Summary
Здесь мы представляем протокол для флуоресцентного антитела-опосредованного обнаружения белков в целых препаратах эмбрионов зебры и личинок.
Abstract
Иммуногистохимия является широко используемым методом для изучения экспрессии белка и локализации в нормальных состояниях развития и болезни. Хотя многие протоколы иммуногистохимии были оптимизированы для тканей и тканей млекопитающих, эти протоколы часто требуют модификации и оптимизации для немлекопитающих модельных организмов. Зебрафиш все чаще используется в качестве модели системы в основных, биомедицинских и трансляционных исследованиях для исследования молекулярных, генетических и клеточных биологических механизмов процессов развития. Зебрафиш предлагает много преимуществ в качестве модели системы, но и требуют модифицированных методов для оптимального обнаружения белка. Здесь мы предоставляем наш протокол для всемонтированной флуоресценции иммуногистохимии в эмбрионах зебры и личинок. Этот протокол дополнительно описывает несколько различных стратегий монтажа, которые могут быть использованы и обзор преимуществ и недостатков каждой стратегии обеспечивает. Мы также описываем изменения в этом протоколе, чтобы позволить обнаружение хромогенных субстратов в целой ткани крепления и обнаружение флуоресценции в секционированных личитульных тканях. Этот протокол в целом применим к изучению многих стадий развития и эмбриональных структур.
Introduction
Зебрафиш(Danio rerio) стала мощной моделью для изучения биологических процессов по нескольким причинам, включая короткое время генерации, быстрое развитие и удобство генетических методов. В результате, зебрафиш обычно используются в высокой пропускной связи малых молекул экранов для токсикологических исследований и открытия наркотиков. Зебрафиш также является привлекательной моделью для изучения процессов развития, учитывая, что одна женщина может регулярно производить 50-300 яиц за один раз, а оптически прозрачные эмбрионы развиваются внешне, что позволяет эффективно визуализировать процессы развития. Тем не менее, ранние исследования опирались главным образом на передние генетические экраны с использованием N-этил-N-нитросуреа (ENU) или других мутагенов из-за проблем в создании обратных генетических методов. Примерно два десятилетия назад, морфолинос были впервые использованы в зебрафиш для нокдауна целевых генов1. Morpholinos являются небольшие антисмысловые олигонуклеотиды, которые препятствуют переводу целевой мРНК после микроинъекции в эмбрион на ранней стадии развития. Основным недостатком морфинос является то, что они разбавляются по мере деления клеток и, как правило, теряют эффективность на 72 часа после оплодотворения (hpf). В то время как морфолиносы остаются мощным инструментом для нарушения гена зебры, транскрипционный активатор- эффектоподобный эффект (TALENs), нуклизы цинка-пальца (ЗФН) и кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPRs) в последнее время используются для непосредственной цели генома зебры2,3. Эти обратные генетические стратегии, в сочетании с вперед генетики и высокой пропускной технологии экраны, создали зебры в качестве мощной модели для изучения экспрессии генов и функции.
Способность изучать функцию генов обычно требует оценки пространственно-временного распределения экспрессии генов или генных продуктов. Два наиболее часто используемых методов визуализации таких моделей выражения в начале разработки на месте гибридизации (ISH) и целом горе иммуногистохимии (IHC). На месте гибридизация была впервые разработана в 1969 году и опирается на использование помеченных антисмысловых зондов РНК для обнаружения экспрессии мРНК в организме4. В отличие от этого, помеченные антитела используются в иммуногистохимии для визуализации экспрессии белка. Идея маркировки белков для обнаружения восходит к5 1930-х годов и первый эксперимент IHC был опубликован в 1941 году, когда FITC помечены антитела были использованы для обнаружения патогенных бактерий в инфицированных тканях6. ISH и IHC значительно эволюционировали и значительно улучшились в течение последующих десятилетий и в настоящее время оба регулярно используются в молекулярно-диагностической исследовательской лаборатории7,8,9,10,11. Хотя оба метода имеют преимущества и недостатки, IHC предлагает ряд преимуществ по сравнению с ISH. Практически, IHC гораздо меньше времени, чем ISH и, как правило, дешевле в зависимости от стоимости первичного антитела. Кроме того, выражение мРНК не всегда является надежным показателем экспрессии белка, как было продемонстрировано у мышей и людей, что только около трети вариации изобилия белка можно объяснить изобилием мРНК12. По этой причине, IHC является важным дополнением для подтверждения данных ISH, когда это возможно. Наконец, IHC может предоставить данные субклеточной и совместной локализации, которые не могут быть определены ISH13,14,15. Здесь мы описываем пошаговый метод надежного обнаружения белков иммуногистохимией в целых эмбрионах зебры и личинках. Целью данной методики является определение пространственного и временного выражения белка, интересуемого во всем эмбрионе. Эта технология использует антиген-специфические первичные антитела и флуоресцентно помеченные вторичные антитела. Протокол легко адаптируется к использованию на слайд-установленных секциях тканей и для использования с хромогенными субстратами вместо флуоресценции. Используя этот протокол, мы демонстрируем, что развитие скелетных мышц зебры выражает ионотропные рецепторы глутамата, в дополнение к рецепторам ацетилхолина. NMDA-типа глутаматных рецепторов субъединиц обнаруживаются на продольной мышцы на 23 л.с.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры работы с разведением зебры взрослых и эмбрионов, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию при Университете штата Мюррей.
