Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.
Abstract
אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לחקור ביטוי חלבונים ולוקליזציה במהלך מצבי התפתחות נורמלית ומחלות. למרות שפרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה רבים הוטלו לצורך מקטעי רקמות ורקמות, פרוטוקולים אלה דורשים לעתים קרובות שינוי ואופטימיזציה עבור אורגניזמים מודל שאינם יונקים. מערכת זברפיש משמשת יותר ויותר כמערכת מודל במחקר בסיסי, ביולוגי וטרנסלזמי לחקירת מנגנוני ההתפתחות המולקולריים, הגנטיים והסלולאריים של התהליכים ההתפתחותיים. Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמערכת מודל, אבל גם דורשים טכניקות שונות עבור זיהוי חלבון אופטימלי. כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו לגבי. פרוטוקול זה מתאר בנוסף כמה אסטרטגיות הרכבה שונות שניתן ליישם וסקירה של היתרונות והחסרונות שכל האסטרטגיה מספקת. כמו כן, אנו מתארים שינויים בפרוטוקול זה כדי לאפשר זיהוי של מצעים כרומוגניים ברקמות הר שלמות וזיהוי של קרינה ברקמת זחל מנות. פרוטוקול זה חל באופן כללי על חקר שלבים ומבנים עובריים רבים.
Introduction
הדגים (danio rerio) התפתחה כמודל רב עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים מכמה סיבות כולל זמן הדור הקצר, התפתחות מהירה, ואת היכולת הגנטית לטכניקות גנטיות. כתוצאה מכך, הדגים משמשים בדרך כלל בתפוקה גבוהה של מולקולת מולקולה קטנה עבור מחקר הרעילות וגילוי הסמים. Zebrafish הם גם מודל אטרקטיבי למחקר של תהליכים התפתחותיים בהתחשב כי נקבה אחת יכולה לייצר באופן שגרתי 50-300 ביצים בכל פעם, העוברים ברורים באופן ברור לפתח באופן חיצוני המאפשר הדמיה יעילה של תהליכים התפתחותיים. עם זאת, מחקר מוקדם הסתמך בעיקר על מסכי גנטיות קדימה באמצעות N-אתיל-N-הניטרוסוראה (אנו) או אחרים מוטגנים בשל אתגרים בהקמת טכניקות גנטיות הפוכה. בערך לפני שני עשורים, שורגוולנוס. השתמשו לראשונה ב-"דג" כדי להוריד גנים ממוקדים1 מורגוולנוס הם מיעוט אנטי-היגיון קטן, העכב את התרגום של mRNA המטרה לאחר ההזרקה לעובר בשלב התפתחותי מוקדם. החולשה העיקרית של מורגוולנוס היא שהם מדולל כמו תאים הפער בדרך כלל לאבד את היעילות על ידי 72 שעות לאחר הפריה (hpf). בעוד מורגוולנוס להישאר כלי רב עוצמה עבור דג זברה גנים שיבוש, שעתוק activator כמו אפקטור נוקלאוסיס (talens), אבץ-האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), ו מקובצים באופן קבוע במרווחים קבועים palin,הגנוםהקצר (crisprs) הם יותר לאחרונה בשימוש ישירות המטרה הגנטית zebra אלה אסטרטגיות גנטיות הפוכה, בשילוב עם גנטיקה קדימה מסכי תפוקה גבוהה, הקימו את דג זברה כמודל רב עוצמה כדי ללמוד ביטוי גנים ותפקוד.
היכולת ללמוד את פונקציית הגנים דורשת בדרך כלל הערכה של התפלגות הזמן הזמני של גנים או ביטוי מוצר גנטי. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר כדי להמחיש דפוסי ביטוי כאלה במהלך ההתפתחות המוקדמת נמצאים היברידיזציה באתרו (ISH) ואת כל הר אימונוהיסטוכימיה (IHC). באתר היברידיזציה פותחה לראשונה בשנת 1969 ומסתמך על השימוש בבדיקות אנטי-RNA המותווית נגד היגיון כדי לזהות ביטוי mRNA באורגניזם4. לעומת זאת, נוגדנים המסומנים בתווית משמשים ב אימונוהיסטוכימיה כדי להמחיש את הביטוי חלבון. הרעיון של תיוג חלבונים לאיתור תאריכיםשל שנות ה -30 ו- ihc הראשון הניסוי פורסם בשנת 1941 כאשר נוגדנים fitc התווית שימשו כדי לזהות חיידקים פתוגניים ברקמות הנגועות6. ISH ו-ihc התפתחו והשתפרו באופן משמעותי במהלך העשורים הבאים וכעת הן בשימוש שגרתי במעבדת המחקר המולקולרית והאבחוני7,8,9,10,11. בעוד שתי טכניקות יש יתרונות וחסרונות, IHC מציע מספר יתרונות על ISH. למעשה, IHC הוא הרבה פחות זמן רב מאשר ISH והוא בדרך כלל פחות יקר בהתאם לעלות של הנוגדן העיקרי. בנוסף, ביטוי mRNA אינו תמיד ממדד אמין של חלבון ביטוי כפי שהוא הוכח עכברים ואנשים שרק על שליש של וריאציה שפע של חלבון ניתן להסביר על ידי mRNA שפע12. מסיבה זו, IHC היא תוספת חשובה לאישור נתוני ISH, כאשר הדבר אפשרי. לבסוף, ihc יכולים לספק נתוני התאמה לשפות משנה ולוקליזציה משותפים שאינם ניתנים לקביעה על-ידי ISH13,14,15. כאן, אנו מתארים שיטה צעד אחר צעד כדי לזהות באופן מהימן חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה בכל העוברים הר דג זברה וזחלים. המטרה של טכניקה זו היא לקבוע את הביטוי המרחבי והזמני של חלבון מעניין בעובר כולו. טכנולוגיה זו משתמשת אנטיגן העיקרי נוגדנים ומתויג באמצעות נוגדנים משניים מסומנים. הפרוטוקול הוא להתאמה בקלות לשימוש על מקטעים רקמה רכוב שקופיות לשימוש עם מצעים כרומוגניים במקום של זריחה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים כי פיתוח שריר השלד דג זברה מבטא קולטני גלוטמט ביונוספטרופי, בנוסף קולטני אצטילכולין. NMDA-type גלוטמט לקולטן תת יחידות לזיהוי על שריר האורך ב -23 hpf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליכים לעבודה עם מבוגרים הרבייה והעוברים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מורי סטייט.
