. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zum zuverlässigen Nachweis von Proteinen durch Immunhistochemie in ganzen Zebrafischembryonen und Larven. Das Ziel dieser Technik ist es, die räumliche und zeitliche Expression eines Proteins von Interesse im gesamten Embryo zu bestimmen. Diese Technologie verwendet antigenspezifische primäre Antikörper und fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper. Das Protokoll ist leicht anpassbar für den Einsatz auf gleitmontierten Gewebeabschnitten und für die Verwendung mit chromogenen Substraten anstelle der Fluoreszenz. Mit diesem Protokoll, Wir zeigen, dass die Entwicklung Zebrafisch Skelettmuskel drückt ionotrope Glutamat-Rezeptoren, zusätzlich zu Acetylcholin-Rezeptoren. NMDA-Typ Glutamat-Rezeptor-Subunits sind auf dem Längsmuskel bei 23 hpf nachweisbar.
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Protocol
Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren für die Arbeit mit Zebrafischen, die Erwachsene und Embryonen züchten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Murray State University genehmigt.
1. Embryo-Sammlung und -Fixierung
- Bereiten Sie Laichbecken vor, indem Sie erwachsene Zebrafische gemischte Sexpaare oder -gruppen in Tanks mit einem Netz oder einem geschlitzten Liner platzieren, der über Nacht mit Systemwasser gefüllt ist.
- Wechseln Sie bei eingeschaltetem Licht das Laichbeckenwasser in frisches Systemwasser, um Kot zu entfernen. Verwenden Sie einen 14 h/10 h hellen dunklen Zyklus mit Lichtern, die um 9 Uhr eintreffen.
- Sobald die Eier gelegt sind, kehren Sie die Erwachsenen in die Tanks zurück.
- Sammeln Sie Eier, indem Sie sie mit einer Transferpipette aufziehen oder in ein Netzsieb gießen.
- Übertragen Sie die Eier auf Petrischalen, die auf halbem Weg mit Embryomedium (wie 30% Danieau oder E2 Embryomedium mit 0,5 mg/L Methylenblau) gefüllt wurden, wodurch die Anzahl der Embryonen pro Schale auf 50 begrenzt wird.
- Entfernen Sie alle Eier, die tot sind oder nicht teilen.
HINWEIS: Tote Embryonen können leicht identifiziert werden, da sie undurchsichtig werden und oft "trüb" erscheinen. Wenn Methylenblau dem Embryomedium zugesetzt wird, nehmen die toten Embryonen ein dunkelblaues Aussehen an. - Eiergerichte bei 28,5 °C bebrüten, bis sie das gewünschte Stadium erreichen. Für dieses Experiment die Embryonen auf 23 hpf erhöhen.
- Optional) Übertragen Sie die Embryonen bei 24 hpf auf 200 'M 1-phenyl 2-thiourea (PTU) in embryonales Medium, um Melanogenese zu verhindern16,17. Alternativ können Bleichembryonen nach der Fixierung bleichen (siehe optionaler Abschnitt 5).
- Ändern Sie embryomedium oder PTU medium täglich.
- Dechorionate ungeschlüpfte Embryonen mit ultrafeinen Spitzenzangen unter einem Stereomikroskop. Alternativ können Embryonen chemisch dechororieren, indem sie in 1 mg/ml Pronase in Embryomedium für mehrere Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Embryonen aus Pronase und waschen Sie dreimal mit Embryo-Medium.
- Dechorionierte Embryonen bleiben an Plastik. Bewahren Sie sie in Glas- oder Kunststoff-Petrischalen auf, die mit 1-2% Agarose in Embryomedium gelöst sind. Bewegen Sie dechorionierte Embryonen mit feuerpolierten Pasteurpipetten, um Schäden zu minimieren.
- Übertragen Sie die Embryonen mit einer Kunststoff- oder feuerpolierten Pipt in 1,5 ml Zentrifugenrohre.
- Embryomedium mit einer Mikropipette entfernen. Lassen Sie nur genügend Flüssigkeit, um die Embryonen nach jedem Flüssigkeitswechsel zu bedecken.
- 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) in einer chemischen Rauchhaube vorbereiten.
VORSICHT: PFA ist ein gefährliches Material. Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie kontaminierte Flüssigkeiten und Feststoffe in ausgewiesenen Bereichen. - Fixieren Sie die Embryonen in 4% PFA für 1-2 h mit sanftem Schaukeln bei Raumtemperatur. Alternativ können Sie die Embryonen 4 h auf über Nacht bei 4 °C fixieren.
- Dreimal in 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) 5 min waschen.
- Verwenden Sie die Embryonen sofort oder lagern Sie bei 4 °C bis zu 1 Woche.
- Zur Langzeitlagerung die Embryonen in 100% Methanol (MeOH) 2 h oder über Nacht bei -20 °C dehydrieren. Lagern Sie die Embryonen bei -20 °C in MeOH für mehrere Monate.
VORSICHT: MeOH ist ein gefährliches Material. Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie kontaminierte Flüssigkeiten und Feststoffe in ausgewiesenen Bereichen.
