Summary
Här presenterar vi ett protokoll för fluorescerande antikroppsmedierad detektion av proteiner i hela preparat av zebrafiskembryon och larver.
Abstract
Immunohistokemi är en allmänt använd teknik för att utforska proteinuttryck och lokalisering under både normala utvecklings- och sjukdomstillstånd. Även om många immunohistokemi protokoll har optimerats för däggdjur vävnad och vävnad sektioner, dessa protokoll kräver ofta modifiering och optimering för icke-däggdjur modell organismer. Zebrafiskar används i allt högre grad som ett modellsystem inom grundläggande, biomedicinsk och translationell forskning för att undersöka de molekylära, genetiska och cellbiologiska mekanismerna i utvecklingsprocesser. Zebrafisk erbjuder många fördelar som modellsystem men kräver också modifierade tekniker för optimal proteindetektering. Här tillhandahåller vi vårt protokoll för helmount fluorescensimmunohistokemi i zebrafiskembryon och larver. Detta protokoll beskriver dessutom flera olika monteringsstrategier som kan användas och en översikt över de fördelar och nackdelar som varje strategi ger. Vi beskriver också ändringar av detta protokoll för att möjliggöra detektion av kromogena substrat i hela montera vävnad och fluorescens detektion i sektionerad larvvävnad. Detta protokoll är i stort sett tillämpligt på studier av många utvecklingsstadier och embryonala strukturer.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) har vuxit fram som en kraftfull modell för studier av biologiska processer av flera skäl, inklusive kort generationstid, snabb utveckling och amenability till genetiska tekniker. Som ett resultat, zebrafisk används ofta i hög genomströmning små molekylskärmar för toxikologisk forskning och läkemedelsupptäckt. Zebrafisk är också en attraktiv modell för studier av utvecklingsprocesser med tanke på att en enda hona rutinmässigt kan producera 50-300 ägg åt gången och de optiskt klara embryonutvecklas externt möjliggör effektiv visualisering av utvecklingsprocesser. Tidig forskning förlitade sig dock främst på framåt genetiska skärmar med N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller andra mutagena ämnen på grund av utmaningar i upprättandet av omvänd genetisk teknik. Ungefär två decennier sedan användes morfononer först i zebrafisk för att knockdown riktade gener1. Moroler är små antisense oligonucleotides som hämmar översättning av mål mRNA efter microinjection till ett embryo i ett tidigt utvecklingsstadium. En stor svaghet i morfonos är att de späds ut som cellerna delar och i allmänhet förlorar effektivitet med 72 timmar efter befruktning (HPF). Medan morfonos fortfarande ett kraftfullt verktyg för zebrafisk genstörningar, transkription aktivator-liknande effektor nucleases (TALENs), zink-finger nucleases (ZFNs), och klustrade regelbundet interspaced kort palindromic upprepar (CRISPRs) är mer nyligen används för att direkt rikta zebrafiskgenomet 2,3. Dessa omvända genetiska strategier, i kombination med framåt genetik och hög genomströmning skärmar, har etablerat zebrafisk som en kraftfull modell för att studera genuttryck och funktion.
Förmågan att studera genfunktion kräver i allmänhet en utvärdering av spatio-temporal fördelning av gen- eller genproduktuttryck. De två vanligaste teknikerna för att visualisera sådana uttrycksmönster under tidig utveckling är in situ hybridisering (ISH) och hela montera immunohistokemi (IHC). In situ hybridisering utvecklades först 1969 och bygger på användning av märkta antisense RNA sonder för att upptäcka mRNA uttryck i en organism4. Däremot används märkta antikroppar i immunohistokemi för att visualisera proteinuttryck. Idén att märka proteiner för detektion går tillbaka till 1930-talet5 och det första IHC-experimentet publicerades 1941 när FITC-märkta antikroppar användes för att upptäcka patogena bakterier i infekterade vävnader6. ISH och IHC har utvecklats och förbättrats avsevärt under de följande decennierna och används nu båda rutinmässigt i det molekylära och diagnostiska forskningslaboratoriet7,8,9,10,11. Medan båda teknikerna har fördelar och nackdelar, erbjuder IHC flera fördelar jämfört med ISH. Praktiskt taget är IHC mycket mindre tidskrävande än ISH och är i allmänhet billigare beroende på kostnaden för den primära antikroppen. Dessutom är mRNA uttryck inte alltid ett tillförlitligt mått på proteinuttryck som det har visats hos möss och människor att endast ungefär en tredjedel av protein överflöd variation kan förklaras av mRNA överflöd12. Av denna anledning, IHC är ett viktigt komplement för att bekräfta ISH data, när det är möjligt. Slutligen kan IHC tillhandahålla subcellulära och samlokaliseringsdata som inte kan bestämmas av ISH13,14,15. Här beskriver vi en steg-för-steg-metod för att på ett tillförlitligt sätt upptäcka proteiner genom immunohistokemi i hela berget zebrafiskembryon och larver. Målet med denna teknik är att bestämma den rumsliga och tidsmässiga uttryck för ett protein av intresse för hela embryot. Denna teknik använder antigen-specifika primära antikroppar och fluorescerande taggade sekundära antikroppar. Protokollet är lätt anpassningsbart att använda på glidmonterade vävnadssektioner och för användning med kromogena substrat i stället för fluorescens. Med hjälp av detta protokoll visar vi att utveckla zebrafisk skelettmuskulatur uttrycker jonotropa glutamatreceptorer, förutom acetylkolinreceptorer. NMDA-typ glutamatreceptor underenheter kan upptäckas på längsgående muskel vid 23 hpf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De förfaranden för att arbeta med zebrafisk avel vuxna och embryon som beskrivs i detta protokoll godkändes av institutionella Animal Care and Use committee vid Murray State University.