1. איסוף העובר וקיבוע
- הכנת טנקים המכינות ידי הצבת דג זברה מבוגרים זוגות סקס או קבוצות בטנקים עם רשת שינוי או הצמד ממולא מים מערכת בלילה.
- באור דולק, לשנות את המים ההשכן המיכל עבור מים מערכת טריים להסיר צואה. השתמש מחזור כהה של 14 h/10 h עם אורות מתקרבים ב -9 בבוקר.
- , ברגע שהביצים מטילות. החזר את המבוגרים למיכלי הבית
- לאסוף ביצים על ידי ציור אותם באמצעות pipet העברה או לשפוך אותם לתוך מסננת רשת שינוי.
- להעביר את הביצים לצלחות פטרי מילא באמצע הדרך עם העובר בינוני (כגון 30% Danieau או בינוני העובר של E2 עם 0.5 mg/L מתילן blue), הגבלת מספר העוברים לצלחת ל50.
- הסר את כל הביציות המתות או שאינן מתחלקת.
הערה: עוברים מתים יכולים להיות מזוהים בקלות כאשר הם נעשים אטומים ולעתים קרובות מופיעים "מעונן". אם מתילן כחול מתווסף למדיום העובר, העוברים המתים לקחת מראה כחול כהה. - מנות מודגרות של ביצים ב-28.5 ° c עד שיגיעו לשלב הרצוי. לניסוי זה, להעלות את העוברים עד 23 hpf.
- אופציונלי) להעביר את העוברים ב 24 hpf כדי 200 μm 1-פניקסיל 2-thiourea (ptu) במדיום העובר כדי למנוע melanogenesis16,17. לחילופין, עוברים מלבין שלאחר הקיבעון (ראו מקטע אופציונלי 5).
- שינוי בינוני העובר או בינונית PTU מדי יום.
- העוברים מורורonate בעזרת מלקחיים אולטרה-עדינים מתחת לstereomicroscope. לחילופין, העוברים כימית באמצעות דגירה של 1 מ"ג/mL בתוך בינונית העובר במשך כמה דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את העוברים מהפרואז ושטפו שלוש פעמים במדיום העובר.
- עוברים בעלי כורייתם. נדבקים לפלסטיק לשמור אותם בזכוכית או בצלחות פטרי מצופה עם 1-2% agarose התפרקה במדיום העובר. להעביר עוברים למטה באמצעות אש מלוטש פסטר הכומר כדי למזער את הנזק.
- להעביר את העוברים כדי 1.5 mL צנטריפוגה צינורות באמצעות פלסטיק או אש מלוטשת pipet.
- להסיר מדיום העובר עם מיקרופיפטה. להשאיר מספיק נוזל רק כדי לכסות את העוברים אחרי כל שינוי נוזל.
- הכינו 4% פאראפורמלדהיד (כיתה) בתמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS) בתוך מכסה כימי.
התראה: המטה הוא חומר מסוכן. לבשו כפפות ולהיפטר מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים. - לתקן את העוברים ב 4% בכיוון כיתה של 1-2 h עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. לחלופין, תקנו את העוברים 4 שעות עד לילה ב -4 ° c.
- כביסה שלוש פעמים ב-1x PBS + 1% טריטון-X (PBTriton) עבור 5 דקות.
- השתמשו בעוברים באופן מיידי או היאחסנו ב -4 ° c עד שבוע אחד.
- עבור אחסון לטווח ארוך, המייבשים את העוברים ב 100% מתנול (MeOH) 2 h או לילה ב-20 ° c. לאחסן את העוברים ב-20 ° c ב-MeOH במשך כמה חודשים.
התראה: MeOH הוא חומר מסוכן. לבשו כפפות ולהיפטר מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים.
2. הכנה לעובר
- מימה מחדש את העוברים באמצעות incubations סדרתי בטמפרטורת החדר.
- דגירה ב 75% MeOH/25% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.
- דגירה ב 50% MeOH/50% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.
- מודקון ב 25% MeOH/75% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.
- דגירה ב 100% PBTriton עבור 5 דקות, נדנדה.
- אופציונלי הכנת מעבד טרי מפרוטאינאז K פתרון עבודה (10 μg/mL ב PBTriton) על הקרח על ידי הוספת 10 μL של מלאי המופרש החדש של מניות פרוטטינואז K (10 מ"ג/mL).
- החדירות העוברים על ידי לעכל עד 30 דקות ב פרוטטינואז K.