1. Коллекция и фиксация эмбрионов
- Подготовка нереста танки, поместив взрослых зебры смешанных половых пар или групп в цистернах с сеткой или прорези лайнер аполируется системной водой на ночь.
- При включении света, изменить нереста воды для пресной системы воды для удаления кала. Используйте 14 ч/10 ч светлый темный цикл с огнями, поступающими в 9 утра.
- После того, как яйца будут отложены, верните взрослых в домашние резервуары.
- Соберите яйца, рисуя их с помощью передачи пифет или заливки их в сетку ситечко.
- Перенесите яйца в блюда Петри, заполненные на полпути со средой эмбриона (например, 30% Данио или E2 эмбриона среды с 0,5 мг / л метиленовый синий), ограничивая количество эмбрионов на блюдо до 50.
- Удалите любые яйца, которые мертвы или не делятся.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мертвые эмбрионы могут быть легко идентифицированы, поскольку они становятся непрозрачными и часто появляются "облачно". Если метилен синий добавляется к эмбриону среды, мертвые эмбрионы принимают на темно-синий вид. - Инкубировать блюда из яиц при 28,5 градусах Цельсия, пока они не достигнут желаемой стадии. Для этого эксперимента, поднять эмбрионы до 23 л.с.
- Дополнительно) Передача эмбрионов на 24 л.с. до 200 мкм 1-фенил 2-тиура (ПТУ) в эмбрионе среды для предотвращения меланогенеза16,17. Кроме того, отбеливатель эмбрионов после фиксации (см. необязательный раздел 5).
- Изменение эмбриона среднего или PTU среднего ежедневно.
- Дехорионат без вылупленных эмбрионов с помощью сверхтонких щипцов под стереомикроскоп. Кроме того, химически дехорионат эмбрионов путем инкубации в 1 мг /мл Pronase в эмбрионе среды в течение нескольких минут при комнатной температуре. Удалить эмбрионы из Pronase и мыть три раза с эмбриона среды.
- Дехорионированные эмбрионы будут прилипать к пластику. Храните их в стеклянных или пластиковых чашках Петри, покрытых 1-2% агарозой, растворенного в среде эмбриона. Перемещение дехорионированных эмбрионов с помощью огневой полированной пастерной пастерной плеты, чтобы свести к минимуму ущерб.
- Перенесите эмбрионы в 1,5 мл центрифуговых трубок с помощью пластиковой или огневой трубы.
- Удалить эмбрион среды с микропипеттом. Оставьте только достаточно жидкости, чтобы просто покрыть эмбрионы после каждого изменения жидкости.
- Подготовка 4% параформальдегида (PFA) в 1x фосфат-буфера солей (PBS) в химический капот дыма.
ВНИМАНИЕ: ПФА является опасным материалом. Носите перчатки и утилизировать загрязненные жидкости и твердые вещества в специально отведенных местах. - Исправить эмбрионы в 4% PFA для 1-2 ч с нежным качания при комнатной температуре. Кроме того, исправить эмбрионы 4 ч на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте три раза в 1x PBS и 1% Triton-X (PBTriton) в течение 5 мин.
- Используйте эмбрионы немедленно или хранить при 4 градусах Цельсия в течение 1 недели.
- Для длительного хранения обезвоживать эмбрионы в 100% метанола (MeOH) 2 ч или на ночь при -20 градусах Цельсия. Храните эмбрионы при -20 градусов по Цельсию в MeOH в течение нескольких месяцев.
ВНИМАНИЕ: MeOH является опасным материалом. Носите перчатки и утилизировать загрязненные жидкости и твердые вещества в специально отведенных местах.
2. Подготовка эмбрионов
- Регидратация эмбрионов через последовательные инкубации при комнатной температуре.
- Инкубировать в 75% MeOH/25% 1x PBS в течение 5 мин, качания.
- Инкубировать в 50% MeOH/50% 1x PBS в течение 5 мин, качания.
- Инкубировать в 25% MeOH/75% 1x PBS в течение 5 мин, качания.