2. Embryonenzubereitung
- Rehydrieren Sie die Embryonen durch serielle Inkubationen bei Raumtemperatur.
- Inkubieren In 75% MeOH/25% 1x PBS für 5 min, Schaukeln.
- Inkubieren Sie in 50% MeOH/50% 1x PBS für 5 min, Schaukeln.
- Inkubieren In 25% MeOH/75% 1x PBS für 5 min, Schaukeln.
- Inkubieren in 100% PBTriton für 5 min, Schaukeln.
- (Optional) Bereiten Sie eine frische Proteinase-K-Arbeitslösung (10 g/ml in PBTriton) auf Eis vor, indem Sie 10 l frisch aufgetauten Proteinase-K-Bestand (10 mg/ml) hinzufügen.
- Permeabilisieren Sie die Embryonen, indem Sie bis zu 30 min in Proteinase K verdauen.
HINWEIS: Vorgeschlagenes Timing ist <24 hpf: keine Verdauung; 24 hpf: 15 min Verdauung; und 7 Tage alt: 30 min Verdauung. - Durchmeseperabilisierte Embryonen in PBTriton abspülen und in 4% PFA für 20 min bei Raumtemperatur refixieren.
- Waschen Sie die Embryonen dreimal in PBTriton für 5 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schaukeln.
- Permeabilisieren Sie die Embryonen, indem Sie bis zu 30 min in Proteinase K verdauen.
3. Primäre Antikörper-Inkubation
- Wählen Sie eine kommerzielle Blockierlösung oder ein Serum passend zur sekundären Antikörper-Wirtsart (z. B. 10% Ziegenserum in PBTriton) mit oder ohne 2 mg/ml Rinderserum Albumin (BSA).
- Blockieren Sie die Embryonen in Blockierlösung für 1-3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln.
- Inkubieren Sie in primärer Antikörper in Blockierlösung oder 1% Serum in PBTriton über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln. In diesem Experiment wurden die primären Antikörper verwendet, Anti-NMDAR1, Anti-Pan-AMPA-Rezeptor, und Anti-Phospho-Histon H3, jeweils auf eine endgültige Konzentration von 1:500 in 1% Ziegenserum in PBTriton verdünnt.
- Waschen Sie fünfmal in PBTriton für 10 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln.
4. Sekundäre Antikörper-Inkubation
- Wählen Sie einen sekundären Antikörper basierend auf der Wirtsart des primären Antikörpers und der gewünschten Wellenlänge aus.
- Inkubieren Sie in sekundärem Antikörper in Blockierlösung oder 1% Serum für 2 h bei Raumtemperatur (oder über Nacht bei 4 °C) beim Schaukeln.
HINWEIS: Fluoreszierende Sekundärantikörper sind lichtempfindlich. Wir verwendeten 1:500 Ziege-Anti-Maus Alexa488 verdünnt in 1% Ziegenserum in PBTriton. - Bedecken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie oder Abdeckung mit einer Lichtblockdose für diese und alle nachfolgenden Schritte.
- Waschen Sie dreimal in PBTriton für 10 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln.
- Übertragen Sie die Embryonen in eine 50%ige Glycerinlösung in PBS über ein Bett von 2% Agarose im Embryomedium und führen Sie die Dokumentation fort oder gehen Sie zu weiteren Verarbeitungsschritten weiter.
Optionale Schritte
5. Bleichen
- Bereiten Sie Bleichlösung in einem 1,5 ml Rohr vor, indem Sie 810,7 l ddH2O, 89,3 l mit 2 M KOH und 100 l 30 % H2O2hinzufügen.
- Invertieren Sie das Rohr dreimal zu mischen.
- Pipette 1 ml Bleichlösung Richtung zu den Embryonen.
- Öffnen Sie die Embryorohrkappe, damit Gas entweichen kann. Tippen Sie vorsichtig auf das Rohr auf der Bank, um Blasen zu lösen.
- Überwachen Sie den Bleichprozess (ggf. mikroskopisch verwenden) und stoppen Sie die Reaktion, wenn das Pigment ausreichend entfernt wird (ca. 5 min für 24 hpf oder 10 min für 72 hpf).
- Entfernen Sie die Bleichlösung vorsichtig mit einer Mikropipette und spülen Sie Embryonen dreimal in 1 ml PBTriton aus.
HINWEIS: Embryonen sind in diesem Schritt klebrig. - Fahren Sie mit der Dokumentation oder weiteren Bearbeitungsschritten weiter.
6. Embryo-Sektion und Deyolking
- Um das Eigelb zu entfernen, übertragen Sie eine kleine Menge (200 L oder genug, um den Embryo vollständig abzudecken, aber restriktiv genug, um zu begrenzen, wo es schwimmen kann) von 1x PBS auf eine Vertiefungsfolie oder eine schlichte Glasrutsche.
- Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 1 oder mehr Embryonen zum PBS-Tröpfchen zu bewegen.