הערה: העיתוי המוצע הוא < 24 hpf: ללא עיכול; 24 hpf: 15 דקות העיכול; ובגיל 7 ימים: 30 דקות של עיכול. - לשטוף עוברים החדירות ב PBTriton ו-לתקן מחדש ב 4% הכיור עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- רוחצים את העוברים שלוש פעמים ב PBTriton עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה.
- החדירות העוברים על ידי לעכל עד 30 דקות ב פרוטטינואז K.
3. הנוגדן העיקרי דגירה
- בחר פתרון חסימה מסחרית או סרום התואם את המינים מארח הנוגדן המשני (ex. 10% סרום עז ב PBTriton) עם או בלי 2 מ"ג/mL סרום הפרה אלבומין (BSA).
- לחסום את העוברים בפתרון חסימת עבור 1-3 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° צ' בעת הנדנדה.
- דגירה של הנוגדן העיקרי מדולל בפתרון חסימה או 1% סרום ב PBTriton לילה ב 4 ° צ' בעת נדנדה. בניסוי זה, הנוגדנים העיקריים ששימשו היו anti-NMDAR1, קולטן אנטי פאן-אמפא, ו anti-פוספהו-Histone H3, כל אחד מדולל לריכוז הסופי של 1:500 ב 1% סרום עז ב PBTriton.
- כביסה חמש פעמים ב PBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.
4. הדגירה הנוגדן המשני
- בחר נוגדן משני המבוסס על המינים המארחים של הנוגדן העיקרי ואת אורך הגל הרצוי.
- דגירה של נוגדן משני מדולל בפתרון חסימה או 1% סרום עבור 2 h בטמפרטורת החדר (או לילה ב 4 ° c) בזמן נדנדה.
הערה: נוגדנים משניים בפלורסנט רגישים לאור. השתמשנו 1:500 עז נגד עכבר Alexa488 מדולל ב 1% סרום עז ב PBTriton. - לכסות את הצינורות עם רדיד אלומיניום או לכסות עם תיבת חסימת אור עבור זה ואת כל הצעדים הבאים.
- שטוף שלוש פעמים ב PBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.
- העבר את העוברים לתמיסת גליצרול של 50% ב-PBS על מיטה של 2% agarose במדיום העובר והמשך לתיעוד או המשך לשלבי עיבוד נוספים להלן.
שלבים אופציונליים
5. הלבנת
- הכנת פתרון אקונומיקה בצינור 1.5 mL על ידי הוספת 810.7 μL של ddH2O, 89.3 μl של 2 M KOH, ו 100 μl של 30% H2O2.
- היפוך הצינור שלוש פעמים כדי לערבב.
- פיפטה 1 מ ל של כיוון פתרון אקונומיקה לעוברים.
- פתח את מכסה צינור העובר כדי לאפשר גז להימלט. הקש בעדינות על השפופרת על הספסל כדי להוציא בועות.
- נטר את תהליך הלבנת (להשתמש במיקרוסקופ אם יש צורך) ולהפסיק את התגובה כאשר הפיגמנט הוא הוסר מספיק (כ 5 דקות עבור 24 hpf או 10 דקות עבור 72 hpf).
- הסר בזהירות את הפתרון הלבנת עם מיקרופיפטה ושטוף עוברים שלוש פעמים ב 1 מ ל של PBTriton.
הערה: עוברים נדבקים בשלב זה. - המשך לתיעוד או להמשך עיבוד שלבים להלן.
6. ניתוח העובר ודילקינג
- כדי להסיר את החלמון, להעביר כמות קטנה (~ 200 μL או מספיק כדי לכסות לחלוטין את העובר אך מגביל מספיק כדי להגביל את המקום שבו הוא יכול לצוף) של 1x PBS לשקופית דיכאון או שקופית זכוכית פשוטה.
- השתמש באמצעות העברת פלסטיק העברה לנוע 1 או יותר עוברים ל-droplet של PBS.
- השתמש מלקחיים אולטרה דק ו-100 פינים חרק לשבור את החלמון בעדינות מאוד בגרגרים החלמון של משטח המים של העובר (ראה גם צ'נג et al., 2014)18.
- להסיר גרגרי חלמון ולחדש את PBS לפי הצורך.
- חזור על הפעולה עד שעובר יהיה נקי מספיק מחלמון.
7. הרכבה שטוחה בשקופיות
- העבר עוברים להחליק על שקופית זכוכית טעונה עם פיפטה פלסטיק או מיקרופיפטה 1 mL עם קצה חתוך (כדי להפחית את הלחץ ההטיה). אוריינט כרצונך עם טיפ מיקרופיפטה ב200 μL או סיכת חרק.
- וויק התרחק מעודפי PBS עם מגבת של קים או נייר.
- הוסף 2-3 טיפות של מדיה הרכבה לשקופית ו coverslip.
- האוויר יבש במשך כ 5 עד 10 דקות.
- אטום את הזכוכית המכסה על השקופית עם לק ברור.
הערה: הקצוות של זכוכית העטיפה חייבים להיות מכוסים לחלוטין בשכבה דקה ורציפה של לק ציפורניים. - אפשר לייבש כ 10 דקות לפני הדמיה.
8. הרכבה באגקם
- להכין 1% agarose במדיום העובר על ידי הוספת 0.5 g של agarose כדי 50 mL של בינוני העובר בבקבוקון בטוח במיקרוגל או בגביע של לפחות 3x נפח גדול יותר מאשר הרצוי.
- חום במיקרוגל, מתערבל כל 30, עד שעלה התפרקה לחלוטין.
