Multi-Scale analyse af bakterievækst under stress behandlinger

Summary

Denne protokol tillader en tidsløst beskrivelse af bakterievækst under stressforhold på enkelt cellen og cellernes populations niveauer.

Abstract

Analyse af bakterie evne til at vokse og overleve under stress betingelser er afgørende for en bred vifte af mikrobiologiske undersøgelser. Det er relevant at karakterisere reaktionen af bakterieceller til stress-inducerende behandlinger såsom udsættelse for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, bestråling, ikke-fysiologisk pH, temperatur, eller saltkoncentration. Forskellige stress behandlinger kan forstyrre forskellige cellulære processer, herunder celledeling, DNA-replikation, proteinsyntese, membran integritet eller celle cyklus regulering. Disse virkninger er normalt forbundet med specifikke fænotyper på cellulær skala. Derfor kræver forståelse af omfanget og årsagssammenhæng af stress-induceret vækst eller levedygtighed mangler en omhyggelig analyse af flere parametre, både på enkelt cellen og på befolkningsniveau. Den eksperimentelle strategi præsenteres her kombinerer traditionel optisk tæthed overvågning og plating assays med enkelt-celle analyseteknikker såsom flow flowcytometri og realtid mikroskopi Imaging i levende celler. Denne multi Scale-ramme giver en tidsløst beskrivelse af stress betingenes indvirkning på en bakterie populations skæbne.

Introduction

Det overordnede formål med denne protokol er at analysere adfærden af bakterieceller udsat for stress behandlinger på befolkningen og på enkelt celle niveauer. Bakteriel vækst og levedygtighed er traditionelt behandles på befolkningsniveau ved hjælp af optisk tæthed overvågning (OD_600Nm), som er en proxy af bakteriecelle masse syntese, eller ved plating assays at bestemme koncentrationen af levedygtige celler i kulturen (koloni danner enhed per milliliter, CFU/ml). Under normale (ustressede) vækstbetingelser, er OD_600Nm og CFU/ml målinger strengt korrelerede, fordi bakteriel fordobling tid afhænger direkte af cellemasse stigning^1,2. Men, denne sammenhæng er ofte forstyrret under forhold, der påvirker cellemasse syntese³, celle division⁴, eller at udløse celle lysis. Et simpelt eksempel er tilvejebragt af stress behandlinger, der hæmmer celledeling, hvilket resulterer i dannelsen af filamentøse bakterieceller^5,6. Filamentøse celler forlænges normalt, fordi cellemasse syntesen er upåvirket, men de er ude af stand til at opdele i levedygtige celler. Den optiske kultur tæthed vil derfor stige med tiden med en normal hastighed, men ikke koncentrationen af levedygtige celler bestemt ved plating assays (CFU/mL). I dette tilfælde, som i mange andre, optisk tæthed og plating målinger er informative, men undlader at give en omfattende forståelse af den observerede stress-induceret effekt. Disse ensemble assays skal kombineres med enkelt celle analyseteknikker for at muliggøre en dybtgående karakterisering af stress-induceret vækst mangler.

Her beskrives en procedure, der kombinerer fire komplementære eksperimentelle tilgange: (1) traditionelle plating assays og grundlæggende optisk tæthed overvågning til at overvåge cellelevedygtighed og cellemasse syntese, henholdsvis; (2) flow cytometri til at evaluere Cellestørrelse og DNA-indholds parametre på et stort antal celler; (3) mikroskopi snapshot Imaging til at analysere celle morfologi; og (4) time-lapse enkelt celle-billeddannelse i mikrofluidisk kamre til undersøgelse af den tidsmæssige dynamik celle skæbne. Denne multi-skala ramme gør det muligt at fortolke de globale virkninger på cellevækst og levedygtighed i lyset af de enkelte cellernes opførsel. Denne procedure kan anvendes til at dechifrere reaktionen fra forskellige bakteriearter til stort set enhver stress af interesse, herunder vækst under særlige forhold (dvs. vækstmedium, pH, temperatur, saltkoncentration), eller udsættelse for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser.

Protocol

1. cellekultur, stress-induktion, og prøvetagning procedure

Bemærk: Brug steril kultur glas, pipettespidser og vækstmedium filtreret ved 0,22 μm for at undgå baggrunds partikler. Her dyrkes cellekulturer i lav autofluorescens rige definerede medium (Se tabel over materialer)^7,8.

