Summary
Dieses Protokoll ermöglicht eine zeitaufgelöste Beschreibung des bakteriellen Wachstums unter Stressbedingungen auf der Einzelzell- und Zellpopulationsebene.
Abstract
Die Analyse der bakteriellen Fähigkeit, unter Stressbedingungen zu wachsen und zu überleben, ist für eine Vielzahl von mikrobiologischen Studien unerlässlich. Es ist relevant, die Reaktion von Bakterienzellen auf stressinduzierende Behandlungen wie die Exposition gegenüber Antibiotika oder anderen antimikrobiellen Verbindungen, Bestrahlung, nicht-physiologischen pH,, Temperatur oder Salzkonzentration zu charakterisieren. Verschiedene Stressbehandlungen können verschiedene zelluläre Prozesse stören, einschließlich Zellteilung, DNA-Replikation, Proteinsynthese, Membranintegrität oder Zellzyklusregulation. Diese Effekte sind in der Regel mit bestimmten Phänotypen auf der zellulären Skala verbunden. Daher erfordert das Verständnis des Ausmaßes und der Kausalität von stressinduzierten Wachstums- oder Lebensfähigkeitsdefiziten eine sorgfältige Analyse mehrerer Parameter, sowohl auf der Einzelzelle als auch auf der Populationsebene. Die hier vorgestellte experimentelle Strategie kombiniert traditionelle optische Dichteüberwachung und Beschichtungstests mit einzelzelligen Analysetechniken wie Durchflusszytometrie und Echtzeitmikroskopie in lebenden Zellen. Dieses multiskalige Framework ermöglicht eine zeitaufgelöste Beschreibung der Auswirkungen von Stressbedingungen auf das Schicksal einer Bakterienpopulation.
Introduction
Der allgemeine Zweck dieses Protokolls ist es, das Verhalten von Bakterienzellen zu analysieren, die Stressbehandlungen in der Population und auf einzelligen Ebenen ausgesetzt sind. Bakterielles Wachstum und Lebensfähigkeit werden traditionell auf Populationsebene mittels optischer Dichteüberwachung (OD600nm), einem Proxy der bakteriellen Zellmassensynthese, oder durch Beschichtung von Assays zur Bestimmung der Konzentration lebensfähiger Zellen in der Kultur (Koloniebildeinheit pro Milliliter, KBE/ml) behandelt. Unter normalen (unbelasteten) Wachstumsbedingungen sind OD600nm- und KBE/ml-Messungen streng korreliert, da die bakterielle Verdopplungszeit direkt von der Zellmassenzunahme1,2abhängt. Diese Korrelation wird jedoch häufig unter Bedingungen gestört, die die Zellmassensynthese3, Zellteilung4, oder die Zelllyse auslösen. Ein einfaches Beispiel sind Stressbehandlungen, die die Zellteilung hemmen, die zur Bildung fadenförmiger Bakterienzellen5,6führen. Filamente Zellen verlaufen normal, weil die Zellmassensynthese nicht beeinflusst ist, aber sie sind nicht in der Lage, sich in lebensfähige Zellen zu teilen. Die optische Kulturdichte wird folglich im Laufe der Zeit mit einer normalen Rate zunehmen, aber nicht die Konzentration lebensfähiger Zellen, die durch Beschichtungstests (CFU/mL) bestimmt werden. In diesem Fall sind, wie in vielen anderen, optische Dichte- und Beschichtungsmessungen informativ, liefern aber kein umfassendes Verständnis des beobachteten stressinduzierten Effekts. Diese Ensemble-Assays müssen mit einzelligen Analysetechniken kombiniert werden, um eine tiefgehende Charakterisierung von stressinduzierten Wachstumsmängeln zu ermöglichen.
Hier wird ein Verfahren beschrieben, das vier komplementäre experimentelle Ansätze kombiniert: (1) traditionelle Beschichtungstests und grundlegende überwachung der optischen Dichte zur Überwachung der Zelllebensfähigkeit bzw. zellmassensynthese; (2) Durchflusszytometrie zur Bewertung der Zellgröße und der DNA-Gehaltsparameter für eine große Anzahl von Zellen; (3) Mikroskopie-Snapshot-Bildgebung zur Analyse der Zellmorphologie; und (4) Zeitraffer-Einzelbildgebung in mikrofluidischen Kammern zur Untersuchung der zeitlichen Dynamik des Zellschicksals. Dieses multiskalige Framework ermöglicht es, die globalen Auswirkungen auf das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit im Lichte des Verhaltens einzelner Zellen zu interpretieren. Dieses Verfahren kann angewendet werden, um die Reaktion verschiedener Bakterienarten auf praktisch jeden Stress von Interesse zu entschlüsseln, einschließlich Wachstum unter bestimmten Bedingungen (z. B. Wachstumsmedium, pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration) oder Exposition gegenüber Antibiotika oder anderen antimikrobiellen Verbindungen.