- לעשות 1 mL משבצינורות צנטריפוגה 1.5 mL. מאחסנים את הליטים בטמפרטורת החדר.
- כיסוי שפופרת עם מנעולי כובעים לפני החימום.
- מניחים מנורות במחזיק צינור צף בתוך מיכל חצי מלא מים.
- מיקרוגל את הגביע עם צינורות צף עבור 2-3 דקות, או עד agarose הוא נמס לחלוטין.
- העבר עובר לשקופית הגישור עם פיפטה פלסטיק או מיקרופיפטה מ200 μL עם קצה חתוך (כדי להקטין את מתח ההטיה).
- מיקום העובר על שמיכות מלבני באמצעות סיכות חרק ולהוסיף כ 20 μL נמס מומסת ישירות העובר.
- במהירות המזרח את אזור הריבית הקרובה ביותר שמיכות באמצעות 100 פינים חרק.
הערה: זהו הר הפוך. - החזר את הצינור האגקם אל צינור המים החמים הצף בין כל שימוש למיקרוגל לפי הצורך.
- תמונה באמצעות מיקרוסקופ כאשר הצמח מתקשה. שמרו על העובר הטעון הפוך לשימוש במיקרוסקופ הפוך. להעיף את הכיסויים מעל (כך agarose היא תחת coverslip) לשימוש על מיקרוסקופים ישרים.
9. הרכבה על שקופיות מגושרים
- כדי להפוך שקופיות גישור, הדבק כיסוי מרובע לשקופית זכוכית באמצעות נקודה קטנה של דבק-על.
הערה: צריך להיות שוקת לפחות 5 מ"מ רוחב בין הכיסויים. שני #1 coverslips גבוהה בדרך כלל מתאים 24-48 hpf עוברים בעוד שלושה שמיכות גבוהה יכול להיות הכרחי עבור 72 hpf. - העבר 1-2 להעביר עוברים לשקופית הגישור עם פיפטה פלסטיק או 200 μL מיקרופיפטה עם קצה חתוך (כדי להפחית את לחץ ההטיה).
- הפתיל נוזל עודף עם מגבונים קים או נייר מגבת.
- הוסף טיפה של ≥ 80% גליצרול ישירות לעובר.
- מכסים עם זכוכית עטיפה מלבנית. ה-droplet של גליצרול צריך לגעת בזכוכית המכסה.
- להוסיף גליצרול יותר לחלל בין זכוכית המכסה להחליק לפי הצורך כדי לכסות לחלוטין את העובר עם שוליים של גליצרול בצידי העובר.
- החלק את זכוכית העטיפה המלבנית בעדינות כדי לגלגל את העובר למצב הדמיה.
10. מכתים כתמים
הערה: סעיף זה מתחיל לאחר שלב 4.2 לעיל ומחליף את שאר שלב 4.
- מודאת העוברים בפתרון חסימה עם נוגדן משני peroxidase מעלה עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c בעת נדנדה.
- שטוף שלוש פעמים בPBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- להעביר את העוברים לצלחת תרבות או דיכאון שקופית עם פיפטה העברה.
- מערבבים 50 μL של 1% בקלות (3, 3 '-diaminobenzidine) מומס2O ו 50 μl של 0.3% חמצן מימן ולהביא 1 מ ל עם PBS.
התראה: הנגיעה היא חומר מסוכן. לבשו כפפות והיפטרו מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים. - לכסות את העוברים HRP עם הפתרון מוכן לעיל ולפקח על פיתוח צבע (בדרך כלל 1-5 דקות) תחת מיקרוסקופ.
- לאחר שהגיע לרמה הרצויה של פיתוח צבע, לשטוף את העוברים לזמן קצר ב-PBS.
- להעביר את העוברים חזרה לצינור 1.5 mL לפני קיבעון.
- לתקן מחדש את העוברים עבור 15-20 דקות ב 4% בכיוון הכיור בטמפרטורת החדר.
- רחץ את העוברים שלוש פעמים ב PBTriton עבור 5 דקות.
- . המשך לתיעוד
11. פרוטוקול משתנה עבור כתמים רקמה מנות שנטענה בשקופיות
- להקיף רקמות להיות מוכתם בעט פאפ.
- העבר את השקופיות לתא לח.
- . הוסף 1 מ ל של Pbs ישירות לשקופית
- דגירה 7 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר הטבעה בינונית.
- שופכים את PBS על ידי היפוך שקופית.
- מימה 1 דקות עד 1 מ ל של מאגר TNT (100 mM Tris pH 8.0, 150 מ"מ הנאל, 0.1% Tween20).
- חסום עד 1 מ ל של פתרון חסימה (מסחרי או 10% סרום + 2% BSA) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- דגירה לילה בנוגדן העיקרי מדולל 1% סרום או חסימת פתרון ב 4 ° c.
- כביסה חמש פעמים עד 1 מ ל של מאגר TNT בטמפרטורת החדר.
- דגירה של נוגדן משני עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c. כסו את החדר בנייר כסף או השתמשו במכסה כהה.
- רוחצים 5 פעמים ב-TNT בטמפרטורת החדר. יוצקים את הכביסה האחרונה.
- הר עם 2-3 טיפות של הרכבה בינונית ו coverslip. בואו לשבת 5-10 דקות.
- לאטום את זכוכית העטיפה על השקופית באמצעות לק ברור מסמר. אפשר להתייבש לגמרי לפני ההדמיה.