- Verwenden Sie ultrafeine Zangen und 00 Insektenstifte, um das Dotter auseinander zu brechen und sehr sanft das Dottergranulat von der ventralen Oberfläche des Embryos zu kratzen (siehe auch Cheng et al., 2014)18.
- Entfernen Sie das Dottergranulat, und füllen Sie PBS nach Bedarf auf.
- Wiederholen Sie dies, bis der Embryo ausreichend frei von Eigelb ist.
7. Flache Montage auf Rutschen
- Übertragen Sie entyolkierte Embryonen auf eine aufgeladene Glasrutsche mit einer Kunststoffpipette oder einer 1 ml Mikropipette mit einer getrimmten Spitze (zur Verringerung der Scherspannung). Orientieren Sie sich nach Belieben mit einer 200-L-Mikropipette-Spitze oder einem Insektenstift.
- Wick weg überschüssige PBS mit einem Kim-Wisch oder Papiertuch.
- Fügen Sie 2-3 Tropfen Montagemedien auf den Schiebe- und Deckschein ein.
- Lufttrocken ca. 5 bis 10 min.
- Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack auf der Rutsche.
HINWEIS: Die Ränder des Deckglases müssen vollständig mit einer dünnen, kontinuierlichen Schicht aus Nagellack bedeckt sein. - Ca. 10 min vor der Bildgebung trocknen lassen.
8. Montage in Agarose
- Bereiten Sie 1% Agarose im Embryomedium vor, indem Mantis zu 50 ml Embryomedium in einem Mikrowellen-sicheren Kolben oder Becher mit mindestens 3x größerem Volumen als gewünscht hinzugeben.
- In einer Mikrowelle erhitzen, alle 30 s wirbeln, bis Agarose vollständig aufgelöst ist.
- Machen Sie 1 ml Aliquots in 1,5 ml Zentrifugenrohren. Bewahren Sie die Aliquots bei Raumtemperatur auf.
- Abdeckung Rohrkappen mit Kappenschlössern vor dem Erhitzen.
- Legen Sie Agaroserohre in einen schwimmenden Rohrhalter in einen Becher, der halb mit Wasser gefüllt ist.
- Mikrowelle der Becher mit schwimmenden Rohren für 2-3 min, oder bis Agarose vollständig geschmolzen ist.
- Übertragen Sie einen Embryo mit einer Kunststoffpipette oder einer 200-L-Mikropipette mit einer getrimmten Spitze auf den überbrückten Schlitten (zur Reduzierung der Scherspannung).
- Positionieren Sie den Embryo mit Insektenstiften auf einem rechteckigen Deckelund und fügen Sie dem Embryo etwa 20 l geschmolzene Agarose direkt hinzu.
- Richten Sie den Interessenbereich, der dem Deckzettel am nächsten liegt, schnell mit 00 Insektenstiften aus.
HINWEIS: Dies ist eine umgedrehte Halterung. - Bringen Sie das Agaroserohr nach Bedarf in den Wasserschlauch zwischen jedem Gebrauch und der Mikrowelle zurück.
- Bild mit einem Mikroskop, wenn die Agarose aushärtet. Halten Sie den montierten Embryo auf dem Kopf, um ihn auf einem invertierten Mikroskop zu verwenden. Drehen Sie den Deckelschlupf um (so ist die Agarose unter dem Coverslip) für den Einsatz auf aufrechten Mikroskopen.
9. Montage auf überbrückten Dias
- Um überbrückte Dias zu machen, kleben Sie quadratische Abdeckungen mit einem kleinen Punkt Superkleber an die Glasrutsche.
HINWEIS: Zwischen den Abdeckungen sollte ein Trog von mindestens 5 mm breite Trog vorhanden sein. Zwei #1 Abdeckungen hoch ist in der Regel geeignet für 24-48 hpf Embryonen, während drei Abdeckungen hoch kann für 72 hpf notwendig sein. - Übertragen Sie 1-2 entyolkierte Embryonen mit einer Kunststoffpipette oder einer 200-L-Mikropipette mit einer getrimmten Spitze auf den überbrückten Schlitten (zur Verringerung der Scherspannung).
- Wick weg überschüssige Flüssigkeit mit einem Kim-Wisch oder Papiertuch.
- Fügen Sie dem Embryo einen Tropfen von 80 % Glycerin direkt hinzu.
- Abdeckung mit einem rechteckigen Deckglas. Das Tröpfchen Glycerin sollte das Deckglas berühren.
- Fügen Sie mehr Glycerin in den Raum zwischen dem Deckglas und gleiten Sie nach Bedarf, um den Embryo vollständig mit einem Rand von Glycerin an den Seiten des Embryos zu bedecken.
- Schieben Sie das rechteckige Abdeckglas vorsichtig, um den Embryo zur Bildgebung in Position zu bringen.
10. DAB Färbung
HINWEIS: Dieser Abschnitt beginnt nach Schritt 4.2 oben und ersetzt den Rest von Schritt 4.