Protocol
1. Zellkultur, Stressinduktion und Probenahmeverfahren
HINWEIS: Verwenden Sie sterile Kulturglaswaren, Pipettenspitzen und Wachstumsmedium mit 0,22 m gefiltert, um Hintergrundpartikel zu vermeiden. Hier werden Zellkulturen in einer niedrigen Autofluoreszenz reich definiert es Medium (siehe Tabelle der Materialien)7,8gewachsen.
- Den bakteriellen Belastungsstamm eines gefrorenen Glycerinbestandes auf einer Luria-Broth (LB) Agaroplatte (bei Bedarf mit selektivem Antibiotikum) streichen und über Nacht (17 h) bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Das hier vorgestellte Beispielexperiment verwendet Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry. Dieser Stamm erzeugt die fluoreszierend markierte Untereinheit des HU-Nukleoid-assoziierten Proteins und ermöglicht so die Visualisierung des Chromosoms in lebenden Zellen9. - 5 ml Medium mit einer einzigen Kolonie impfen und bei 37 °C mit Schütteln bei 140 Rotation pro Minute (Rpm) über Nacht (17 h) wachsen. Fläschchen (ca. 50 ml) oder Prüfröhrchen mit großem Durchmesser (ca. 2 cm) müssen verwendet werden, um eine zufriedenstellende Belüftung der Rührkultur zu gewährleisten.
- Am nächsten Morgen messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600nm) und verdünnen Sie die Kultur in ein Reagenzglas mit frischem Medium auf eine OD600nm von 0,01. Das Gesamtvolumen der Kultur muss in Abhängigkeit von der Anzahl der Zeitpunkte angepasst werden, die während des Experiments analysiert werden sollen.
- Laden Sie eine 200-L-Probe der Kultur in eine Mikroplatte (0,2 ml pro Bohrung des Arbeitsvolumens mit einem klaren transparenten Boden) und legen Sie sie in einen automatisierten Plattenleser (siehe Materialtabelle) für die ÜBERWACHUNG von OD600nm während der Inkubation bei 37 °C.
- Inkubieren Sie das geimpfte Reagenzglas bei 37 °C mit Schütteln (140 U/min) auf OD600nm = 0,2, was einer vollständigen Exponentialphase in reichhaltigem Medium entspricht.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Zellen für mindestens 4-5 Generationen zu wachsen, bevor ein angemessenes exponentielles Wachstum erreicht wird. Das in Schritt 1.3 verwendete anfängliche Inokulum (OD600nm = 0,01) muss bei Wachstum in ärmeren Medien (d. h. bei einer Exponentialphase unter OD 0,2) oder bei Bedarf weiterer Generationen (z. B. für spezifische physiologische Studien oder für erweiterte Stressbehandlungen) angepasst werden. - Bei OD600nm = 0,2 die folgenden Kulturproben nehmen, die dem t0-Zeitpunkt entsprechen (exponentiell wachsende Zellen vor der Stressinduktion): (1) Eine 150-L-Probe, die sofort in das mikrofluidische Gerät geladen werden soll, um die Mikroskopie mit Zeitraffermikroskopie zu erhalten (siehe Abschnitt 2); (2) Eine 200-L-Probe für den Verdünnungs- und Beschichtungstest (siehe Abschnitt 3); (3) Eine 250-L-Probe, die für die Analyse der Durchflusszytometrie auf Eis gelegt werden soll (Abschnitt 4); (4) Eine 10-L-Probe, die sofort auf einem agarosemontierten Dia für die Mikroskopie-Snapshot-Bildgebung abgelagert werden soll (siehe Abschnitt 5).
- Setzen Sie die im Reagenzglas verbleibende Zellkultur der spezifischen Stressbehandlung aus, die Sie untersuchen möchten, und bebrüten Sie sie bei 37 °C mit Schütteln (140 U/min).
HINWEIS: Die Kultur, die im automatisierten Plattenleser für die ÜBERWACHUNG von OD600nm wächst, sollte ebenfalls der Stressbehandlung unterzogen werden. - An relevanten Zeitpunkten nach der Stressbehandlung (t1, t2, t3, etc.) nehmen Sie folgende Zellproben aus der Gestresstkultur: (1) Eine 200-L-Probe für den Verdünnungs- und Beschichtungstest (siehe Abschnitt 2); (2) Eine 250-L-Probe, die für die Durchflusszytometrieanalyse auf Eis gelegt werden soll (Abschnitt 3); (4) Eine 10-L-Probe, die sofort auf einem agarosemontierten Dia für die Mikroskopie-Snapshot-Bildgebung abgelagert werden soll (siehe Abschnitt 4).