1. Embryoinsamling och fixering
- Förbered lektankar genom att placera vuxna zebrafiskar blandade kön par eller grupper i tankar med ett nät eller slitsade liner fylld med systemvatten över natten.
- Vid lampor på, ändra lektanken vatten för färskt system vatten för att ta bort avföring. Använd en 14 h/10 h ljus mörk cykel med lampor som tänds klockan 9.
- När ägg läggs, återför de vuxna till hem tankar.
- Samla ägg genom att dra upp dem med hjälp av en överföringsrör eller hälla dem i en mesh sil.
- Överför äggen till Petri rätter fyllda halvvägs med embryomedium (såsom 30% Danieau eller E2 embryomedium med 0,5 mg/L metylenblått), begränsa antalet embryon per maträtt till 50.
- Ta bort ägg som är döda eller misslyckas med att dela.
OBS: Döda embryon kan lätt identifieras när de blir ogenomskinliga och ofta verkar "molnigt". Om metylenblått tillsätts embryomedium, tar de döda embryona ett mörkblått utseende. - Inkubera rätter av ägg vid 28,5 °C tills de når önskat stadium. För detta experiment, höja embryona till 23 hpf.
- Tillval) Överför embryona till 24 hpf till 200 μM 1-fenyl 2-tioea (PTU) i embryomedium för att förhindra melanogenes16,17. Alternativt kan blekmedelembryon efter fixering (se avsnitt 5 ( tillval).
- Byt embryomedium eller PTU medium dagligen.
- Dechorionate unhatched embryon med ultra-fine-tip pincett under ett stereomikroskop. Alternativt, kemiskt dechorionate embryon genom att inkubera i 1 mg/mL Pronas i embryomedium i flera minuter vid rumstemperatur. Ta bort embryona från Pronasoch tvätta tre gånger med embryomedium.
- Dechorionated embryon kommer att hålla sig till plast. Förvara dem i glas eller plast Petri rätter belagda med 1-2% agarose upplöst i embryomedium. Flytta dechorionated embryon med hjälp av brandpolerade Pastör rörledningar för att minimera skador.
- Överför embryona till 1,5 ml centrifugrör med hjälp av en plast- eller brandpolerad röra.
- Ta bort embryomedium med mikropipett. Lämna bara tillräckligt med vätska för att bara täcka embryona efter varje vätskeförändring.
- Förbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x fosfat-buffrad salin (PBS) i en kemisk rökhuva.
VARNING: PFA är ett farligt material. Använd handskar och kassera förorenade vätskor och fasta ämnen i angivna områden. - Fäst embryona i 4% PFA för 1-2 h med mild gungning vid rumstemperatur. Alternativt, fixa embryona 4 h till övernattning vid 4 °C.
- Tvätta tre gånger i 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) i 5 min.
- Använd embryona omedelbart eller förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- För långtidsförvaring, torka embryona i 100% metanol (MeOH) 2 h eller över natten vid -20 °C. Förvara embryona vid -20 °C i MeOH i flera månader.
VARNING: MeOH är ett farligt material. Använd handskar och kassera förorenade vätskor och fasta ämnen i angivna områden.
2. Framställning av embryon
- Rehydrera embryona genom seriella inkuber vid rumstemperatur.
- Inkubera i 75% MeOH/25% 1x PBS för 5 min, gunga.
- Inkubera i 50% MeOH/50% 1x PBS för 5 min, gunga.
- Inkubera i 25% MeOH/75% 1x PBS för 5 min, gunga.
- Inkubera i 100% PBTriton i 5 min, gunga.