- Die Embryonen in einer blockierenden Lösung mit einem peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln inkubieren.
- Dreimal in PBTriton 10 min bei Raumtemperatur waschen.
- Übertragen Sie die Embryonen auf eine Kulturplatte oder Depressionsrutsche mit einer Transferpipette.
- 50 l DAB (3,3'-Diaminobenzidin) in ddH2O und 50 l mit 0,3 % Wasserstoffperoxid lösen und mit PBS auf 1 ml bringen.
VORSICHT: DAB ist ein gefährliches Material. Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie DAB-verunreinigte Flüssigkeiten und Feststoffe in ausgewiesenen Bereichen. - Bedecken Sie HRP-gefärbte Embryonen mit der oben vorbereiteten DAB-Lösung und überwachen Sie die Farbentwicklung (typischerweise 1-5 min) unter dem Mikroskop.
- Nach Erreichen des gewünschten Farbentwicklungsniveaus spülen Sie die Embryonen kurz in PBS ab.
- Übertragen Sie die Embryonen vor der Fixierung wieder in ein 1,5 ml-Rohr.
- Fixieren Sie die Embryonen für 15-20 min in 4% PFA bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Embryonen dreimal in PBTriton für 5 min.
- Fahren Sie mit der Dokumentation fort.
11. Geändertes Protokoll für die Färbung von Schnittgewebe, das auf Folien montiert ist
- Umschließen Sie Gewebe, das mit einem Pap-Stift gefärbt werden soll.
- Übertragen Sie die Dias in eine feuchte Kammer.
- Fügen Sie 1 ml PBS direkt zur Folie hinzu.
- 7 min bei Raumtemperatur inkubieren, um ein einbettendes Medium zu entfernen.
- Gießen Sie PBS durch Invertieren des Dias.
- Rehydratisieren Sie 1 min in bis zu 1 ml TNT-Puffer (100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
- Block in bis zu 1 ml Blockierlösung (kommerziell oder 10% Serum + 2% BSA) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Über Nacht in Primärantikörper in 1% Serum oder Blockierlösung bei 4 °C verdünnt.
- Fünfmal in bis zu 1 ml TNT-Puffer bei Raumtemperatur waschen.
- In sekundären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren. Bedecken Sie die Kammer mit Folie oder verwenden Sie einen dunklen Deckel.
- Fünfmal in TNT bei Raumtemperatur waschen. Gießen Sie die letzte Wäsche ab.
- Montieren Sie mit 2-3 Tropfen Montagemedium und Deckelrutsch. Lassen Sie 5-10 min sitzen.
- Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack auf die Rutsche. Vor der Bildgebung vollständig trocknen lassen.
12. Dokumentation
- Zeichnen Sie den vollständigen Ablauf und alle Abweichungen in einem Lab-Notizbuch auf.
- Zeichnen Sie die Konzentration, den Namen, die Katalognummer, den Hersteller und die Chargennummer des primären Antikörpers auf.
- Entsprechend montierte Probe auf die Mikroskopbühne stellen. Suchen Sie die Region von Interesse.
- Wählen Sie ein relativ helles Beispiel aus. Stellen Sie die Kamerabelichtung und -verstärkung so ein, dass das Signal ausreichend hell ist, ohne zu sättieren.
- Vergleichen Sie die Färbeintensität desselben Interessenbereichs mit den gleichen Expositionseinstellungen, wenn Sie zwischen experimentellen Antikörper-markierten Embryonen und Kontrollantikörpern (z. B. IgG)-Embryonen vergleichen.
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Representative Results
Die Immunhistochemie der ganzen Halterung verwendet Antikörper, um das räumliche Muster der Proteinexpression im intakten Tier zu detektieren. Der grundlegende Arbeitsablauf der Immunhistochemie (dargestellt in Abbildung 1) besteht darin, Zebrafische zu züchten, Embryonen zu züchten und zu präzisieren, unspezifische Antigene zu blockieren, einen antigenspezifischen Primärantikörper zu verwenden, um das Protein von Interesse zu zielen, diesen primären Antikörper mit einem markierten sekundären Antikörper zu erkennen, die Probe zu montieren und die Expression zu dokumentieren.