- Инкубировать в 100% PBTriton в течение 5 мин, качания.
- (Необязательно) Приготовьте свежий протеиназу K рабочий раствор (10 мкг/мл в PBTriton) на льду, добавив 10 л свежеоттая протеиназа K (10 мг/мл).
- Пермяки эмбрионов путем переваривания до 30 мин в Proteinase K.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемое время является lt;24 hpf: нет пищеварения; 24 л.с.ф.: 15 мин. и 7 дней: 30 мин пищеварения. - Промыть пермяковые эмбрионы в PBTriton и повторно исправить в 4% PFA в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Вымойте эмбрионы три раза в PBTriton в течение 5 минут при комнатной температуре с нежным раскачиванием.
- Пермяки эмбрионов путем переваривания до 30 мин в Proteinase K.
3. Первичная инкубация антител
- Выберите коммерческое блокирующее решение или сыворотку, соответствующую вторичным видам антител(напротив, 10% сыворотки для коз в PBTriton) с или без 2 мг/мл Сыворотки крупного рогатого скота (BSA).
- Блок эмбрионов в блокирующий раствор для 1-3 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию во время раскачивания.
- Инкубировать в первичных антителах, разбавленных в блокирующем растворе или 1% сыворотки в PBTriton на ночь при 4 градусах Цельсия во время раскачивания. В этом эксперименте, основные антитела, используемые были анти-NMDAR1, анти-пан-АМРА рецептор, и анти-фосфо-Histone H3, каждый разбавленной до окончательной концентрации 1:500 в 1% козьей сыворотки в PBTriton.
- Вымойте пять раз в PBTriton в течение 10 минут при комнатной температуре во время качания.
4. Вторичная инкубация антител
- Выберите вторичное антитело на основе вида хозяина первичного антитела и желаемой длины волны.
- Инкубировать во вторичном антителах, разбавленных блокирующим раствором или 1% сыворотки на 2 ч при комнатной температуре (или на ночь при температуре 4 градусов По Цельсию) во время раскачивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные вторичные антитела светочувствительны. Мы использовали 1:500 коза-анти-мышь Alexa488 разбавленной в 1% козьей сыворотки в PBTriton. - Обложка труб с алюминиевой фольгой или крышка с светоблокирующей коробке для этого и всех последующих шагов.
- Вымойте три раза в PBTriton в течение 10 минут при комнатной температуре во время качания.
- Перенесите эмбрионы на 50% глицерол раствор в PBS на кровати 2% агарозы в эмбрионе среды и перейти к документации или приступить к дальнейшей обработки шагов ниже.
Дополнительные шаги
5. Отбеливание
- Подготовка раствора отбеливателя в трубке 1,5 мл, добавив 810,7 л ddH2O, 89,3 л 2 М КН, и 100 л 30% H2O2.
- Перевернуть трубку три раза, чтобы перемешать.
- Пипетка 1 мл направления раствора отбеливателя к эмбрионам.
- Откройте крышку трубки эмбриона, чтобы позволить газу бежать. Аккуратно коснитесь трубки на скамейке, чтобы выбить пузыри.
- Мониторинг процесса отбеливания (при необходимости использовать микроскоп) и остановить реакцию при достаточном удалении пигмента (примерно 5 мин для 24 л.с. или 10 мин за 72 л.с.).
- Тщательно удалите отбеливание раствора с помощью микропипетты и трижды промыть эмбрионы в 1 мл ПБТритона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы липкие в этом шаге. - Приступайке к документации или дальнейшей обработке ниже.
6. Вскрытие эмбрионов и дейолкинг
- Чтобы удалить желток, перенесите небольшое количество (200 евро или достаточно, чтобы полностью покрыть эмбрион, но достаточно ограничительный, чтобы ограничить, где он может плавать) 1x PBS в депрессию слайд или простой слайд стекла.
- Используйте пластиковый трубчатый перенос для перемещения 1 или более эмбрионов в капля PBS.
- Используйте ультра-тонкие щипцы и 00 булавок насекомых, чтобы разбить желток и очень мягко соскребать гранулы желтка от брюшной поверхности эмбриона (см. также Cheng et al., 2014)18.
- Удалите желтковые гранулы и пополнить PBS по мере необходимости.
- Повторяйте до тех пор, пока эмбрион не будет достаточно свободен от желтка.
7. Плоский монтаж на слайдах
- Передача deyolked эмбрионов на заряженную стеклянную горку с пластиковой пипеткой или 1 мл микропайпетса с обрезанным кончиком (для уменьшения напряжения сдвига). Ориентируйся по желанию с наконечником микропайпета 200 л или булавкой для насекомых.