HINWEIS: Jede stressinduzierende Behandlung hat eine dosis- und zeitabhängige Effizienz. Daher kann es notwendig sein, Vortests durchzuführen, um die Dosis und Dauer der Behandlung zu bestimmen, die für optimale Ergebnisse verwendet werden. Dies kann durch OD-Überwachung mit einem automatisierten Plattenleser (möglicherweise im Zusammenhang mit Beschichtungstests) einer Zellkultur erfolgen, die mit einer Reihe von Dosen und Expositionszeiten behandelt wird. In dem hier vorgestellten Experiment die Zellkultur wurde mit dem zellteilungshemmenden Antibiotikum Cephalexin (Ceph.) in einer Endkonzentration von 5 g/ml für 60 min behandelt. Cephalexin wurde dann durch Pelletieren der Zellen in einem 15 ml-Rohr mittels Zentrifugation (475 g, 5 min) weggespült, das Überstand entfernt, das Zellpellet in gleichem Volumen von frischem Medium durch sanftes Pipettieren wieder ausgesetzt. Die gewaschenen Zellen wurden bei 37 °C mit Schütteln (140 Umdrehungen pro Minute) inkubiert, um eine Erholung zu ermöglichen. Die Probe wurde bei t60 (60 min nach Cephalexin-Zugabe entsprechend der "cephalexin-60min-behandelten" Probe, t120 (60 min nach dem Waschen) und t180 (120 min nach dem Waschen) entnommen.
2. Plating-Test
HINWEIS: Der Beschichtungstest ermöglicht die Messung der Konzentration von Zellen, die in der Lage sind, eine KBE in den Kulturproben zu erzeugen. Dieses Verfahren zeigt die Geschwindigkeit auf, mit der sich eine Zelle in zwei lebensfähige Zellen teilt und ermöglicht es, Zellteilungsverhaftungen zu erkennen (z. B. Erhöhung der bakteriellen Erzeugungszeit der Zelllyse).
- Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen bis zu 10-7 der 200 L Kulturprobe in frischem Medium vor. Platte 100 l der geeigneten Verdünnung auf nicht-selektiven LB-Agaroseplatten, um nach der nächtlichen Inkubation bei 37 °C zwischen 3 und 300 Kolonien zu erhalten.
HINWEIS: Die serielle Verdünnung in frischem Medium muss schnell durchgeführt werden, um die bakteriellen Unterteilungen zu begrenzen. Alternativ könnten Forscher erwägen, eine Kochsalinelösung ohne Kohlenstoffquelle zu verwenden, um Zellteilungen während des Verdünnungsprozesses zu verhindern. - Am nächsten Tag zählen Sie die Anzahl der Kolonien, um die Konzentration lebensfähiger Zellen (KBE/ml) in jeder Kulturprobe zu bestimmen. Plotten Sie die KBE/ml als Funktion der Zeit für unbehandelte und behandelte Zellkulturen.
3. Durchflusszytometrie
HINWEIS: Der folgende Abschnitt beschreibt die Vorbereitung von Zellproben für die Analyse der Durchflusszytometrie. Diese Analysetechnik zeigt die Verteilung der Zellgröße und des DNA-Gehalts für eine große Anzahl von Zellen. Wenn möglich, wird empfohlen, die Durchflusszytometrieproben sofort zu verarbeiten. Alternativ können Proben auf Eis gehalten (bis zu 6 h) und am Ende des Tages gleichzeitig analysiert werden, sobald die Beschichtung und Mikroskopie-Bildgebung durchgeführt wurden.
- Verdünnen Sie die 250 l Kulturprobe, um 250 l bei einer Konzentration von 15.000 Zellen/L (entsprechend einer OD600nm 0,06) in frischem Medium bei 4 °C zu erhalten.
HINWEIS: Die Inkubation auf Eis wird das Wachstum und die morphologische Veränderung der Zellen begrenzen. Alternativ könnte der Benutzer erwägen, die Fixierung der Zellen in 75% Ethanol durchzuführen, wie in der Regel für Diedurchflusszytometrieempfohlen 10. - Mischen Sie die bakterielle Probe zur DNA-Färbung mit einer 10-mm/ml-Lösung des DNA-Fluoreszenzfarbstoffs (Verhältnis 1:1) und inkubieren Sie die Probe 15 min im Dunkeln, bevor Sie die Probe analysieren.
- Übergeben Sie die Probe in das Durchflusszytometer mit einer Durchflussrate von 120.000 Zellen/min. Erfassen Sie vorwärtsgestreutes (FSC) und seitlich esstreudes (SSC) Licht sowie DNA-Fluoreszenzfluoreszenzsignal (FL-1) mit den entsprechenden Einstellungen.