- (Valfritt) Förbered en färsk proteinas K-arbetslösning (10 μg/ml i PBTriton) på is genom att tillsätta 10 μL nytinad proteinas K-lager (10 mg/ml).
- Permeabilize embryona genom att smälta upp till 30 min i ProteinasE K.
Obs! Föreslagen tidsinställning är <24 hpf: ingen matsmältning; 24 hpf: 15 min matsmältning; och 7 dagar gammal: 30 min matsmältning. - Skölj permeabiliserade embryon i PBTriton och återfixa i 4% PFA i 20 min vid rumstemperatur.
- Tvätta embryona tre gånger i PBTriton i 5 min vid rumstemperatur med mild gungning.
- Permeabilize embryona genom att smälta upp till 30 min i ProteinasE K.
3. Primär antikroppsinkubation
- Välj en kommersiell blockerande lösning eller serum som matchar de sekundära antikroppsvärdarterna (t.ex. 10 % getserum i PBTriton) med eller utan 2 mg/ml bovint serumalbumin (BSA).
- Blockera embryona i blockeringslösning i 1-3 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 °C medan du gungar.
- Inkubera i primär antikropp utspädd i blockerande lösning eller 1% serum i PBTriton över natten vid 4 °C medan gungning. I detta experiment var de primära antikroppar som användes anti-NMDAR1, anti-pan-AMPA-receptor och antifosfo-Histone H3, var och en utspädd till en slutlig koncentration av 1:500 i 1% getserum i PBTriton.
- Tvätta fem gånger i PBTriton i 10 min vid rumstemperatur medan gunga.
4. Sekundär antikroppsinkubation
- Välj en sekundär antikropp baserat på värdarten i den primära antikroppen och önskad våglängd.
- Inkubera i sekundär antikropp utspädd i blockerande lösning eller 1% serum i 2 timmar i rumstemperatur (eller över natten vid 4 °C) medan gungning.
OBS: Fluorescerande sekundära antikroppar är ljuskänsliga. Vi använde 1:500 get-anti-mus Alexa488 utspädd i 1% get serum i PBTriton. - Täck rören med aluminiumfolie eller lock med en ljusblockerande låda för detta och alla efterföljande steg.
- Tvätta tre gånger i PBTriton i 10 min vid rumstemperatur medan gunga.
- Överför embryona till en 50% glycerollösning i PBS över en säng på 2% agaros i embryomedium och fortsätt till dokumentation eller fortsätt till ytterligare bearbetningsteg nedan.
Valfria steg
5. Blekning
- Bered blekmedelslösning i ett 1,5 ml-rör genom att tillsätta 810,7 μL ddH2O, 89,3 μL på 2 M KOH och 100 μL på 30% H2O2.
- Invertera röret tre gånger för att blanda.
- Pipette 1 ml blekmedellösningsriktning till embryona.
- Öppna embryotrörslocket så att gas kan komma ut. Tryck försiktigt på röret på bänken för att lossa bubblor.
- Övervaka blekningsprocessen (använd vid behov ett mikroskop) och stoppa reaktionen när pigmentet avlägsnas tillräckligt (ca 5 min i 24 hkf eller 10 min i 72 hkf).
- Ta försiktigt bort blekningslösningen med mikropipett och skölj embryon tre gånger i 1 ml PBTriton.
OBS: Embryon är klibbiga i detta steg. - Fortsätt till dokumentation eller ytterligare bearbetningssteg nedan.
6. Embryodissektion och deyolking
- För att ta bort äggulan, överför en liten mängd (~ 200 μL eller tillräckligt för att helt täcka embryot men restriktiv nog att begränsa där det kan flyta) av 1x PBS till en depression bild eller en vanlig glasbild.
- Använd en plastöverföringsrör för att flytta 1 eller fler embryon till PBS-droppen.
- Använd ultrafina pincett och 00 insektsstift för att bryta isär äggulan och mycket försiktigt skrapa äggula granulat från embryots ventrala yta (se även Cheng et al., 2014)18.
- Ta bort äggula granulat och fyll pbs efter behov.
- Upprepa tills embryot är tillräckligt fritt från äggula.
7. Platt montering på diabilder
- Överför deyolked embryon till en laddad glasrutschbana med en plastpipett eller en 1 mL micropipette med en trimmad spets (för att minska skjuvning stress). Orientera efter behov med en 200 μL micropipette spets eller insekt stift.
- Wick bort överskott PBS med en Kim torka eller pappershandduk.
- Tillsätt 2-3 droppar monteringsmedia i bilden och täckslipen.
- Lufttorr i ca 5 till 10 min.
- Försegla täckglaset på bilden med klart nagellack.