- Wick от избыточного PBS с Ким протрите или бумажное полотенце.
- Добавьте 2-3 капли монтажных носителей на слайд и обложку.
- Воздух сухой в течение примерно 5 до 10 мин.
- Запечатайте крышку стекла на горку с прозрачным лаком для ногтей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Края крышки стекла должны быть полностью покрыты тонким, непрерывным слоем лака для ногтей. - Дайте высохнуть примерно за 10 минут до визуализации.
8. Монтаж в Агароза
- Подготовка 1% агарозы в эмбрионе среды, добавив 0,5 г агарозы до 50 мл эмбриона среды в микроволновой безопасной колбе или стакан по крайней мере 3x больше объема, чем хотелось бы.
- Тепло в микроволновой печи, закрученного каждые 30 с, пока агароза полностью растворяется.
- Сделать 1 мл aliquots в 1,5 мл центрифуговых труб. Храните aliquots при комнатной температуре.
- Крышка трубки крышки с крышкой замки перед нагреванием.
- Поместите агарозные трубки в держатель плавающей трубки в стакан, наполовину заполненный водой.
- Микроволновая печь стакан с плавающими трубками в течение 2-3 мин, или пока агароза полностью расплавлена.
- Перенесите эмбрион на стрижку с помощью пластиковой пипетки или микропипетты объемом 200 л с обрезанным наконечником (для уменьшения напряжения сдвига).
- Расположите эмбрион на прямоугольном облике с помощью булавок насекомых и добавьте примерно 20 плавить агарозы непосредственно к эмбриону.
- Быстро ориентируйте интересуемый регион, используя 00 булавок насекомых.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это перевернутое горе. - Вернуть трубку агарозы в трубку горячей воды плавать между каждым использованием и микроволновой печи по мере необходимости.
- Изображение с помощью микроскопа, когда агароза затвердевает. Держите установленный эмбрион вверх дном для использования на перевернутом микроскопе. Переверните coverslip над (так агароуз находится под coverslip) для использования на вертикальном микроскопах.
9. Монтаж на мостах слайдов
- Чтобы сделать мостовые горки, клей квадрат охватывает охватывает стеклянную горку с помощью небольшой точки суперклея.
ПРИМЕЧАНИЕ: Между крышками должно быть корыто шириной не менее 5 мм. Два #1 крышки высокой, как правило, подходит для 24-48 л.с. эмбрионов в то время как три coverslips высокой может быть необходимо для 72 л.с. - Передача 1-2 deyolked эмбрионов на мостовой слайд с пластиковой пипеткой или 200 мл микропайпетс с обрезанным кончиком (для уменьшения напряжения сдвига).
- Уик от лишней жидкости с Ким протрите или бумажное полотенце.
- Добавьте каплю глицерола 80% непосредственно в эмбрион.
- Накрыть стеклом прямоугольной крышки. Капли глицерола должны коснуться крышки стекла.
- Добавьте больше глицерола в пространство между стеклом крышки и слайд по мере необходимости, чтобы полностью покрыть эмбрион с запасом глицерола по бокам эмбриона.
- Сдвиньте прямоугольное стекло крышки осторожно, чтобы свернуть эмбрион в положение для визуализации.
10. DAB окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел начинается после шага 4.2 выше и заменяет остальную часть шага 4.
- Инкубировать эмбрионы в блокирующий раствор с пероксидаза-конъюгированных вторичных антител для 2 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию во время качания.
- Вымойте три раза в PBTriton в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Перенесите эмбрионы на культурную пластину или скольжение депрессии с помощью перекладины.
- Смешайте 50 л 1% DAB (3,3'-диаминобензидин) растворяется в ddH2O и 50 Л 0,3% перекиси водорода и довести до 1 мл с PBS.
ВНИМАНИЕ: DAB является опасным материалом. Носите перчатки и утилизировать DAB загрязненных жидкостей и твердых веществ в специально отведенных местах. - Обложка HRP-окрашенных эмбрионов с dAB решение подготовлено выше и контролировать для развития цвета (обычно 1-5 мин) под микроскопом.
- После достижения желаемого уровня развития цвета, промыть эмбрионы кратко в PBS.
- Перед фиксацией перенесите эмбрионы обратно в трубку длиной 1,5 мл.
- Повторно исправить эмбрионы в течение 15-20 мин в 4% PFA при комнатной температуре.
- Вымойте эмбрионы три раза в PBTriton в течение 5 мин.
- Приступай к документации.
11. Измененный протокол для окрашивания секционированных тканей, установленных на слайдах
- Окружить ткани, которые будут окрашены пап перо.
- Перенесите слайды во влажную камеру.
- Добавьте 1 мл PBS непосредственно к слайду.