- Plotten Sie die FSC- und FL-1-Zelldichte-Histogramme, um die Verteilung der Zellgröße und des DNA-Gehalts in der Zellpopulation darzustellen.
4. Snapshot-Mikroskopie-Bildgebung
HINWEIS: Der folgende Teil beschreibt die Vorbereitung von Mikroskopiefolien und die Bildaufnahme für die Analyse von Snapshots auf der Grundgesamtheit. Dieses Verfahren liefert Informationen über die Morphologie der Zellen (Zelllänge, Breite, Form) und die intrazelluläre Organisation der Nukleoid-DNA.
- Heizen Sie die thermostatisierte Mikroskopkammer bei 37 °C vor, um die Temperatur zu stabilisieren, bevor Sie mit den Beobachtungen beginnen. Diese Kammer ermöglicht die Temperaturmodulation der Mikroskopoptik und der Probenstufe während Zeitrafferexperimenten.
- Bereiten Sie die in Lesterlin und Dubarry7beschriebenen Gase auf, wie in Lesterlin und Dubarry 7 beschrieben.
- Entfernen Sie die Kunststofffolie von der Unterseite des blauen Rahmens (siehe Materialtabelle),so dass die ausgehöhlte Kunststofffolie auf der anderen Seite bleibt. Kleben Sie den blauen Rahmen auf einem Mikroskop-Glasschlitten.
- Rohrleitung 150 L geschmolzene 1% Agarose-Medium-Lösung und gießen Sie innerhalb des blauen Rahmenfachs. Schnell mit einem sauberen Deckelbedeckung abdecken, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und ein paar Minuten auf die Erstarrung des Agarose-Pads bei Raumtemperatur zu warten.
- Wenn die Zellprobe fertig ist, entfernen Sie den Coverslip und die Kunststofffolie aus dem blauen Rahmen. Gießen Sie 10 L Zellprobe auf das Agarose-Pad und neigen Sie den Glasschlitten sanft, um das Tröpfchen zu verteilen. Wenn die gesamte Flüssigkeit adsorbiert wurde, kleben Sie einen sauberen Deckelschlupf auf den blauen Rahmen, um die Probe zu versiegeln. Das Mikroskopie-Dia ist nun für die Mikroskopie bereit.
- Platzieren Sie das Dia auf der Mikroskopbühne und führen Sie die Bildaufnahme mit Durchlicht (mit Einem Phasenkontrastobjektiv) und mit Lichtquellenanregung bei den entsprechenden Wellenlängen (560 nm für mCherry) durch.
- Wählen Sie Ansichtsfelder aus, die isolierte Zellen enthalten, um die automatisierte Zellerkennung während der Bildanalyse zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass mindestens 300 Zellen abgebildet sind, um eine robuste statistische Analyse der Zellpopulation zu ermöglichen.
5. Mikrofluidische Zeitraffermikroskopie-Bildgebung
ANMERKUNG: Im folgenden Teil wird die Herstellung der mikrofluidischen Platten (siehe Materialtabelle),die Zellbelastung, das Mikrofluidikprogramm und die Zeitrafferbildaufnahme erläutert. Dieses bildgebende Verfahren zeigt das Verhalten einzelner Zellen in Echtzeit.
- Entfernen Sie die Konservierungslösung von der mikrofluidischen Platte und ersetzen Sie sie durch ein frisches Medium, das auf 37 °C vorgewärmt ist, wie im Benutzerhandbuch für mikrofluidische Software beschrieben.
- Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte an das Verteilersystem und klicken Sie auf die Priming-Taste.
- Legen Sie die mikrofluidische Platte mit dem Verteilersystem auf die Mikroskopstufe und heizen Sie sie bei 37 °C für 2 h vor, bevor Sie mit der Mikroskopieerfassung beginnen.
HINWEIS: Dieser Vorwärmschritt ist entscheidend, um die Erweiterung der mikrofluidischen Kammer zu vermeiden, die die Fokussierung des Mikroskops während des Zeitrafferexperiments verändern und die Bildaufnahme beeinträchtigen würde. - Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte. Ersetzen Sie das Medium von gut 8 durch eine Kulturprobe von gut 8 durch 150 l und ersetzen Sie das Medium von gut 1 bis 5 durch das gewünschte Medium durch oder ohne das spannungsinduzierende Reagenz.
- Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte und legen Sie sie auf die Mikroskopbühne.