12. תעוד ותיעוד
- הקלט את הפרוצדורה המלאה ואת כל הסטיות במחברת מעבדה.
- הקלט את הריכוז, שם, מספר קטלוג, יצרן, ומספר רב של הנוגדן העיקרי.
- מניחים מדגם שנטען כראוי על במת המיקרוסקופ. אתר את אזור הריבית.
- בחר בדוגמה בהירה יחסית. הגדר חשיפה למצלמה והרווח כך שהאות יהיה בהיר מספיק ללא הפחתה.
- השוואת עוצמת הצביעה של אותו אזור מעניין באמצעות אותן הגדרות חשיפה בעת השוואת בין עוברים ונוגדנים ניסיוניים המסומנים באמצעות נוגדן (ex. IgG) עוברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כל הר אימונוהיסטוכימיה משתמש בנוגדנים כדי לזהות את התבנית המרחבית של ביטוי החלבון בבעל החיים שלמים. זרימת העבודה הבסיסית של אימונוהיסטוכימיה (מתוארת באיור 1) כרוכה הרבייה דגים, העלאת והכנת העוברים, חסימת אנטיגנים שאינם ספציפיים, באמצעות נוגדנים העיקרי אנטיגן מסוים כדי למקד את החלבון של עניין, מזהה את הנוגדן העיקרי עם נוגדן משני מתויג, הרכבה הדגימה, ותיעוד הביטוי.
כל הר אימונוהיסטוכימיה הוא כלי רב ערך לחקר ביטוי חלבון מרחבי וזמני במהלך התפתחות הדגים דג זברה. Zebrafish מוצג התכווצויות ספונטנית מתווכת על ידי צמתים הפער החל לפני 19 hpf-לפני תא החלל המנוע מגע19. הצומת העצבי של הדג, כמו בעלי חוליות אחרים, מתווך על ידי משחק אצטילכולין בקולטני אצטילכולין ניקטינית. קולטנים אלה שנאספו זוהו לראשונה על כ 16 hpf וביטוי מתרחב ומremodels כמו נוירונים טופס אנשי קשר20. מחקרים בצפרדעים21 וחולדות22 מראים כי שריר השלד של בעלי חוליות יכול גם לבטא קולטני מגלוטמט ionotropic. כל הר אימונוהיסטוכימיה עבור GluN1 יחידת המשנה של NMDA-type הקולטן גלוטמט מגלה ביטוי של משנה לקולטן גלוטמט לאורך כל פיתוח שריר דג זברה ב 23 hpf (איור 2). הדבר מתאים בקירוב לעיתוי של מנוע העצב. הביטוי הושווה לא עוברים בקרה הראשי כדי לקבוע את הזריחה הרקע של הדג ואת הנוגדן המשני ו 2 μg/mL עכבר להגדיר כדי לקבוע את התרומות היחסיות של איגוד אנטיגן לא ספציפי. קולטני גלוטמט סוג של אמפא לא זוהו בשרירים בשלב זה של פיתוח. ריכוזי נוגדנים מפורטים בטבלה 1. כדי ליצור תמונות אלה, עוברים אלה עובדו כמתואר בפרוטוקול זה עם אף אחד מהשלבים האופציונליים פרט לדיוקינג. העוברים היו שטוחים ומורכבים (איור 3ב).
חלוקת תאים לבטא שינויים היסטון שונים מתאים השקט שניתן לזהות על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים המכירים שינויים ספציפיים, כגון זרחון חלבון. זירחון של האבן 3 בסרין 10 קשור לחלוקת התא23. השינויים שהוצגו פרוטוקול זה עבור הסתגלות של אימונוהיסטוכימיה לרקמות מנות כי הוא רכוב על השקופיות שימש כדי לזהות תאים מתרבים במוח הזחל דג זברה. חלקים קפואים של 72 hpf עוברים הותקן על שקופיות ומוכתם חיסוני עבור p-H3 (איור 4). כמה תאים express p-H3, והביטוי הוא הבולט ביותר באזורים החדרית. הביטוי הושווה ללא עוברי שליטה ראשוניים ולעכבר 2 μg/mL כדי לקבוע את התרומות היחסיות של איגוד אנטיגן שאינו ספציפי.
| נוגדן | יעד | ריכוז |
| בקרת האיגית איזוטיפ של העכבר | אנטיגנים לא ספציפיים | 2 μg/mL |
| עכבר נגד NMDAR1 | GluN1 יחידת משנה | 1:1000 |
| עז נגד עכבר Alexa488 | עכבר הigg | 1:500 |
| עכבר נגד פואהו-H3 | H3 היסטון זרחאני | 1:500 |
| קולטן עכבר נגד פאן-אמפא | GluR1-4 | 1:500 |
שולחן 1: רשימת נוגדנים וריכוזים בשימוש.