Die Immunhistochemie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Proteinexpression während der Zebrafischentwicklung. Zebrafische zeigen spontane Kontraktionen, die durch Lückenknoten ab 19 uhr vermittelt werden - vor dem Motorneuronkontakt19. Die Neuromuskuläre Kreuzung des Zebrafisches wird, wie andere Wirbeltiere, durch Acetylcholin vermittelt, das bei nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren wirkt. Diese zusammengesetzten Rezeptoren werden zuerst bei ca. 16 hpf detektiert und die Expression dehnt sich aus und baut sich um, da Neuronen Kontakte bilden20. Studien an Fröschen21 und Ratten22 deuten darauf hin, dass der Skelettmuskel von Wirbeltieren auch ionotrope Glutamatrezeptoren exprimieren kann. Die gesamte Mount-Immunhistochemie für die GluN1-Untereinheit des NMDA-Typ-Glutamatrezeptors zeigt die Expression von Glutamatrezeptor-Untereinheiten während der Entwicklung des Zebrafischmuskels bei 23 hpf(Abbildung 2). Dies entspricht in etwa dem Timing der motorischen Neuroneninnervation. Die Expression wurde mit keinen primär kontrollierbaren Embryonen verglichen, um die Hintergrundfluoreszenz des Fisches und des sekundären Antikörpers zu bestimmen, und mit einem 2 g/ml-Maus-IgG, um die relativen Beiträge der unspezifischen Antigenbindung zu bestimmen. AMPA-Typ Glutamat-Rezeptoren wurden in diesem Stadium der Entwicklung nicht in den Muskeln nachgewiesen. Die Antikörperkonzentrationen sind in Tabelle 1aufgeführt. Um diese Bilder zu erzeugen, wurden diese Embryonen wie in diesem Protokoll beschrieben verarbeitet, ohne dass die serklinken Schritte außer dem Deyolking nicht möglich waren. Embryonen waren flach montiert und abdeckungen (Abbildung 3B).
Teilzellen exprimieren unterschiedliche Histonmodifikationen von ruhebringenden Zellen, die durch Immunhistochemie mithilfe von Antikörpern nachgewiesen werden können, die spezifische Modifikationen erkennen, wie die Proteinphosphorylierung. Die Phosphorylierung des Histons 3 bei Serin 10 ist mit der Zellteilung23verbunden. Die Anänderungen, die an diesem Protokoll zur Anpassung der Immunhistochemie an geschnittenes Gewebe vorgestellt wurden, das auf Dias montiert ist, wurden verwendet, um sich ausbreitende Zellen im Larvenzebrafischhirn zu erkennen. Gefrorene Abschnitte von 72-hpf-Embryonen wurden auf Dias montiert und immunstainiert für p-H3 (Abbildung 4). Mehrere Zellen drücken p-H3 aus, und die Expression ist am bemerkenswertesten in den ventrikulären Zonen. Die Expression wurde mit keinen primär kontrollierbaren Embryonen und einem 2-mmL-Maus-IgG verglichen, um die relativen Beiträge der unspezifischen Antigenbindung zu bestimmen.
| Antikörper | Ziel | Konzentration |
| Maus IgG Isotype Steuerung | Unspezifische Antigene | 2 g/ml |
| Maus Anti-NMDAR1 | GluN1-Untereinheit | 1:1,000 |
| Ziege Anti-Maus Alexa488 | Maus IgG | 1:500 |
| Maus Anti-Phospho-H3 | phosphorylierter Histon H3 | 1:500 |
| Maus Anti-Pan-AMPA-Rezeptor | GluR1-4 | 1:500 |
Tabelle 1: Liste der verwendeten Antikörper und Konzentrationen.
Abbildung 1: Flussdiagramm des gesamten Mount-Immunhistochemie-Verfahrens. Der grundlegende Arbeitsablauf des Verfahrens besteht darin, Fische zu züchten; Embryonen zu sammeln und vorzubereiten; unspezifische Antigene zu blockieren; in Reihe in primärer und sekundärer Antikörper inkubieren; Gewebe zu montieren; und Dokument. Optionale Schritte werden mit kleinen Pfeilen an der entsprechenden Stelle im Workflow angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Larven-Schema und NMDA-Rezeptor IHC repräsentative Ergebnisse. Die Verwendung von ganzer Mount-Immunhistochemie getestet Glutamat-Rezeptor-Expression bei der Entwicklung von Muskeln. Die Ausrichtung und die Interessensregion bei 23 hpf wird angegeben. Kein Signal war nachweisbar, wenn primäre Antikörper nicht enthalten waren. Maus-IgG-Kontrollantikörper zeigt den niedrigen Grad unspezifischer Expression an. GluN1-Untereinheit des NMDA-Typ-Glutamatrezeptors (NMDAR) wird über den sich entwickelnden Muskel exprimiert, mit höheren Konzentrationen an den Grenzen (Pfeilspitzen). AMPA-Typ Glutamatrezeptoren (AMPAR) werden in diesem Stadium nicht exprimiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Schemader der Montageschemata. (A) Ein in 50 % Glycerin versenkter Embryo kann leicht neu positioniert werden. (B) Ein embryoflach montiert auf einem Dia im Montagemedium kann zu einem späteren Zeitpunkt erhalten und abgebildet werden. (C) Ein embryonal in einem Tröpfchen von 1% Agarose montiert kann in der Lage, eine schwierige Region zu sehen befestigt werden. (D) Ein embryonal auf einem überbrückten Schlitten montierter Embryo kann gerollt und neu positioniert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von IHC in schnittigem Gewebe. Mit den Protokollmodifikationen in den optionalen Schritten wurde die Immunhistochemie auf vermehrende Zellen im Zebrafischlarvenhirn bei 72 hpf getestet. Maus-IgG-Kontrollantikörper und ohne primäre Antikörper zeigen eine geringe unspezifische Expression. Als Marker von sich ausbreitenden Zellen wird p-H3 an diskreten Stellen, einschließlich der ventrikulären Zonen (Pfeilspitze), exprimiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Immunhistochemie ist ein vielseitiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die räumlich-zeitliche Expression praktisch jedes Proteins zu charakterisieren, das für einen Organismus von Interesse ist. Immunhistochemie wird bei einer Vielzahl von Geweben und Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in Zebrafischen optimiert. Die Immunhistochemie bei verschiedenen Arten kann unterschiedliche Befestigungs- und Handhabungstechniken erfordern, die je nach Art und Dementogen von Endogenen Peroxidasen und Inkubationszeiten aufgrund der Dicke und Zusammensetzung des Gewebes blockieren. IHC bei Zebrafischen war ein integraler Bestandteil der Förderung unseres Verständnisses von Krebs24, Stoffwechselkrankheit25, neurologische Erkrankungen26, und zahlreiche andere Bereiche von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit. Ein großer Vorteil für IHC ist, dass das Verfahren im Vergleich zu anderen Techniken wie ish relativ kurz und technisch nicht anspruchsvoll ist. Es gibt jedoch zahlreiche Schritte, die eine Optimierung auf der Grundlage des Alters der Proben, des zielgerichteten Antigens und der verwendeten Antikörper erfordern.