- Инкубировать 7 мин при комнатной температуре, чтобы удалить встраивающую среду.
- Налейте PBS путем инвертирования слайда.
- Регидратировать 1 мин в до 1 мл тротила буфера (100 мм Tris pH 8.0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween20).
- Блокируйте до 1 мл блокирующего раствора (коммерческого или 10% сыворотки и 2% BSA) на 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубировать на ночь в первичных антителах, разбавленных в 1% сыворотке или блокирующем растворе при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте пять раз в до 1 мл тротила буфера при комнатной температуре.
- Инкубировать во вторичном антителах в течение 2 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию. Накройте камеру фольгой или используйте темную крышку.
- Вымойте пять раз в тротиловом эквиваленте при комнатной температуре. Вылейте последнюю стирку.
- Гора с 2-3 каплями крепления среднего и coverslip. Пусть сидит 5-10 мин.
- Печать крышки стекла на слайд с помощью прозрачного лака для ногтей. Дайте полностью высохнуть перед визуализацией.
12. Документация
- Запись полной процедуры и любых отклонений в лабораторном блокноте.
- Запись концентрации, имя, номер каталога, производитель, и номер партии первичного антитела.
- Поместите надлежащим образом установленный образец на стадии микроскопа. Найдите интересуемый регион.
- Выберите относительно яркий пример. Установите экспозицию камеры и получить так, что сигнал достаточно яркий без насыщения.
- Сравните интенсивность окрашивания одной и той же области интереса, используя одни и те же настройки экспозиции при сравнении между экспериментальными эмбрионами с маркировкой антител и контрольными антителами (например, IgG) эмбрионами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целая гора иммуногистохимии использует антитела для обнаружения пространственной картины экспрессии белка в нетронутом животном. Основной рабочий процесс иммуногистохимии (изображенный на рисунке 1)включает в себя разведение зебры, выращивание и приготовление эмбрионов, блокирование неспецифических антигенов, использование антигена конкретных первичных антител для целевой белок интерес, выявление, что первичное антитело с помечены вторичного антитела, монтаж образца, и документирование выражения.
Целая гора иммуногистохимии является ценным инструментом для изучения пространственной и височной экспрессии белка во время развития зебры. Зебрафиш экспонат спонтанные сокращения опосредовано разрыв узлов, начиная с до 19 л.с. - до контакта моторного нейрона19. Нейромышечный стык зебры, как и другие позвоночные, опосредовано ацетилхолином, действующим на никотиновых рецепторов ацетилхолина. Эти собранные рецепторы впервые обнаружены примерно при 16 л.с. и экспрессия расширяется и переделывается по мере того, как нейроны образуют контакты20. Исследования у лягушек21 и крыс22 показывают, что скелетные мышцы позвоночных также могут выражать ионотропные рецепторы глутамата. Целая гора иммуногистохимии для GluN1 субъединицы NMDA типа глутамата рецептора показывает выражение глутамата рецепторов субъединиц на протяжении развивающихся мышц зебры на 23 л.с.(Рисунок 2). Это соответствует примерно со сроками иннервации моторных нейронов. Выражение было сравнено к никаким главным образом зародышам управления для того чтобы обусловить флуоресценцию предпосылки рыб и вторичного антитела и к мыши IgG 2 мкг/мл для того чтобы обусловить относительные вклады nonспецифического связывания антигена. Рецепторы глутамата типа АМРА не были обнаружены в мышцах на данном этапе развития. Концентрации антител перечислены в таблице 1. Для создания этих изображений, эти эмбрионы были обработаны, как описано в этом протоколе ни с одним из факультативных шагов, за исключением deyolking. Эмбрионы были плоскими установлены и coverslipped(Рисунок 3B).
Разделение клеток выражают различные модификации гистона из тихих клеток, которые могут быть обнаружены иммуногистохимией с помощью антител, которые распознают конкретные изменения, такие как фосфорилирование белка. Фосфорилирование гистона 3 при серине 10 связано с делением клеток23. Модификации, представленные в этот протокол для адаптации иммуногистохимии к секционной ткани, которая установлена на слайдах, были использованы для обнаружения размножающихся клеток в личиночном мозге зебры. Замороженные секции 72 л.с. эмбрионов были установлены на слайдах и иммуноокрашенные для p-H3(рисунок 4). Несколько клеток выражают р-Н3, и выражение наиболее заметно в желудочковых зонах. Выражение было сравнено к никаким первичным зародышам управления и к мыши 2 мкг/мл IgG для того чтобы обусловить относительные вклады nonспецифического связывания антигена.
| Антитела | Целевой | Концентрации |
| Мышь IgG Изотип Управления | Неспецифические антигены | 2 мкг/мл |
| Мышь анти-NMDAR1 | Подразделение GluN1 | 1:1,000 |
| Коза анти-мышь Alexa488 | Мышь IgG | 1:500 |
| Мышь Антифосфо-H3 | фосфорилированный histone H3 | 1:500 |
| Мышь Анти-пан-АМПА рецептор | GluR1-4 | 1:500 |
Таблица 1: Список используемых антител и концентраций.