איור 1: תרשים זרימה של הליך כימי של הר אימונוהיסטוכימיה. זרימת העבודה הבסיסית של ההליך היא להתרבות דגים; לאסוף ולהכין עוברים; לחסום אנטיגנים שאינם ספציפיים; דגירה של נוגדנים ראשי ומשני בסדרה; לטעון רקמות; ומסמך. שלבים אופציונליים מסומנים בחצים קטנים בנקודה המתאימה בזרימת העבודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הזחלים תרשימים ו NMDA לקולטן התוצאות הנציג IHC. השימוש של הר מלאה אימונוהיסטוכימיה נבדק ביטוי קולטן גלוטמט שריר מתפתח. התמצאות ואזור הריבית ב -23 hpf מצוין. לא היתה כל אות לגילוי כאשר הנוגדנים הראשוניים לא נכללו. העכבר IgG שליטה נוגדן מראה את הרמה הנמוכה של ביטוי לא ספציפי. GluN1 יחידת משנה של קולטן גלוטמט סוג NMDA (NMDAR) מתבטא על פני השריר המתפתח, עם ריכוזים גבוהים יותר בגבולות somite (ראשי חץ). בשלב זה לא מבוטא קולטני גלוטמט סוג (AMPAR). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סכמטית של ערכות הרכבה. (א) עובר שקוע ב 50% גליצרול יכול להיות ממקם בקלות. (ב) העובר שטוח הרכוב על שקופית במדיום הרכבה ניתן לשמור ולעבור בתמונה במועד מאוחר יותר. (ג) עובר הרכוב ב-droplet של 1% העלה יכול להיות קבוע בעמדה כדי לראות אזור קשה. (ד) עובר שרכוב בגליצרול על שקופית מגשרת יכול להיות מגולגל וממקם מיקומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התוצאות הייצוגיות של IHC ברקמה שלמה. שימוש בשינויים פרוטוקול בשלבים האופציונליים, אימונוהיסטוכימיה נבדק עבור תאים מתרבים במוח זחל הדגים בשנת 72 hpf. העכבר הigg נוגדן שליטה למעט נוגדנים הראשי לחשוף רמה נמוכה של ביטוי לא ספציפי. כסמן של תאים מתרבים, p-H3 מתבטא במיקומים בדידים, כולל אזורי המוח (ראש חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אימונוהיסטוכימיה הוא כלי רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את הביטוי הזמני-מיותר של חלבון כמעט כל עניין של אורגניזם. אימונוהיסטוכימיה משמש על מגוון רחב של רקמות ואורגניזמים מודל. פרוטוקול זה הותאם במיוחד לשימוש ב-zebrafish. אימונוהיסטוכימיה במינים שונים עשויים לדרוש קיבוע שונים וטכניקות טיפול, חסימת פתרונות בהתאם מינים ונוכחות של peroxidases אנדוגניים, וזמני דגירה בשל עובי והרכב של רקמות. Ihc ב-דג זברה כבר אינטגרלי לקידום ההבנה שלנו של סרטן24, מחלה מטבולית25, הפרעות נוירולוגיות26, ותחומים רבים אחרים של רלוונטיות רבה לבריאות האדם. אחד היתרונות העיקריים ל-IHC הוא שהתהליך קצר יחסית בהשוואה לטכניקות אחרות כגון ISH והוא לא תובעני מבחינה טכנית. עם זאת, ישנם שלבים רבים הדורשים אופטימיזציה המבוססת על גיל הדגימות, האנטיגן ממוקד, ואת הנוגדנים בשימוש.
המשך של מספר שלבים בפרוטוקול זה הוא גמיש. משכים שניתנו עבור שלבים גמישים כמצוין מייצגים את הזמנים המינימליים הנדרשים בדרך כלל. באופן כללי, בכל פעם שעוברים כביסה שלוש פעמים או יותר ב-PBTriton, ניתן לשמור אותם בלילה ב -4 ° c בכביסה האחרונה אם יש צורך בכך. החדירות וזמני הקיבוע גמישים פחות, ויש להתאימו רק עם כוונה מכוונת כחלק מאסטרטגיית פתרון בעיות. ציינו מספר נקודות בפרוטוקול שאינן אופציונליות כדי להראות כיצד ניתן לשלב שלבים אלה בזרימת העבודה כפי שהוא רלוונטי. לדוגמה, אם הפיגמנטציה מפריעה לזיהוי אותות, מנע מלאנוגסיס על ידי טיפול PTU או עוברים קבועים לאקונומיקה. הלבנת יכולה לפגוע ברקמות, כל כך אכפת לקחת כדי למזער את העוברים זמן לבלות באקונומיקה. עם זאת, הלבנת עשויה להיות עדיפה טיפול ptu, אשר יכול להשפיע על היבטים מסוימים של פיתוח27,28,29,30. אנו מציגים גם אפשרויות לזיהוי פלורסנט וכרומוגניים. אם הקרינה הפלואורסצנטית לא רצוי או אם האנטיגן מייצרת אות כי הוא חלש מדי כדי להיות מזוהה כראוי על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית, זיהוי כרומוגניים ניתן להשיג באמצעות peroxidase חזרת (HRP)-מצומת נוגדן ו לשאת.
האתגר הגדול ביותר של ihc ב-דג זברה הוא למצוא נוגדנים מתאימים. אכן, ISH משמש לעתים קרובות כפרוקסי עבור ביטוי חלבון כאשר נוגדנים מסחריים אינם זמינים לחלבון הרצוי של הריבית. נוגדנים מסחריים רבים מיועדים למקד את יעדי היונקים והאפיסקופים לא נשמרים תמיד ב-zebrafish. כאשר הם זמינים, בחר נוגדנים מסחרית זמין שנבדקו ב-zebrafish. מצאנו כי נוגדנים המכירים אנטיגנים כי הם > 80% שימור בין דג זברה ואת מינים היעד בדרך כלל עובד ב-דג זברה. גילינו גם כי נוגדנים הפגינו לעבוד גם בציפורים ו/או דו-חיים בנוסף ליונקים בדרך כלל גם לעבוד ב-דג זברה, גם כאשר היעילות ב-דג זברה לא נבדקו. בדרך כלל, נוגדנים רב שבטיים שפותחו נגד אנטיגן היונקים נוטים יותר לזהות את הומוכפיש ההומואיים מאשר נוגדנים חד שבטיים עקב הפרטים הנמוכים שלהם. בכל פעם שאתה בוחן נוגדן חדש, מועיל להריץ ניסוי בשליטה חיובית באמצעות פפטיד מטרה מקושרת, רקמה או תאים הידועים לבטא את החלבון, או תאים המבטאים את מבנה העיתונאי. ניתן גם לבדוק נוגדנים על ידי הכתם המערבי כדי לוודא את הגודל של אנטיגן היעד.