- Führen Sie auf der mikrofluidischen Software (siehe Tabelle der Materialien) das Zellladeverfahren aus. Prüfen Sie, ob die Belastung der Zellen zufriedenstellend ist, indem Sie im durchlässigen Licht unter das Mikroskop schauen. Führen Sie das Zellladeverfahren ein zweites Mal aus, wenn die Zelldichte in der Kammer nicht ausreicht.
- Führen Sie sorgfältige Fokussierung im Übertragenlichtmodus durch und wählen Sie mehrere Sichtfelder aus, die isolierte Bakterien zeigen. Es ist wichtig, Felder auszuwählen, die nicht überfüllt sind, um das Wachstum isolierter Zellen im Laufe der Zeit überwachen zu können (es wird empfohlen, 10 bis 20 Zellen pro 100 m2 zu überwachen). Dies erleichtert auch die Zellerkennung während der Bildanalyse.
- Klicken Sie auf die mikrofluidische Software auf die Schaltfläche Protokoll erstellen. Programmieren Sie die Injektion von Wachstumsmedium für 1-2-Generation-Zeitäquivalente, damit sich die Zellen anpassen können (optional). Dann programmieren Sie die Injektion des stressinduzierenden Mediums während 10 min bei 2 psi, gefolgt von einer Injektion bei 1 psi für die gewünschte Dauer der Stressbehandlung. Wenn Sie beabsichtigen, die Erholung der Zellen nach Stress zu analysieren, programmieren Sie die Injektion von frischem Wachstumsmedium für die gewünschte Dauer.
HINWEIS: In dem hier vorgestellten Experiment wurde Cephalexin für 10 min bei 2 psi injiziert, gefolgt von 50 min bei 1 psi. Dann wurde frisches Wachstumsmedium bei 2 psi für 10 min injiziert, gefolgt von 3 h bei 1 psi. - Führen Sie Mikroskopie im Zeitraffermodus mit 1 Frame alle 10 min unter Verwendung von Phasenkontrast bei Durchlicht und einer 560 nm Anregungslichtquelle für das mCherry-Signal bei Bedarf durch.
HINWEIS: Es ist wichtig, die mikroskopische Bildaufnahme gleichzeitig mit dem Beginn des mikrofluidischen Injektionsprotokolls zu starten.
6. Bildanalyse
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die wichtigsten Schritte zur Verarbeitung und Analyse von Momentaufnahmen und Zeitraffermikroskopiebildern kurz beschrieben. Das Öffnen und Die Visualisierung von Mikroskopiebildern erfolgt mit dem Open Source ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11. Quantitative Bildanalyse wird mit der Open Source ImageJ/Fiji Software zusammen mit dem kostenlosen MicrobeJ Plugin12 (https://microbej.com) durchgeführt. Dieses Protokoll verwendet die MicrobeJ 5.13I-Version.
- Öffnen Sie die Fidschi-Software und das MicrobeJ-Plugin.
- Für die Snapshot-Analyse legen Sie alle Bilder, die einem Mikroskop-Dia (ein Sample) entsprechen, in die MicrobeJ-Ladeleiste, um Bilder zu verketten und die erhaltene Bildstapeldatei zu speichern. Um Zeitrafferdaten zu erhalten, legen Sie einfach den Bildstapel in die Ladeleiste von MicrobeJ.
- Führen Sie die automatisierte Detektion der Zellumrisse auf der Grundlage der Segmentierung des Phasenkontrastbildes und gegebenenfalls der Nukleoide basierend auf der Segmentierung des gefärbten DNA-Fluoreszenzsignals aus. Überprüfen Sie die Genauigkeit der Zellerkennung visuell und verwenden Sie bei Bedarf das MicrobeJ-Bearbeitungswerkzeug zur Korrektur. Speichern Sie die erhaltene Ergebnisdatei.
HINWEIS: Die Einstellungen für den Nachweis von E. coli-Zellen sind in der Materialtabelle angegeben (siehe Kommentar/Beschreibung s. MicrobeJ). Bei anderen Bakterienarten (insbesondere bei Nicht-Stab-förmigen Bakterien) muss der Benutzer die Einstellungen vor der Detektion verfeinern (siehe MicrobeJ-Tutorial). Bei Zeitrafferbildern könnte es bevorzugt sein, eine halbautomatische Erkennung der Zellen mit dem MicrobeJ-Bearbeitungstool auszuführen, um die Konzentration auf das Schicksal einzelner Zellen zu ermöglichen (siehe MicrobeJ-Tutorial). - Klicken Sie auf das Symbol ResultJ, um die Analyse abzuschließen und das ResultJ-Fenster zu erhalten. Von diesem Punkt aus können viele verschiedene Arten von Ausgabediagrammen generiert werden. Zeichnen Sie die normalisierten Histogramme der Zellform/-länge und der mittleren Nukleoidzahl pro Zelle.