OBS: Kanterna på täckglaset måste vara helt täckta med ett tunt, kontinuerligt lager nagellack. - Låt torka ca 10 min före bildbehandling.
8. Montering i Agarose
- Förbered 1 % agaros i embryomedium genom att tillsätta 0,5 g agaros till 50 ml embryomedium i en mikrovågssäker kolv eller bägare med minst 3 x större volym än önskat.
- Värm i en mikrovågsugn, virvlande var 30:e, tills agaros är helt upplöst.
- Gör 1 ml alikvoter i 1,5 ml centrifugrör. Förvara alikvoterna i rumstemperatur.
- Täck rörlock med locklås före uppvärmning.
- Placera agarose rör i en flytande rörhållare i en bägare halvfylld med vatten.
- Mikrovågsugn bägaren med flytande rör i 2-3 min, eller tills agarose är helt smält.
- Överför ett embryo till den brotade bilden med en plastpipett eller en 200 μl mikropipett med en trimmad spets (för att minska skjuvningsstress).
- Placera embryot på ett rektangulärt täckglas med insektsstift och tillsätt cirka 20 μL smält agaros direkt till embryot.
- Orientera snabbt intresseregionen närmast täcksen med 00 insektsstift.
OBS: Detta är en upp och ner montera. - Returnera agarose röret till varmvattenröret flyta mellan varje användning och mikrovågsugn efter behov.
- Bild med hjälp av ett mikroskop när agaros härdar. Förvara det monterade embryot upp och ner för användning på ett inverterat mikroskop. Vänd täcksen över (så agarose är under täckglas) för användning på upprätt mikroskop.
9. Montering på bryggade diabilder
- För att göra bryggade diabilder, limma fyrkantiga täckslips till glasbilden med en liten punkt av superlim.
OBS: Det bör finnas en tråg minst 5 mm bred mellan lockslipsen. Två #1 täckslen hög är vanligtvis lämpligt för 24-48 hpf embryon medan tre coverslips hög kan vara nödvändigt för 72 hpf. - Överför 1-2 deyolked embryon till broddia med en plastpipett eller en 200 μL micropipette med en trimmad spets (för att minska skjuvningsstress).
- Fukta överflödig vätska med en Kim torka eller pappershandduk.
- Tillsätt en droppe ≥80% glycerol direkt till embryot.
- Täck med ett rektangulärt täckglas. Droppen av glycerol bör vidröra täckglaset.
- Tillsätt mer glycerol till utrymmet mellan täckglaset och skjut efter behov för att helt täcka embryot med en marginal av glycerol på sidorna av embryot.
- Skjut det rektangulära täckglaset försiktigt för att rulla embryot på plats för bildbehandling.
10. DAB Färgning
Obs! Detta avsnitt börjar efter steg 4.2 ovan och ersätter resten av steg 4.
- Inkubera embryona i en blockerande lösning med peroxidaskonjugerad sekundär antikropp i 2 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 °C medan gungning.
- Tvätta tre gånger i PBTriton i 10 min vid rumstemperatur.
- Överför embryona till en kulturplatta eller depressionsglidning med en överföringspipett.
- Blanda 50 μL på 1% DAB (3,3'-diaminobensidin) upplöst i ddH2O och 50 μL på 0,3% väteperoxid och ta till 1 ml med PBS.
VARNING: DAB är ett farligt material. Använd handskar och kassera DAB-förorenade vätskor och fasta ämnen i angivna områden. - Täck HRP-färgade embryon med DAB-lösningen som utarbetats ovan och monitor för färgutveckling (vanligtvis 1-5 min) under ett mikroskop.
- Efter att ha nått önskad nivå av färgutveckling, skölj embryona kort i PBS.
- Överför embryona tillbaka till ett 1,5 ml-rör före fixering.
- Åtgärda embryona i 15-20 min i 4 % PFA vid rumstemperatur.
- Tvätta embryona tre gånger i PBTriton i 5 min.
- Fortsätt till dokumentation.
11. Ändrat protokoll för färgning av sektionerad vävnad som är monterad på diabilder
- Omringa vävnad som ska färgas med en pap penna.
- Överför bilderna till en fuktig kammare.
- Lägg till 1 ml PBS direkt i bilden.
- Inkubera 7 min vid rumstemperatur för att ta bort inbäddningsmedium.
- Häll av PBS genom att invertera bilden.
- Rehydrera 1 min i upp till 1 ml TNT buffert (100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
- Blockera i upp till 1 ml blockerande lösning (kommersiellt eller 10% serum + 2% BSA) i 1 tim vid rumstemperatur.
- Inkubera över natten i primär antikropp utspädd i 1% serum eller blockerande lösning vid 4 °C.