Die Dauer mehrerer Schritte in diesem Protokoll ist flexibel. Die für flexible Schritte angegebenen Dauern stellen in der Regel erforderliche Mindestzeiten dar. Im Allgemeinen können Embryonen, wenn sie drei oder mehr Mal in PBTriton gewaschen werden, bei Bedarf bei 4 °C über Nacht aufbewahrt werden. Permeabilisierungs- und Fixierungszeiten sind weniger flexibel und sollten nur mit bewusster Absicht im Rahmen einer Fehlerbehebungsstrategie angepasst werden. Wir haben mehrere Punkte im Protokoll notiert, die optional sind, um zu zeigen, wie diese Schritte in den Workflow integriert werden können, wie experimentell relevant ist. Wenn die Pigmentierung beispielsweise die Signalerkennung beeinträchtigt, verhindern Sie Die Melanogense durch PTU-Behandlung oder bleichen Sie feste Embryonen. Bleichen kann Gewebe schädigen, daher muss darauf geachtet werden, die Zeit zu minimieren, die Embryonen in Bleichmittel verbringen. Bleichen kann jedoch der PTU-Behandlung vorzuziehen sein, die bestimmte Aspekte der Entwicklung beeinflussen kann27,28,29,30. Wir stellen auch Optionen für den fluoreszierenden und chromogenen Nachweis vor. Wenn Fluoreszenz nicht gewünscht wird oder wenn das Antigen ein Signal erzeugt, das zu schwach ist, um durch die Fluoreszenzmikroskopie ausreichend nachgewiesen zu werden, kann mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Antikörper und DAB ein chromogener Nachweis erzielt werden.
Die größte Herausforderung von IHC bei Zebrafischen ist es, geeignete Antikörper zu finden. Tatsächlich wird ISH oft als Proxy für die Proteinexpression verwendet, wenn kommerzielle Antikörper für das gewünschte Protein von Interesse nicht verfügbar sind. Viele kommerzielle Antikörper sind so konzipiert, dass sie auf Säugetierziele abzielen, und Epitope werden nicht immer in Zebrafischen konserviert. Wenn verfügbar, wählen Sie handelsübliche Antikörper aus, die in Zebrafischen getestet wurden. Wir haben festgestellt, dass Antikörper, die Antigene erkennen, die >80% zwischen Zebrafischen und der Zielart konserviert sind, in der Regel bei Zebrafischen wirken. Wir haben auch festgestellt, dass Antikörper, die nachweislich bei Vögeln und/oder Amphibien zusätzlich zu Säugetieren wirken, in der Regel auch bei Zebrafischen wirken, auch wenn die Wirksamkeit bei Zebrafischen nicht getestet wurde. Typischerweise sind polyklonale Antikörper, die gegen ein Säugetierantigen entwickelt wurden, aufgrund ihrer geringeren Spezifität eher Zebrafisch-Homologs nachweisbar als monoklonale Antikörper. Jedes Mal, wenn ein neuer Antikörper getestet wird, ist es von Vorteil, ein Positivkontrollexperiment mit einem vernetzten Zielpeptid, Säugetiergewebe oder Zellen durchzuführen, von denen bekannt ist, dass sie das Protein ausdrücken, oder Zellen, die ein Reporterkonstrukt ausdrücken. Antikörper können auch durch Western Blot getestet werden, um die Größe des Zielantigens zu überprüfen.