Representative Results
Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um das Verhalten von Escherichia coli K12-Zellen während der transienten Exposition gegenüber Cephalexin zu analysieren, einem Antibiotikum, das speziell die Zellteilung hemmt (Abbildung 1A)13. Der hupA-mCherry E. coli-Stamm, der das fluoreszierend markierte HU-Protein produziert, das mit der chromosomalen DNA assoziiert ist, wurde verwendet, um die Dynamik des Chromosoms während dieser Behandlung zu untersuchen8,9. Die exponentiell wachsenden hupA-mCherry E. coli-Zellen wurden vor (t0) und 60 min nach inkubationsweise mit Cephalexin (t60) analysiert. Dann wurde das Antibiotikum weggewaschen und die Erholung der Zellpopulation nach 1 h (t120) und 2 h (t180) analysiert (Abbildung 1B).
Abbildung 1: Verfahren zur Analyse der bakteriellen Reaktion auf Stressbehandlungen. (A) Schematic der Methode. (B) Cartoon zur Veranschaulichung der Zellmorphologie während des normalen Wachstums in einem reichhaltigen Medium und während der vorübergehenden Exposition gegenüber Cephalexin (Ceph.), von Deraddition bei (t0) und nach der Cephalexinwäsche von (t60) bis (t180). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die parallele Entwicklung von OD und CFU/mL ist ein erster Indikator, der hilft, die Wirkung der Stressbehandlungen zu verstehen. Diese beiden Parameter sind während des ungestörten Wachstums eng korreliert, werden aber oft entkoppelt und entwickeln sich unabhängig unter Stress. Zellkulturen, die in Gegenwart von Cephalexin wachsen, zeigten ähnliche OD600nm-Zunahmen wie die unbelasteten Kulturen (Abbildung 2A), was zeigt, dass das Medikament die Zellmassensynthese nicht beeinflusst. Die Konzentration lebensfähiger Zellen nahm jedoch nicht zu, wenn Cephalexin aufgrund einer strikten Hemmung der Zellteilung vorhanden war (Abbildung 2B). Die Zellen begannen sich wieder zu teilen, als Cephalexin entfernt wurde und erreichten schließlich eine Konzentration, die der unbelasteten Kultur bei (t180) entsprach. Diese Ergebnisse spiegeln die bakteriostatische Wirkung von Cephalexin wider, die eine vollständig reversible Hemmung der Zellteilung induziert. Unterschiedliche Spannungen führen zu einer unterschiedlichen Entkopplung der OD- und CFU/mL-Kurven, abhängig von der induzierten Wirkung (z. B. Modifikation der Zellmorphologie wie Filamentierung oder Wölbung, Zelltod mit oder ohne Lyse). Abbildung 2Centhält eine nicht erschöpfende Liste möglicher Ergebnisse, die auf unterschiedliche stressinduzierte Wirkungen hinweisen.
Abbildung 2: Bakterielle Wachstumsüberwachung von unbehandelten und cephalexin behandelten Zellen auf Populationsebene. (A) Optische Dichteüberwachung (OD600nm/mL). (B) Konzentration lebensfähiger Zellen (KBE/ml) in unbehandelten und cephalexin-60min behandelten Kulturen. Fehlerbalken geben die Standardabweichung für eine experimentelle Dreifache an. (C) Schemata möglicher Ergebnisse und damit verbundener Stresseffekte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Einzelzellanalyse ist wichtig, um die auf Populationsebene beobachtete Stressreaktion genau zu interpretieren. Durchflusszytometrie ermöglicht die Untersuchung der Zellgröße und des DNA-Gehalts mehrerer tausend Zellen14,15 (Abbildung 3). Die Exposition gegenüber Cephalexin provozierte die parallele Zunahme der Zellgröße und des DNA-Gehalts (t60). Als Cephalexin entfernt wurde, verringerten sich die Populationszellgröße und der DNA-Gehalt allmählich und ähnelten der unbelasteten Population bei t180. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cephalexin die DNA-Replikation nicht hemmte und die Bildung von fadenförmigen Zellen provozierte, die mehrere Chromosomenäquivalente enthielten. Diese Filamente in Zellen mit normaler Zellgröße und DNA-Gehalt unterteilt, wenn das Medikament weggewaschen wurde. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie wären sehr unterschiedlich bei Spannungen, die die DNA-Synthese hemmen, was zur Bildung von fadenförmigen Zellen führt, die nur ein nicht replizierendes Chromosom enthalten. In diesem Fall würde die Zellgröße ähnlich zunehmen, wäre aber nicht mit einer Erhöhung des DNA-Gehalts verbunden.