- Tvätta fem gånger i upp till 1 ml TNT buffert vid rumstemperatur.
- Inkubera i sekundär antikropp i 2 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 °C. Täck kammaren med folie eller använd ett mörkt lock.
- Tvätta fem gånger i TNT vid rumstemperatur. Häll av sista tvätten.
- Montera med 2-3 droppar monteringsmedium och täckglas. Låt sitta 5-10 min.
- Försegla täckglaset på bilden med klart nagellack. Låt torka helt före bildbehandling.
12. Dokumentation
- Spela in hela proceduren och eventuella avvikelser i en labbanteckningsbok.
- Registrera koncentration, namn, katalognummer, tillverkare och partinummer för den primära antikroppen.
- Placera lämpligt monterat prov på mikroskopstadiet. Leta reda på regionen av intresse.
- Välj ett relativt ljust exempel. Ställ in kamerans exponering och förstärkning så att signalen är tillräckligt ljus utan att mätta.
- Jämför färgningsintensiteten i samma intresseregion med samma exponeringsinställningar när du jämför mellan experimentella antikroppsmärkta embryon och kontrollantikroppsembryon (ex. IgG) embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela montera immunohistokemi använder antikroppar för att upptäcka det rumsliga mönstret av proteinuttryck i det intakta djuret. Det grundläggande arbetsflödet för immunohistokemi (avbildas i figur 1) omfattar avel zebrafisk, höja och förbereda embryon, blockera icke-specifika antigener, med hjälp av en antigen-specifik primär antikropp för att rikta protein av intresse, upptäcka att primära antikroppar med en märkt sekundär antikroppar, montering av exemplaret och dokumentera uttryck.
Hela berget immunohistokemi är ett värdefullt verktyg för studier av rumsliga och tidsmässiga proteinuttryck under zebrafisk utveckling. Zebrafisk uppvisar spontana sammandragningar medierad av gap korsningar börjar på före 19 hpf - innan motor neuron kontakt19. Zebrafisk neuromuskulära korsningen, liksom andra ryggradsdjur, medieras av acetylkolin agerar på nikotinacetylkolin receptorer. Dessa monterade receptorer upptäcks först vid cirka 16 hpf och uttryck expanderar och ommodeller som nervceller form kontakter20. Studier på grodor21 och råttor22 tyder på att skelettmuskeln hos ryggradsdjur också kan uttrycka jonotropa glutamatreceptorer. Hela montera immunohistokemi för GluN1 underenheten i NMDA-typ glutamat receptorn avslöjar uttryck för glutamat receptor underenheter hela utveckla zebrafisk muskel vid 23 hpf(Figur 2). Detta motsvarar ungefär tidpunkten för motor neuron innervation. Uttryck jämfördes med inga primära kontrollembryon för att bestämma fiskens och den sekundära antikroppsformens bakgrundsfluorescens och med en igG-mus med 2 μg/ml mus för att fastställa de relativa bidragen från icke-specifik antigenbindning. AMPA typ glutamatreceptorer upptäcktes inte i musklerna i detta utvecklingsstadium. Antikroppskoncentrationer anges i tabell 1. För att generera dessa bilder, dessa embryon behandlades enligt beskrivningen i detta protokoll med ingen av de valfria stegen utom deyolking. Embryonvar platta monterade och täcks (figur 3B).
Dela celler uttrycka olika histone modifieringar från quiescent celler som kan upptäckas av immunohistokemi med hjälp av antikroppar som känner igen specifika ändringar, såsom proteinfosforimpning. Fosforylering av histone 3 vid serin 10 är associerad med cell division23. De ändringar som presenteras för detta protokoll för anpassning av immunohistokemi till sektionerad vävnad som är monterad på diabilder användes för att upptäcka prolifererande celler i larvzebrafisk hjärnan. Frysta sektioner av 72 hpf-embryon monterades på diabilder och immunostained för p-H3(figur 4). Flera celler uttrycker p-H3, och uttryck är mest anmärkningsvärt vid ventrikulära zoner. Uttrycket jämfördes med inga primära kontrollembryon och med en IgG 2 μg/ml mus IgG för att fastställa de relativa bidragen från icke-specifika antigenbindning.
| Antikropp | Mål | Koncentration |
| Mus IgG Isotyp Kontroll | Icke-specifika antigener | 2 μg/ml |
| Mus anti-NMDAR1 | GluN1 underenhet | 1:1,000 |
| Get anti-mus Alexa488 | Mus IgG | 1:500 |
| Mus Anti-fosfor-H3 | fosforylerade Histone H3 | 1:500 |
| Mus Anti-pan-AMPA-receptor | Glur1-4 (på 4) | 1:500 |
Tabell 1: Förteckning över använda antikroppar och koncentrationer.