Рисунок 1: Flowchart всей процедуры иммуногистохимии. Основной рабочий процесс процедуры заключается в разведении рыбы; собирать и готовить эмбрионы; блок неспецифических антигенов; инкубировать в первичных и вторичных антителах в серии; монтировать ткань; и документ. Дополнительные шаги указаны небольшими стрелками в соответствующей точке рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схемы личинки и NMDA рецептор IHC репрезентативные результаты. Использование целой скрепы иммуногистохимии тестировало экспрессию рецепторов глутамата в развитии мышц. Указана ориентация и область интереса на уровне 23 л.с. Сигнал не был обнаружен, когда первичные антитела не были включены. Мышь IgG управления антитела показывает низкий уровень неспецифического выражения. ГлюН1 субъединица Рецептора глутамата типа NMDA (NMDAR) выражается в развивающейся мышце, с более высокими концентрациями на границах сомита (стрелы). Рецепторы глутамата типа АМРА (AMPAR) не выражены на данном этапе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схема монтажных схем. ( A) Эмбрион, затонувший в 50% глицерола, может быть легко перемещен. (B) Эмбрион плоский установлен на слайде в монтажной среде могут быть сохранены и изображены на более поздний срок. (C) Эмбрион, установленный в капле 1% агарозы может быть зафиксирован в состоянии, чтобы увидеть трудный регион. (D) Эмбрион, установленный в глицероле на мостовой горке, может быть свернут и перемещен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты IHC в секционированной ткани. Используя протокольные изменения в факультативных шагах, иммуногистохимия протестирована на наличие размножающихся клеток в личиночном мозге зебры на уровне 72 л.с. Мышь IgG управления антитела и исключения первичных антител выявить низкий уровень неспецифического выражения. Как маркер размножающихся клеток, p-H3 выражается в отдельных местах, включая желудочковые зоны (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Иммуногистохимия является универсальным инструментом, который может быть использован для характеристики пространственно-временного выражения практически любого белка, интересующегося организмом. Иммуногистохимия используется на самых разнообразных тканях и модельных организмах. Этот протокол был оптимизирован для использования в зебрафиш. Иммуногистохимия у различных видов может потребовать различных методов фиксации и обработки, блокируя растворы в зависимости от вида и наличия эндогенных пероксидазах, а также инкубационные сроки из-за толщины и состава тканей. IHC в зебрафиш был неотъемлемой частью в продвижении нашего понимания рака24, метаболические заболевания25, неврологические расстройства26, и многие другие области, имеющие большое значение для здоровья человека. Одним из основных преимуществ IHC является то, что процедура является относительно короткой по сравнению с другими методами, такими как ISH, и не является технически сложной. Есть, однако, многочисленные шаги, которые требуют оптимизации в зависимости от возраста образцов, антиген мишенью, и антитела используются.
Длительность нескольких шагов в этом протоколе является гибкой. Длительность, указанная для гибких шагов, как указано, представляет собой минимальное обычно требуется. В общем, всякий раз, когда эмбрионы промывают три или более раз в PBTriton, они могут храниться на ночь при 4 градусах Цельсия в последней стирке, если это необходимо. Время пермяки и фиксации менее гибкие и должны быть скорректированы только с преднамеренным намерением как часть стратегии устранения неполадок. Мы отметили несколько моментов в протоколе, которые не являются обязательными для того, чтобы показать, как эти шаги могут быть интегрированы в рабочий процесс, как это экспериментально актуально. Например, если пигментация мешает обнаружению сигнала, предотвратить меланогенз путем лечения ПТУ или отбеливатель фиксированных эмбрионов. Отбеливание может привести к повреждению тканей, поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы свести к минимуму время, проводимое эмбрионами в отбеливателе. Тем не менее, отбеливание может быть предпочтительнее pTU лечения, которое может повлиять на определенные аспекты развития27,28,29,30. Мы также представляем варианты флуоресцентного и хромогенного обнаружения. Если флуоресценция не желательна или если антиген производит сигнал, который слишком слаб, чтобы быть адекватно обнаружены флуоресценционной микроскопией, хромогенное обнаружение может быть достигнуто с помощью кунжадного антитела хрена (HRP).