Abbildung 3: Repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse von unbehandelten und cephalexin-60min-behandelten Zellen. (A) Zellgrößenverteilungshistogramme (FSC-H). (B) DNA-Gehalt Histogramme (FL1-SYTO9). n = 120.000 analysierte Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Snapshot-Mikroskopie-Bildgebung wurde verwendet, um die Zellmorphologie und die intrazelluläre Organisation der DNA durch HU-mCherry Lokalisierung gezeigt zu untersuchen (Abbildung 4A). Cephalexin provozierte die Bildung von langen Zellen mit normaler Zellbreite und ohne Teilungssepta. Diese glatten Filamente enthielten regelmäßig verteilte DNA-Strukturen, die als Nukleoide bezeichnet werden, was bestätigt, dass Cephalexin die Chromosomenreplikation und -seigerung nicht beeinflusst. Quantitative Bildanalyse bestätigte weitgehend die Zellgröße und den DNA-Gehalt, die zuvor mit der Durchflusszytometrie beobachtet wurden (Abbildung 4B,C). Die Ergebnisse wären sehr unterschiedlich bei Spannungen, die DNA-Schäden induzieren, die zur Bildung von fadenförmigen Zellen führen, in denen die Replikation weitergeht, aber die Segregation beeinträchtigt wird. In diesem Fall würden Die Zellgröße und der DNA-Gehalt ähnlich zunehmen, aber zellenig würde eine einzige unstrukturierte DNA-Masse beherbergen. Snapshot-Bilder könnten auch andere Arten von abnormen Zellformen oder das Vorhandensein von Mini-, Anukleat- oder Lysed-Zellen (Geisterzellen) offenbaren.
Abbildung 4: Mikroskopische Snapshot-Analyse von unbehandelten und cephalexin-60min-behandelten Zellen. (A) Repräsentative Mikroskopiebilder mit Phasenkontrast (grau) und HU-mCherry-Signal (rot). (B) Zelllängenverteilunghistogramme. Skala Bar = 5 m. (C) Histogramme der Anzahl der Nukleoid pro Zelle. Für jede Probe wurden zwischen 800 und 2.000 Zellen analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die mit dem mikrofluidischen Apparat16 assoziierte Zeitraffermikroskopie half bei der Bestimmung der zuvor beobachteten Phänotypen und liefert zusätzliche Erkenntnisse über die Entwicklung und Kausalität des Wachstumsmangels. Zeitrafferbilder (Abbildung 5A und Film 1) bestätigten, dass Zelldehnung (Zellmassensynthese) und Chromosomenreplikation und Segregation nicht durch die Exposition gegenüber Cephalexin gehemmt wurden. Darüber hinaus zeigte es den Prozess der Erholung, wenn Cephalexin entfernt wurde. Die Analyse der fadenförmigen Zelllinie zeigte, dass die Zellteilung nach dem Abwaschen des Medikaments um 20 min neu beginnt (Abbildung 5B). Die resultierenden geteilten Zellen waren lebensfähig, weil sie sich wiederum teilten, was schließlich zur Bildung von 33 Zellen mit normaler Größe und DNA-Gehalt führte. Dies ermöglichte die Berechnung einer Gesamterzeugungszeit von 31 min über die 180 min des Experiments, was der Erzeugungszeit entspricht, die für die unbelastete Population aus KBE/ml-Messungen berechnet wird (33 min).
Abbildung 5: Mikroskopische Zeitrafferanalyse von cephalexin-60min-behandelten Zellen. (A) Repräsentative Mikroskopiebilder mit Phasenkontrast (grau) und HU-mCherry-Signal (rot). Die überwachte fadenförmige Zelle wird durch den weißen Umriss angezeigt und die Zellen durch verschiedene Farben geteilt. Skala Bar = 5 m. (B) Schematische Darstellung der fadenförmigen Zelllinie entsprechend Panel (A) und Film 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 1: Mikrofluidischer Film von E. coli HU-mCherry, der mit Cephalexin behandelt wird. Cephalexin wurde nach 60 min injiziert, gefolgt von der Injektion von frischem RDM-Medium für 3 h. Zeit in gelb angegeben (1 Rahmen alle 10 min). Skala Bar = 5 'm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen (Rechtsklick zum Download).