Figur 1: Flödesschema för hela mount immunohistochemistry förfarande. Det grundläggande arbetsflödet för förfarandet är att föda upp fisk; samla in och förbereda embryon, blockera icke-specifika antigener; inkubera i primära och sekundära antikroppar i serie; montera vävnad; och dokument. Valfria steg anges med små pilar vid lämplig punkt i arbetsflödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Larver schematiska och NMDA receptor IHC representativa resultat. Användningen av hela montera immunohistokemi testade glutamatreceptoruttryck för att utveckla muskler. Orienteringen och intresseregionen vid 23 hpf anges. Ingen signal kunde upptäckas när primära antikroppar inte ingick. Mus IgG kontroll antibody visar den låga nivån av icke-specifika uttryck. GluN1-underenheten i NMDA-typ glutamatreceptorn (NMDAR) uttrycks över utvecklingsmuskeln, med högre koncentrationer vid somitgränser (pilspetsar). AMPA-typ glutamatreceptorer (AMPAR) uttrycks inte i detta skede. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk för monteringsscheman. (A)Ett embryo som sjunkit i 50 % glycerol kan enkelt flyttas. (B)Ett embryo som är platt monterat på en rutschkana i monteringsmedium kan bevaras och avvisas vid ett senare tillfälle. (C) Ett embryo monterat i en droppe på 1 % agaros kan fastställas för att se en svår region. (D)Ett embryo monterat i glycerol på en bryggad rutschkana kan rullas och flyttas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa resultat av IHC i sektionerad vävnad. Med hjälp av protokollet ändringar i valfria steg, immunohistokemi testas för att föröka celler i zebrafisk larv hjärnan vid 72 hpf. Mus IgG kontroll antikroppar och exklusive primära antikroppar avslöjar en låg nivå av icke-specifika uttryck. Som en markör för prolifererande celler uttrycks p-H3 på diskreta platser, inklusive ventrikulära zoner (pilspets). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunohistokemi är ett mångsidigt verktyg som kan användas för att karakterisera spatio-temporaluttryck av praktiskt taget alla protein av intresse för en organism. Immunohistokemi används på en mängd olika vävnader och modellorganismer. Detta protokoll har optimerats för användning i zebrafisk. Immunohistokemi hos olika arter kan kräva olika fixering och hanteringstekniker, blockera lösningar beroende på arter och förekomsten av endogena peroxidaser och inkubationstider på grund av vävnadernas tjocklek och sammansättning. IHC i zebrafisk har varit integrerad i att främja vår förståelse av cancer24, metabolisk sjukdom25, neurologiska sjukdomar26, och många andra områden av stor betydelse för människors hälsa. En stor fördel för IHC är att förfarandet är relativt kort jämfört med andra tekniker som ISH och är inte tekniskt krävande. Det finns dock många steg som kräver optimering baserat på exemplarens ålder, antigenet är riktat och de antikroppar som används.
Varaktigheten för flera steg i det här protokollet är flexibel. Varaktigheter som ges för flexibla steg som anges representerar minimala tider som i allmänhet krävs. I allmänhet, när embryon tvättas tre eller fler gånger i PBTriton, kan de förvaras över natten vid 4 °C i den sista tvätten om det behövs. Permeabiliserings- och fixeringstiderna är mindre flexibla och bör endast justeras med avsiktlig avsikt som en del av en felsökningsstrategi. Vi noterade flera punkter i protokollet som är valfria för att visa hur dessa steg kan integreras i arbetsflödet som är experimentellt relevant. Till exempel, om pigmentering stör signaldetektering, förhindra melanogens genom PTU behandling eller blekmedel fasta embryon. Blekning kan skada vävnad, så försiktighet måste iakttas för att minimera den tid embryon tillbringar i blekmedel. Blekning kan dock vara att föredra framför Behandling med PTU, vilket kan påverka vissa aspekter av utvecklingen27,28,29,30. Vi presenterar också alternativ för fluorescerande och kromagen detektion. Om fluorescens inte önskas eller om antigenet ger upphov till en signal som är för svag för att på lämpligt sätt detekteras genom fluorescensmikroskopi, kan kromanogdetektering uppnås med hjälp av en pepparrotperoxidas (HRP)-konjugerad antikropp och DAB.