Самой большой проблемой IHC у зебры является поиск подходящих антител. Действительно, ISH часто используется в качестве прокси для экспрессии белка, когда коммерческие антитела не доступны для желаемого белка интереса. Многие коммерческие антитела предназначены для целей млекопитающих и эпитопы не всегда сохраняются в зебрафиш. При наличии, выберите коммерчески доступные антитела, которые были протестированы на зебры. Мы обнаружили, что антитела, которые распознают антигены, которые являются йgt;80% сохраняется между зебрафиш и целевых видов, как правило, работают в зебрафиш. Мы также обнаружили, что антитела, которые, как было показано, работают в птицах и / или земноводных в дополнение к млекопитающим, как правило, также работают в зебры, даже если эффективность в зебрафиш не был протестирован. Как правило, поликлональные антитела, разработанные против антигена млекопитающих, с большей вероятностью обнаруживают гомологи зебры, чем моноклональные антитела из-за их более низкой специфичности. Всякий раз, когда тестирование нового антитела, это полезно для запуска положительного эксперимента контроля с использованием перекрестных связанных целевой пептид, ткани млекопитающих или клеток, которые, как известно, выражают белок, или клетки, которые выражают репортер астративные. Антитела также могут быть проверены западной помарки, чтобы проверить размер целевого антигена.
В то время как большинство коммерческих антител обеспечивают предлагаемый диапазон разбавления для IHC, важно эмпирически определить разбавление, которое работает лучше всего. Концентрации антител, которые являются слишком высокими часто приводят к неспецифическим окрашивания и увеличение фона, в то время как слишком мало антител не может обеспечить заметный сигнал. В зависимости от антитела и антигена, это может быть выгодно сначала permeabilize эмбрионов, как описано в шаге 3.2 выше, однако, этот шаг не может быть необходимым, а в некоторых случаях может привести к снижению сигнала. Этот протокол использует Triton-X-100 в качестве моющего средства, которое проникает в клетки, что может быть достаточно для тонкой ткани или поверхностного выражения. Глубокие или толстые ткани, такие как глубокие области мозга или старые личинки, могут потребовать протеиназа пермяки. И наоборот, Triton-X-100 следует исключить из всех шагов, когда иммуномаркировка только белки на поверхности клетки желательно над маркировкой внутриклеточных белков. Длительность блокирующего шага, а также выбор коммерческого блокирующего решения по сравнению с использованием сыворотки и BSA также могут быть скорректированы для коррекции чувствительности к антителам и окрашивания фона. Высокие концентрации сыворотки, используемые в блокировании (10% в этом протоколе) может уменьшить фоновое окрашивание, хотя должны быть разбавлены, когда антитела присутствует, чтобы свести к минимуму маскировки антитела связывания сайтов. Блокирующие растворы на растительной основе могут быть полезными, если фоновый сигнал стабильно высок, даже при низких разбавлениях антител (1:1 000). Наконец, чувствительность может быть точно настроена строгостью стинетельности стихов. Это может быть необходимо увеличить или уменьшить продолжительность пост-антитела мыть шаги, а также настроить количество Triton-X-100 в PBTriton. Типичные рабочие диапазоны PBTriton охватывают от 0,2% до 1,0% Triton-X-100. Это хорошая практика при использовании нового антитела для окрашивания отрицательных эмбрионов контроля с первичными IgG и помечены вторичные антитела для определения специфики антител и выявления потенциальных ложноположительных сигналов.
Если оптимизация антител не может дать положительный сигнал, это может быть связано с фиксацией маскировки антигена. Как правило, фиксация в 4% PFA не маскирует антиген сайтов для предотвращения связывания антител, хотя антиген маскировки иногда происходит с некоторыми антителами. Извлечение антигена может привести к повреждению эмбриона, но рабочий протокол был описан Иноуэ и Wittbrodt31. Кроме того, если выбранное антитело несовместимо с 4% PFA или если PFA приводит к клеточным изменениям морфологии, метанол, 2% трихлороацетической кислоты, или glyoaxal может быть использован для фиксации образцов27. Совместимость антитела с формальдегидной фиксацией должна быть определена эмпирически. Если положительный контрольный сигнал не может быть получен после фиксации PFA, возможно, стоит попробовать альтернативный фиксатор, такой как метанол. Альтернативные протоколы фиксации также могут быть необходимы для первичных антител, которые были подняты против конъюгированных антигенов (таких как ГАМК-BSA).