Während die meisten kommerziellen Antikörper einen vorgeschlagenen Verdünnungsbereich für IHC bieten, ist es wichtig, empirisch die Verdünnung zu bestimmen, die am besten funktioniert. Antikörperkonzentrationen, die zu hoch sind, führen oft zu unspezifischen Färbungen und erhöhtem Hintergrund, während zu wenig Antikörper kein erkennbares Signal liefern. Je nach Antikörper und Antigen kann es vorteilhaft sein, zuerst die Embryonen zu permeabilisieren, wie in Schritt 3.2 oben beschrieben, dieser Schritt kann jedoch nicht notwendig sein und in einigen Fällen zu einem reduzierten Signal führen. Dieses Protokoll verwendet Triton-X-100 als Reinigungsmittel, das Zellen durchdringt, was für dünnes Gewebe oder oberflächliche Expression ausreichen kann. Tiefes oder dickes Gewebe, wie z. B. tiefe Hirnregionen oder ältere Larven, kann eine Proteinasepermeabilisierung erfordern. Umgekehrt sollte Triton-X-100 von allen Schritten ausgeschlossen werden, wenn die Immunfärbung nur von Proteinen an der Zelloberfläche über die Kennzeichnung intrazellulärer Proteine gewünscht wird. Die Dauer des Sperrschritts sowie die Wahl einer kommerziellen Blockierlösung im Vergleich zur Verwendung von Serum und BSA können ebenfalls angepasst werden, um die Antikörperempfindlichkeit und Hintergrundfärbung zu korrigieren. Hohe Serumkonzentrationen, die bei der Blockierung verwendet werden (10% in diesem Protokoll), können die Hintergrundfärbung reduzieren, sollten jedoch verdünnt werden, wenn Antikörper vorhanden sind, um Maskierungs-Antikörperbindungsstellen zu minimieren. Pflanzenbasierte Blockierlösungen können von Vorteil sein, wenn das Hintergrundsignal auch bei niedrigen Antikörperverdünnungen konstant hoch ist (<1:1,000). Schließlich kann die Empfindlichkeit durch die Stringenz der Wärzahlen fein abgestimmt werden. Es kann notwendig sein, die Dauer der Post-Antikörper-Waschschritte zu erhöhen oder zu verringern sowie die Menge an Triton-X-100 im PBTriton anzupassen. Typische Arbeitsbereiche von PBTriton umfassen 0,2% bis 1,0% Triton-X-100. Es ist eine gute Praxis, wenn ein neuer Antikörper verwendet wird, um negative Kontrollembryonen mit primärem IgG und markierten sekundären Antikörpern zu färben, um die Antikörperspezifität zu bestimmen und potenzielle falsch positive Signale zu identifizieren.
Wenn die Antikörperoptimierung kein positives Signal erzeugt, kann dies an der fixativen Maskierung des Antigens liegen. Im Allgemeinen, Fixierung in 4% PFA nicht Maskieren Antigen-Sites, um Antikörperbindung zu verhindern, Obwohl Antigen-Maskierung gelegentlich mit einigen Antikörpern auftritt. Antigen-Retrieval kann zu Schäden am Embryo führen, aber ein Arbeitsprotokoll wurde von Inoue und Wittbrodt31beschrieben. Alternativ kann methanol, 2% Trichloressigsäure oder Glyoaxal verwendet werden, um die Proben zu fixieren27. Die Verträglichkeit eines Antikörpers mit Formaldehydfixierung muss empirisch bestimmt werden. Wenn ein positives Kontrollsignal nach der PFA-Fixierung nicht erhalten werden kann, kann es sich lohnen, ein alternatives Fixativ wie Methanol auszuprobieren. Alternative Fixierungsprotokolle können auch für primäre Antikörper erforderlich sein, die gegen konjugierte Antigene (wie GABA-BSA) erhoben wurden.