Den största utmaningen med IHC i zebrafisk är att hitta lämpliga antikroppar. I själva verket är ISH används ofta som en proxy för proteinuttryck när kommersiella antikroppar inte är tillgängliga för önskat protein av intresse. Många kommersiella antikroppar är utformade för att rikta däggdjur mål och epitoper är inte alltid bevaras i zebrafisk. Om tillgängligt, välj kommersiellt tillgängliga antikroppar som har testats i zebrafisk. Vi har funnit att antikroppar som känner igen antigener som är >80% bevarade mellan zebrafisk och målarter arbetar i allmänhet i zebrafisk. Vi har också funnit att antikroppar som visas att arbeta hos antingen fåglar och/eller amfibier utöver däggdjur i allmänhet också arbetar i zebrafisk, även när effekten hos zebrafisk inte har testats. Vanligtvis är polyklonala antikroppar som utvecklats mot ett däggdjursantigen mer benägna att upptäcka zebrafiskhomologer än monoklonala antikroppar på grund av deras lägre specificitet. När du testar en ny antikropp, är det fördelaktigt att köra en positiv kontroll experiment med hjälp av en tvärbunden målpeptid, däggdjursvävnad eller celler som är kända för att uttrycka proteinet, eller celler som uttrycker en reporter konstruktion. Antikroppar kan också testas av västra blot för att kontrollera storleken på målantigenet.
Medan de flesta kommersiella antikroppar ger ett föreslaget utspädningsintervall för IHC, är det viktigt att empiriskt bestämma den utspädning som fungerar bäst. Antikroppskoncentrationer som är för höga resulterar ofta i icke-specifik färgning och ökad bakgrund, medan för lite antikroppar inte ger en märkbar signal. Beroende på antikroppen och antigenet kan det vara fördelaktigt att först genomliva embryona enligt beskrivningen i steg 3.2 ovan, men detta steg kanske inte är nödvändigt och i vissa fall kan resultera i minskad signal. Detta protokoll använder Triton-X-100 som ett rengöringsmedel som permeabilizes celler, vilket kan vara tillräckligt för tunn vävnad eller ytliga uttryck. Djup eller tjock vävnad, såsom djupa hjärnregioner eller äldre larver, kan kräva proteinaspermeabilisering. Omvänt bör Triton-X-100 uteslutas från alla steg när immunfärgning endast proteiner vid cellytan önskas över märkning intracellulära proteiner. Varaktigheten av blockeringssteget samt valet av en kommersiell blockerande lösning jämfört med serum och BSA kan också justeras för att korrigera för antikroppskänslighet och bakgrundsfärgning. Höga koncentrationer av serum som används vid blockering (10% i detta protokoll) kan minska bakgrundsfärgning, men bör spädas när antikroppar finns för att minimera maskering antikroppar bindande platser. Växtbaserade blockeringslösningar kan vara till nytta om bakgrundssignalen är genomgående hög, även vid låga antikroppsutspädningar (<1:1 000). Slutligen kan känslighetfinjusteras av snöret av tvättar. Det kan vara nödvändigt att öka eller minska varaktigheten av tvätta stegen efter antikroppar samt justera mängden Triton-X-100 i PBTriton. Typiska arbetsområden av PBTriton spänner över 0.2% till 1.0% Triton-X-100. Det är god praxis när du använder en ny antikropp för att fläcka negativa kontrollembryon med primära IgG och märkta sekundära antikroppar för att bestämma antikroppsspecificitet och identifiera potentiella falska positiva signaler.
Om antikroppsoptimering inte ger en positiv signal kan det bero på att fixeringsmediva maskering av antigenet. Generellt, fixering i 4% PFA inte maskera antigen platser för att förhindra antikroppar bindning, även om antigen maskering ibland förekommer med vissa antikroppar. Antigenhämtning kan leda till skador på embryot, men ett arbetsprotokoll har beskrivits av Inoue och Wittbrodt31. Alternativt, om den valda antikroppen är oförenlig med 4% PFA eller om PFA resulterar i cellulär morfologi förändringar, metanol, 2% triklorikotisk syra, eller glyoaxal kan användas för att fixa proverna27. Kompatibilitet en antikropp med formaldehyd fixering måste bestämmas empiriskt. Om en positiv kontrollsignal inte kan erhållas efter PFA-fixering kan det vara värt att prova ett alternativt fixeringsmedel som metanol. Alternativa fixeringsprotokoll kan också vara nödvändiga för primära antikroppar som togs upp mot konjugerade antigener (t.ex. GABA-BSA).