בעוד שרוב הנוגדנים המסחריים מספקים את טווח הדילול המוצע עבור IHC, חשוב לקבוע את הדילול המתאים ביותר. ריכוזי הנוגדן כי הם גבוהים מדי לעתים קרובות תוצאה של כתמים שאינם ספציפיים ומוגברת רקע, בעוד נוגדנים מעט מדי לא מצליח לספק אות ניכר. בהתאם לנוגדן ואת האנטיגן, זה עשוי להיות יתרון לחדירות הראשון העוברים כמתואר בשלב 3.2 לעיל, אולם, שלב זה לא יהיה צורך ובמקרים מסוימים יכול לגרום לאות מופחתת. פרוטוקול זה משתמש טריטון-X-100 כחומר ניקוי החדיר תאים, אשר עשוי להספיק לרקמה דקה או ביטוי שטחי. רקמות עמוקות או עבות, כגון אזורי מוח עמוקים או זחלים מבוגרים יותר, עשויים לדרוש חדירות מסוימות. לעומת זאת, טריטון-X-100 צריך להיות מנשלל מכל השלבים כאשר חיסוני מכתים רק חלבונים במשטח התא רצוי מעל תיוג חלבונים תאיים. משך שלב החסימה, כמו גם הבחירה של פתרון חסימה מסחרית לעומת השימוש בסרום BSA יכול להיות גם מותאם לתיקון רגישות נוגדנים וכתמים ברקע. ריכוזים גבוהים של סרום המשמש חסימה (10% בפרוטוקול זה) יכול להפחית את כתמים ברקע, אם כי צריך להיות מדולל כאשר הנוגדן נוכח כדי למזער את המסיכה מיסוך נוגדנים אתרים. פתרונות חסימה מבוססי צמחים עשוי להועיל אם אות הרקע הוא גבוה באופן עקבי, אפילו מדלל נוגדנים נמוכה (< 1:1000). לבסוף, רגישות יכולה להיות מכווננת בסדר על ידי השטף של שוטף. ייתכן שיהיה צורך להגדיל או להקטין את משך הצעדים של שטיפת הנוגדן לאחר מכן כמו גם להתאים את כמות טריטון-X-100 ב PBTriton. טווחי עבודה טיפוסיים של PBTriton span 0.2% עד 1.0% טריטון-X-100. זה אימון טוב בעת שימוש בנוגדן חדש כדי להכתים עוברי שליטה שליליים עם IgG הראשי ומתויג נוגדנים משניים כדי לקבוע את הנוגדנים ספציפיות ולזהות אותות חיוביים שווא הפוטנציאל.
אם מיטוב הנוגדן נכשל כדי לייצר אות חיובי, זה יכול להיות בגלל המסיכה קבע את האנטיגן. באופן כללי, קיבוע ב 4% בכיוון ההוא לא מסכה לאתרי אנטיגן כדי למנוע כריכת נוגדנים, למרות המסיכה אנטיגן מתרחשים מדי פעם עם כמה נוגדנים. אחזור אנטיגן יכול לגרום נזק העובר אבל פרוטוקול עובד כבר תיאר על ידי Inoue ו Wittbrodt31. לחילופין, אם הנוגדן שנבחר אינו תואם ל-4% בכיוון הקרח או אם תוצאות הבחירה במתנול מורפולוגיה סלולרית, ניתן להשתמש ב-2% חומצה אצטית טריכלור או בגלוקסראל כדי לתקן את הדגימות27. תאימות של נוגדן עם קיבוע פורמלדהיד חייב להיקבע באמצעות התאמה מדעית. אם לא ניתן להשיג אות שליטה חיובית בעקבות קיבוע האלבה, ייתכן ששווה לנסות תיקונים חלופיים כגון מתנול. פרוטוקולי קיבעון חלופיים עשויים להיות נחוצים גם עבור נוגדנים ראשוניים שהועלו נגד אנטיגנים מצויירים (כגון נגבה-BSA).