Es gibt mehrere effektive Optionen für die Montage immunostainierter Zebrafisch-Embryonen für die Bildgebung. Embryonen können auf eine Petrischale aus Glycerin übertragen, mit Stiften oder Zangen positioniert und entweder mit einem Weitfeldblick von oben oder von unten durch die Schale mit einem invertierten Mikroskop(Abbildung 3A)abgebildet werden . Diese Methode ist einfach, schnell und temporär. Nachteile sind die Neigung für Embryonen, aus dem Fokus in der Flüssigkeit Glycerin rollen, mögliche Reflexionen von der Oberfläche des Glycerinins in der Schale, und die Schwierigkeit der Bildgebung durch die dicke Schale. Embryonen können flach auf Glasseiten montiert werden(Abbildung 3B) mit Montagemedium, Abdeckungen und Nagellack. Diese Halterungen können auf einem aufrechten oder invertierten Mikroskop betrachtet werden. Auf diese Weise präparierte Embryonen können im Voraus vorbereitet und die Dias bei 4 °C bis zur Bildgebung gelagert oder später gelagert und neu abgebildet werden. Dies kann besonders vorteilhaft sein, wenn die Bildzeit begrenzt ist. Zu den Nachteilen dieser Halterung gehören die begrenzten Möglichkeiten für embryonale Position und Gewebedicke sowie die Unfähigkeit, Embryonen neu zu positionieren oder zurückzugewinnen. Embryonen, die auf diese Weise montiert werden, müssen oft entyolking werden, da die Dottergranulate in den am häufigsten verwendeten Fluoreszenzkanälen autofluoreszierend sind und nach der Montage nicht bewegt oder entfernt werden können. Wenn die Region von Interesse eine schwierige Positionierung des Embryos erfordert, kann es am vorteilhaftesten sein, die Embryonen in 1% Agarose auf einem Deckglas zu montieren (Abbildung 3C). Der Embryo kann mit Insektenstiften in Position gehalten werden, wobei der Bereich von Interesse dem Deckglas am nächsten ist, bis die Agarose abkühlt. Die Agarose hält den Embryo in Position, ohne dass der Embryo mindestens einige Minuten rollt. Die Agarose-Montage eignet sich am besten für invertierte Mikroskope, obwohl das Deckglas für den Einsatz auf einem aufrechten Mikroskop sorgfältig invertiert werden kann. Diese Halterung kann zeitaufwändig sein und Embryonen sind in der Regel nicht repositionierbar oder wiederherstellbar. Die Montage von Embryonen auf überbrückten Dias (Abbildung 3D) bietet einen Kompromiss zwischen diesen Methoden. Die überbrückte Halterung ist schnell, und Embryonen können neu positioniert und wiederhergestellt werden. Die Höhe der Brücke kann eine größere Flexibilität in der Gewebedicke und embryonalen Position als flache Halterungen ermöglichen, während die Fähigkeit, von oben oder unten abzubilden, erhalten bleibt. Bei dieser Methode müssen die überbrückten Folien im Voraus vorbereitet werden. Die Dicke des zu montierenden Gewebes bestimmt, wie viele Abdeckungen hoch die Brücke sein muss. Überbrückte Dias können mehrmals für einen Tag wiederverwendet werden, sollten aber nach der Bildgebungssitzung entsorgt werden, da das Glycerin schwierig ist, die Dias zu reinigen, und es wird langsam den Kleber, der die Brücke hält, entfernen.
IHC ist eine effektive Methode zur Bestimmung des Timings und Musters der Proteinexpression in einem Organismus oder Gewebe. IHC hat mehrere Vorteile gegenüber ISH, die relativ niedrige Kosten ist und kann in einem Bruchteil der Zeit in der Regel für ISH erforderlich abgeschlossen werden (2-3 Tage gegenüber 5-8 Tage). Darüber hinaus ist IHC ein besserer Indikator für die Genproduktexpression, da der Nachweis von mRNA-Spiegeln keine posttranskriptiellen und posttranslationalen Prozesse vorhersagt, die die Proteinexpression beeinflussen können. IHC ist auch in der Lage, subzelluläre Lokalisierungsdaten bereitzustellen (obwohl dies bei der Verwendung von DAB-Färbung nicht der Fall ist), was von der ISH nicht gewährt wird. Es ist möglich, eine duale ISH/IHC in Zebrafischen durchzuführen.
IHC hat auch einige Nachteile, vor allem sind Antikörper Verfügbarkeit. Zwar gibt es zahlreiche Antikörper, die von geeigneter Qualität für IHC sind, die Suche nach Antikörpern, die speziell in Zebrafischen arbeiten, ist anspruchsvoller und erfordert oft Tests und Fehlerbehebung Antikörper gegen Säugetierantigene erzeugt. Allerdings gibt es immer mehr Zebrafisch-validierte Antikörper auf dem Markt und die Entstehung der CRISPR/Cas9-Technologie hat es ermöglicht, endogene Proteine durch Genom-Engineering zu epitopisieren. Diese Prozesse sind jedoch zeitaufwändig und herausfordernd und erfordern die Validierung der Proteinfunktion.
Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll kann in jedem Stadium weitgehend bei Zebrafischembryonen und Larven angewendet werden und kann auch auf Gewebe von erwachsenen Tieren angewendet werden. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll auch die Färbung von gefrorenen oder paraffingeschnittenen Proben mit geringer Modifikation. Ganze Mount-Immunhistochemie wurde verwendet, um Neurotransmitter-Rezeptor-Populationen in Muskel zu untersuchen, zeigen Expression der ionotropen NMDA Glutamat-Rezeptor obligatorische Untereinheit 1 bei der Entwicklung von Zebrafisch-Muskel. Diese ziemlich weit verbreitete und diffuse Färbung im sich entwickelnden Muskel steht im Einklang mit der Entwicklungsexpression derselben Rezeptoruntereinheit bei der Entwicklung von Xenopus-Larven21. Dies deutet darauf hin, dass die Expression von Glutamatrezeptoren bei der Entwicklung von Muskeln evolutionär konserviert wird. Insgesamt ist dieses Protokoll wertvoll, um durch den Einsatz von IHC ein besseres Verständnis der Genexpression zu erlangen und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der räumlich-zeitlichen Verteilung der Proteinexpression in Zebrafischen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Informationen offenzulegen.
Acknowledgments
Finanzierung aus dem NIH-Zuschuss 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
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