Существует несколько эффективных вариантов установки эмбрионов зебры с иммунозакрайной для визуализации. Эмбрионы могут быть переданы в чашку Петри глицерола, расположены с булавками или щипцами, и изображены либо с широким видом сверху или снизу изображения через блюдо с перевернутым микроскопом (Рисунок 3A). Этот метод прост, быстр и носит временный характер. Недостатки включают склонность эмбрионов к раскатывать фокус в жидком глицероле, потенциальные отражения от поверхности глицерола в блюде, и сложность визуализации через толстую тарелку. Эмбрионы могут быть установлены плоские на стеклянных сторонах(рисунок 3B) с монтажом среды, крышки, и лак для ногтей. Эти крепления можно рассматривать на вертикальном или перевернутом микроскопе. Эмбрионы, подготовленные таким образом, могут быть подготовлены заранее, а слайды хранятся при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока не будут сохранены изображения, или могут быть сохранены и переобрадены позже. Это может быть особенно выгодно, когда время изображения ограничено. К недостаткам этого крепления относятся ограниченные возможности положения эмбриона и толщины тканей, а также неспособность перепозиционировать или восстанавливать эмбрионы. Эмбрионы, установленные таким образом, часто нуждаются в дейолкинге, так как гранулы желтка являются автоматически флуоресцентными в наиболее часто используемых каналах флуоресценции и не могут быть перемещены или удалены после монтажа. Когда интересующая область требует сложного позиционирования эмбриона, наиболее выгодно смонтировать эмбрионы в 1% агарозы на крышке(рисунок 3С). Эмбрион может быть проведен в положении с насекомыми булавки с областью интереса ближе всего к крышке стекла, пока агароза охлаждается. Агароз будет держать эмбрион в положении без эмбриона прокатки, по крайней мере несколько минут. Агароуз монтаж лучше всего подходит для перевернутых микроскопов, хотя крышка стекла могут быть перевернуты тщательно для использования на вертикальном микроскопе. Это горе может занять много времени, и эмбрионы, как правило, не репозиционируемыили или восстанавливаются. Монтаж эмбрионов на мостовых слайдах(Рисунок 3D) предлагает некоторый компромисс между этими методами. Мостовая гора быстро, и эмбрионы могут быть перемещены и восстановлены. Высота моста может позволить большую гибкость в толщине ткани и положении эмбриона, чем плоские крепления, сохраняя при этом способность к изображению сверху или снизу. Этот метод требует подготовки мостовых слайдов заранее. Толщина ткани, которая будет установлена диктует, сколько coverslips высоко мост должен быть. Мостовые горки могут быть повторно использованы несколько раз в течение одного дня, но должны быть удалены после сеанса изображения, потому что глицерол трудно очистить от слайдов, и он будет медленно выбить клей проведения моста.
IHC является эффективным методом для определения времени и структуры экспрессии белка в организме или ткани. IHC имеет ряд преимуществ перед ISH в том, что является относительно низкой стоимостью и может быть завершена в долю времени, как правило, необходимо для ISH (2-3 дней против 5-8 дней). Кроме того, IHC является лучшим показателем экспрессии генных продуктов, так как обнаружение уровней мРНК не предсказывает посттранскриптонные и постпереводные процессы, которые могут повлиять на экспрессию белка. IHC также способен предоставлять данные о субклеточной локализации (хотя это не так при использовании DAB окрашивания), что не предоставляется ISH. Можно выполнить двойной ISH/IHC у зебры.
IHC также имеет некоторые недостатки, прежде всего среди них антитела доступности. Хотя Есть многочисленные антитела доступны, которые имеют подходящее качество для IHC, найти антитела, которые конкретно работают в зебрафиш является более сложной задачей и часто требует тестирования и устранения неполадок антител, генерируемых против антигенов млекопитающих. Тем не менее, Есть все большее число зебры проверенных антител на рынке и появление технологии CRISPR/Cas9 позволило эпитоп теги эндогенных белков с помощью генома инженерии. Эти процессы отнимают много времени и сложной задачей, однако, и требуют проверки функции белка.
Протокол, описанный в настоящем докладе, может широко использоваться на эмбрионах и личинках зебры на любом этапе и может быть применен к тканям взрослых животных. Кроме того, этот протокол также позволяет окрашивать замороженные или парафинированные образцы с небольшими изменениями. Целая гора иммуногистохимия была использована для изучения нейромедиатора рецепторов населения в мышцах, выявление выражения ионотропного NMDA глутамат рецептора обязательного подразделения 1 в развивающихся мышцзе зебры. Это довольно широкое и рассеянное окрашивание по всей развивающейся мышце согласуется с выражением развития того же подразделения рецепторов в развивающихся личинок Xenopus21. Это говорит о том, что выражение рецепторов глутамата в развивающихся мышцах эволюционно сохраняется. В целом, этот протокол ценен для получения лучшего понимания экспрессии генов с помощью IHC и обеспечивает мощный инструмент для определения пространственно-временного распределения экспрессии белка у зебры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскроют информацию.
Acknowledgments
Финансирование из гранта NIH 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
References
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J.
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