Det finns flera effektiva alternativ för montering immunostained zebrafisk embryon för avbildning. Embryon kan överföras till en petriskål med glycerol, placerad med stift eller pincett, och avbildas antingen med bredfältsvy ovanifrån eller underifrån bildbehandling genom skålen med ett inverterat mikroskop(figur 3A). Denna metod är enkel, snabb och tillfällig. Nackdelar inkluderar benägenheten för embryon att rulla ut fokus i vätskan glycerol, potentiella reflektioner från ytan av glycerol i skålen, och svårigheten att imaging genom den tjocka skålen. Embryon kan monteras platt på glassidor (figur 3B) med monteringsmedium, täckglas och nagellack. Dessa fästen kan ses på ett upprätt eller inverterat mikroskop. Embryon som beretts på detta sätt kan förberedas i förväg och de diabilder som förvaras vid 4 °C tills de avbildningar eller kan lagras och omformas senare. Detta kan vara särskilt fördelaktigt när bildtiden är begränsad. Nackdelarna med detta fäste inkluderar de begränsade alternativen för embryoposition och vävnadstjocklek och oförmågan att flytta eller återställa embryon. Embryon monterade på detta sätt behöver ofta deyolking, eftersom äggula granulat är autofluorescerande i de vanligaste fluorescens kanaler och kan inte flyttas eller tas bort efter montering. När den region av intresse kräver svår placering av embryot, kan det vara mest fördelaktigt att montera embryona i 1% agarose på ett täckglas(figur 3C). Embryot kan hållas på plats med insektsstift med den region av intresse som ligger närmast täckglaset tills agarose kyls. Agaros kommer att hålla embryot på plats utan att embryot rullar i minst flera minuter. Agarose montering är bäst för inverterade mikroskop, även om täckglaset kan inverteras noggrant för användning på upprätt mikroskop. Detta fäste kan vara tidskrävande och embryon är i allmänhet inte ompositionerbara eller återvinningsbara. Montering av embryon på bryggade rutschkanor (figur 3D) ger något av en kompromiss mellan dessa metoder. Det broade fästet är snabbt, och embryon kan flyttas och återvinnas. Bron höjd kan ge större flexibilitet i vävnadstjocklek och embryoposition än platta fästen, samtidigt som förmågan att avbilda ovanifrån eller under. Den här metoden kräver att du förbereder de bryggade bilderna i förväg. Tjockleken på den vävnad som ska monteras dikterar hur många täckslar högt bron måste vara. Brotade diabilder kan återanvändas flera gånger under en dag men bör kasseras efter bildframställningsessionen eftersom glycerol är svår att rensa bort diabilderna och det kommer långsamt att rubba limmet som håller bron.
IHC är en effektiv metod för att bestämma tidpunkten och mönstret för proteinuttryck i en organism eller vävnad. IHC har flera fördelar jämfört med ISH i det är relativt låg kostnad och kan slutföras i en bråkdel av den tid som vanligtvis krävs för ISH (2-3 dagar jämfört med 5-8 dagar). Dessutom är IHC en bättre indikator på genproduktuttryck som detektering av mRNA-nivåer inte förutsäga posttranscriptional och posttranslational processer som kan påverka proteinuttryck. IHC kan också tillhandahålla subcellulära lokaliseringsdata (även om detta inte är sant när du använder DAB färgning), som inte ges av ISH. Det är möjligt att utföra en dubbel ISH / IHC i zebrafisk.
IHC har också en del nackdelar, främst bland dem är antikroppstillgänglighet. Även om det finns många antikroppar tillgängliga som är av lämplig kvalitet för IHC, hitta antikroppar som specifikt fungerar i zebrafisk är mer utmanande och ofta kräver testning och felsökning antikroppar som genereras mot däggdjur antigener. Det finns dock ett ökande antal zebrafisk validerade antikroppar på marknaden och framväxten av CRISPR/Cas9-teknik har gjort det möjligt att epitopa taggen endogena proteiner genom genomteknik. Dessa processer är tidskrävande och utmanande, dock, och kräver validering av proteinfunktion.
Protokollet som beskrivs i denna rapport kan i stort sett användas på zebrafiskembryon och larver i alla skeden och kan även tillämpas på vävnader från vuxna djur. Dessutom möjliggör detta protokoll också färgning av frysta eller paraffinsektionerat prover med liten modifiering. Hela montera immunohistokemi användes för att undersöka neurotransmitterreceptorpopulationer i muskel, avslöjar uttryck för jonotropa NMDA glutamat receptor obligatorisk underavdelning 1 i utvecklingen zebrafisk muskel. Denna ganska utbredda och diffusa färgning över utvecklingsmuskeln är förenlig med utvecklingsuttrycket för samma receptorunderavdelning för att utveckla Xenopus larver21. Detta tyder på att uttrycket av glutamatreceptorer i utvecklingen av muskler är evolutionärt bevaras. Sammantaget är detta protokoll värdefullt för att få en bättre förståelse av genuttryck genom användning av IHC och ger ett kraftfullt verktyg för att bestämma spatio-temporal fördelning av proteinuttryck i zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen information att lämna ut.
Acknowledgments
Finansiering från NIH-bidrag 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
References
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