ישנן מספר אפשרויות אפקטיביות עבור הרכבה מוכתם חיסוני דג זברה עבור הדמיה. העוברים יכולים להיות מועברים לצלחת פטרי של גליצרול, הממוקמות בסיכות או במילקחיים, ומובחנות בתצוגה רחבת שדה מלמעלה או ממתחת לתמונה דרך הצלחת עם מיקרוסקופ הפוך (איור 3א). שיטה זו פשוטה, מהירה וזמנית. החסרונות כוללים את הנטייה של העוברים להתגלגל מתוך מיקוד הגליצרול הנוזלי, השתקפויות פוטנציאליות מהמשטח של הגליצרול בצלחת, והקושי של הדמיה דרך המנה העבה. עוברים ניתן לרכוב שטוח על הצדדים זכוכית (איור 3ב) עם הרכבה בינונית, כיסוי, ו לק ציפורניים. טעינות אלה ניתן לראות על מיקרוסקופ זקוף או הפוך. העוברים המוכנים בדרך זו יכולים להיות מוכנים לפני הזמן והשקופיות המאוחסנות ב-4 ° צ' עד להדמיה או לאחסון מחדש במועד מאוחר יותר. זה יכול להיות יתרון במיוחד כאשר זמן הדמיה מוגבלת. החסרונות של הר זה כוללים את האפשרויות המוגבלות לתנוחת העובר ועובי הרקמה, ואת חוסר היכולת למקם מחדש או לשחזר עוברים. עוברים רכוב בדרך זו לעתים קרובות צריך de, כמו גרגרי חלמון הם פלורסנט אוטומטית בשימוש נפוץ ביותר ערוצי הזריחה, לא ניתן להעביר או להסיר לאחר הרכבה. כאשר אזור העניין דורש מיקום קשה של העובר, זה יכול להיות היתרון ביותר כדי לטעון את העוברים ב 1% העלה על זכוכית כיסוי (איור 3ג). העובר יכול להיות מוחזק בתנוחה עם סיכות חרקים עם אזור הריבית הקרובה ביותר לזכוכית המכסה עד הצמח מתקרר. הצמח יחזיק את העובר במקומו ללא העובר מתגלגל לפחות מספר דקות. הרכבה agarose היא הטובה ביותר עבור מיקרוסקופים הפוכה, למרות זכוכית כיסוי יכול להיות הפוך בקפידה לשימוש על מיקרוסקופ זקוף. הר זה יכול להיות זמן רב ועוברים הם בדרך כלל לא repositionable או ההשבה. עוברים הרכבה על שקופיות גישור (איור 3ד) מספק פשרה מסוימת בין שיטות אלה. הר מגשר הוא מהיר, העוברים יכולים להיות ממוקם ממקם והתאושש. גובה הגשר יכול לאפשר גמישות רבה יותר בעובי הרקמה ובתנוחת העובר מאשר בטעינות שטוחות, תוך שמירה על היכולת לצלם מלמעלה או מלמטה. שיטה זו מחייבת הכנת שקופיות גישור לפני הזמן. עובי הרקמה להיות רכוב מכתיב כמה שמיכות גבוה הגשר צריך להיות. שקופיות גישור ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים במשך יום אחד, אבל צריך להיות מסולק לאחר הפעלת ההדמיה כי הגליצרול קשה לנקות את השקופיות והוא באיטיות להוציא את הדבק מחזיק את הגשר.
IHC היא שיטה אפקטיבית לקביעת התזמון והתבנית של ביטוי החלבון באורגניזם או ברקמה. IHC יש מספר יתרונות מעל ISH כי הוא עלות נמוכה יחסית וניתן להשלימה בחלק מהזמן בדרך כלל הכרחי עבור ISH (2-3 ימים לעומת 5-8 ימים). בנוסף, IHC הוא מחוון טוב יותר של ביטוי המוצר הגנטי כזיהוי של רמות mRNA לא לנבא את התהליכים הפוסט-מגנטיים ואת הפוסט שיכול להשפיע על הביטוי חלבון. IHC מסוגלת גם לספק נתוני לוקליזציה משניים (למרות שהדבר אינו נכון בעת שימוש בצביעת הפרוסות), שאינה מאפשרת על ידי ISH. ניתן לבצע ISH כפול/IHC ב-zebrafish.
IHC יש גם כמה החסרונות, בעיקר בקרב אותם להיות זמינות נוגדן. בעוד ישנם נוגדנים רבים זמינים כי הם באיכות מתאימה ל-ihc, מציאת נוגדנים שעובדים באופן ספציפי ב-דג זברה הוא מאתגר יותר ולעתים קרובות דורש בדיקה ופתרון בעיות נוגדנים שנוצרו נגד אנטיגנים של יונקים. עם זאת, ישנם מספר גדל והולך של נוגדנים מאומת דג זברה בשוק והופעתה של הטכנולוגיה crispr/Cas9 הפכה את זה אפשרי כדי אפיפי תג חלבונים אנדוגניים דרך הנדסת הגנום. תהליכים אלה הם זמן רב ומאתגרת, עם זאת, ודורשים אימות של תפקוד החלבון.
הפרוטוקול המתואר בדו ח זה ניתן להשתמש באופן כללי על עוברי וזחלים דג זברה בכל שלב והוא יכול להיות מיושם על רקמות של חיות מבוגרים גם כן. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר גם להכתים דגימות קפואות או פרפין עם שינוי קטן. כל הר אימונוהיסטוכימיה שימש כדי לבחון אוכלוסיות קולטן הנוירוטרנסמיטר בשריר, חשיפת הביטוי של קולטן NMDA ביונוספטרופי בעלת החובה יחידת 1 בפיתוח שריר דג זברה. זה מכתים למדי נרחב ומפוזר על פני השריר המתפתח הוא עקבי עם הביטוי ההתפתחותי של אותו משנה קולטן בפיתוח הזחלים Xenopus21. הדבר מצביע על כך שהביטוי של קולטני גלוטמט שרירים בפיתוח הוא שימור אבולוציונית. בסך הכל, פרוטוקול זה הוא בעל ערך להשגת הבנה טובה יותר של ביטוי הגנים באמצעות IHC והוא מספק כלי רב עוצמה לקביעת התפלגות הרקתית הטמפורלית של ביטוי חלבון ב-zebrafish.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מידע לחשוף.
Acknowledgments
מימון מ-NIH גרנט 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
References
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