Discussion
Es ist wichtig, während des Eingriffs auf den Wachstumszustand der Zellen zu achten. Wachsen Sie die Zellen über mehrere Generationen, bevor Sie eine vollständige exponentielle Phase erreichen. Für den Erfolg dieser Methode ist es wichtig, dass alle Zellproben gleichzeitig gesammelt werden, und es ist am besten, nur eine behandelte und eine unbehandelte Kultur gleichzeitig zu analysieren. Zellproben für die Mikroskopie-Bildgebung müssen während des gesamten Verfahrens auf der Versuchstemperatur aufbewahrt werden. Es ist dann wichtig, die Mikroskopkammer und die mikrofluidische Kammer vor Beginn des Experiments vorzuheizen. Wenn Zellproben für die Durchflusszytometrie nicht leicht analysiert werden können, können sie bis zu 6 h auf Eis gehalten werden. Inkubation auf Eis wird das Wachstum und die morphologische Veränderung der Zellen begrenzen. Alternativ könnte der Benutzer die Verwendung der Fixierung der Zellen in Ethanol 75% in Betracht ziehen, was normalerweise für die Durchflusszytometrie10empfohlen wird. Wenn das Protokoll erfordert, waschen Sie die Spannungsinduktivität von dem Medium, Zentrifuge und Pipettenzellen sehr sorgfältig, um zu vermeiden, dass die potenziellen aberranten Zellen beschädigt werden.
Sowohl die Durchflusszytometrie als auch die Snapshot-Analyse bieten Zugriff auf Zellgrößen- und DNA-Inhaltsparameter, wobei Snapshots zusätzliche Beobachtungen der Zellmorphologie bieten. DNA-Färbung mit DAPI10 (4',6-Diamidino-2-Phenylindole) oder anderen stabilen DNA-Farbstoffen kann durchgeführt werden, wenn keine fluoreszierende Fusion zur Verfügung steht, um die Nukleoide im Betreffenden Organismus zu beobachten. Wenn eine Flusszytometrieanalyse nicht durchgeführt werden kann, ist es wichtig, eine große Anzahl von Zellen per Mikroskopie abzubilden und zu analysieren.
Mikroskopie-Bildgebung kann auch mit Stämmen durchgeführt werden, die fluoreszierende Fusionen zu Proteinen tragen, die an bestimmten Interessenspfaden beteiligt sind. Dies würde dazu beitragen, die Auswirkungen von Stress auf eine Vielzahl von zellulären Prozessen wie Replikation, Transkription, Zellwandsynthese oder Zellteilung aufzuzeigen. Die Methode kann auf eine Reihe von Bakterienarten angewendet werden, wobei die einzige Voraussetzung darin besteht, dass der mikrofluidische Apparat mit der Morphologie der Zellen kompatibel sein muss. Standard-Mikrofluidplatten eignen sich für stabförmige Bakterien mit einer Zellbreite zwischen 0,7 und 4,5 m. Allerdings müssen Koks, Ovokokken oder andere Bakterienstämme mit besonderen Formen getestet werden. Wenn mikrofluidische Experimente aufgrund der Nichtverfügbarkeit der Geräte oder inkompatibler Bakterienstämme nicht durchgeführt werden können, kann eine Zeitraffer-Bildgebung auf Agarose-Dias für eine maximale Dauer von 2h durchgeführt werden.
Der Gesamtvorteil dieser multiskalen Analyse besteht darin, eine globale Vision der Wirkung der Stressinduktion auf mehrere Aspekte der bakteriellen Wachstumsfähigkeit (d. h. Massensynthese, Zelllebensfähigkeit, Zellmorphologie, Membranintegrität, DNA-Gehalt) und die Art und Weise diese entwickeln sich mit der Zeit in einer Bakterienpopulation, die unter Stressbedingungen wächst. Es ermöglicht auch die Analyse der Wiederherstellung des normalen Wachstums auf der Ebene der einzelnen Zellen und der Bevölkerung. Der Ansatz gilt für eine Vielzahl von Bakterienarten und für praktisch jede Art von Stressbehandlung, wie die Exposition gegenüber Antibiotika oder anderen antimikrobiellen Verbindungen, die Analyse des Einflusses der Interaktion mit anderen Organismen bei Mehreren Arten Populationen oder die Wirkung genetischer Mutation.
Disclosures
Die Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken F. Cornet für die Bereitstellung der hupA-mCherry Sorte, A. Dedieu für technische Hilfe bei zytometrie und A. Ducret für die Hilfe bei MicrobeJ. Förderung: C. Lesterlin würdigt Inserm- und CNRS-Institutionen sowie das ATIP-Avenir-Programm, die Schlumberger Stiftung für Bildung und Forschung (FSER 2019), die ANR-Förderung für plasMed-Forschungsprogramm (ANR-18-CE35-0008) sowie FINOVI für die Finanzierung von J. Cayron; La Ligue contre le cancer für die Finanzierung der Durchflusszytometerausrüstung. Autorenbeiträge: C.L. und J.C. entwarfen das Verfahren und schrieben das Papier; J.C. führte die Experimente durch und analysierte die Daten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
| E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
| Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
| Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
| Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
| MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
| SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
| TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |
References
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