1. Streak den bakterielle stamme af interesse fra en frosset glycerol bestand på en Luria-bouillon (LB) agopstået plade (med selektiv antibiotika, hvis det kræves) og inkubere ved 37 °C natten over (17 timer).
   Bemærk: eksemplet eksperiment præsenteret her bruger Escherichia coli MG1655 Hupa-mcherry. Denne stamme producerer fluorescently Tagged underenhed α af HU nucleoid associeret protein, hvilket giver mulighed for lys mikroskopi visualisering af kromosom i levende celler⁹.
2. Der inokuleres 5 mL medium med en enkelt koloni og vokser ved 37 °C med omrystning ved 140 rotation pr. minut (rpm) natten over (17 timer). Kolber (≥ 50 mL) eller store diameter (≥ 2 cm) reagensglas skal anvendes for at sikre tilfredsstillende luftning af den ophidlede kultur.
3. Den følgende morgen måler den optiske tæthed ved 600 nm (OD_600Nm) og fortynder kulturen til et testrør med frisk medium til en OD_600nm af 0,01. Den samlede mængde af kulturen skal justeres afhængigt af antallet af tidspunkter, der skal analyseres under forsøget.
4. Læg en 200 μL prøve af kulturen i en mikropladen (0,2 mL pr. brønd af arbejdsvolumen med en klar, gennemsigtig bund) og anbring den i en automatiseret plade læser (Se tabel over materialer) for OD_600Nm overvågning under inkubation ved 37 °c.
5. Det inokulerede reagensglas inkubateres ved 37 °C med omrystning (140 rpm) til OD_600Nm = 0,2, svarende til fuld eksponentiel fase i rigt medium.
   Bemærk: det er afgørende at dyrke cellerne i mindst 4 − 5 generationer, før der opnås en korrekt eksponentiel vækst. Det initiale inokulum, der anvendes i trin 1,3 (OD_600Nm = 0,01), skal tilpasses i tilfælde af vækst i det fattigere medium (dvs. hvor eksponentialfasen NÅS under OD 0,2), eller hvis der ønskes flere generationer (f. eks. til specifikke fysiologiske studier eller til udvidede stress behandlinger).
6. Ved OD_600Nm = 0,2, udtages følgende kultur prøver svarende til t₀ -tidspunktet (eksponentielt voksende celler før stress induktion): (1) en prøve på 150 μl, som straks skal læsses i det microfluidiske apparat til tidsforskudt mikroskopi (se punkt 2); 2) en prøve på 200 μL til fortynding og plating analyse (se punkt 3) 3) en prøve på 250 μL, der skal lægges på is til analyse af strømnings cytometri (punkt 4) (4) en prøve på 10 μL, der straks deponeres på et agopstået-monteret lysbillede til mikroskopi snapshot Imaging (Se afsnit 5).
7. Udsæt den cellekultur, som er tilbage i test røret, for den specifikke STRESSBEHANDLING, du ønsker at undersøge, og Inkuber ved 37 °C med rystelser (140 rpm).
   Bemærk: kulturen vokser i den automatiserede plade læser til OD_600Nm overvågning bør også underkastes STRESSBEHANDLING.
8. På relevante tidspunkter efter stress behandlingen (t₁, t₂, t₃osv.) udtages følgende celleprøver fra den stressede kultur: (1) en prøve på 200 μl til fortynding og plating (se punkt 2); 2) en prøve på 250 μL, der skal sættes på is til analyse af strømnings cytometri (punkt 3) (4) en prøve på 10 μL, der straks deponeres på et agopstået-monteret lysbillede til mikroskopi snapshot Imaging (se punkt 4).
   Bemærk: hver stress-inducerende behandling har en effektivitet, der er dosis-og tidsafhængig. Således kan det være nødvendigt at køre indledende tests for at bestemme dosis og varigheden af behandlingen, der skal anvendes til optimale resultater. Dette kan gøres ved at udføre OD overvågning ved hjælp af en automatiseret plade læser (potentielt forbundet med plating assays) af en cellekultur behandlet med en række doser og eksponeringstider. I forsøget præsenteret her, cellekulturen blev behandlet med celle division-inhibering antibiotika cephalexin (CEPH.) ved 5 μg/mL endelig koncentration i 60 min. cephalexin blev derefter vasket væk ved pelletering af cellerne i et 15 mL rør ved hjælp af centrifugering (475 g, 5 min), fjernelse af supernatanten, suspension af celle pellet i et tilsvarende volumen af frisk medium ved blid pipettering og overførsel til et rent rør. De vaskede celler blev inkuberet ved 37 °C med omrystning (140 rpm) for at muliggøre genvinding. Prøven blev udtaget ved t₆₀ (60 min. efter cephalexin-tilsætning svarende til den» cephalexin-60min-behandlede «prøve), t₁₂₀ (60 min efter vask) og t₁₈₀ (120 min efter vask).

2. plating analyse

Bemærk: plating analysen gør det muligt at måle koncentrationen af celler i stand til at generere en CFU i kultur prøverne. Denne procedure afslører den hastighed, hvormed en celle opdeles i to levedygtige celler og gør det muligt at opdage celledeling arrestationer (f. eks stigning i den bakterielle generation tid af celle lysis).

1. Forbered 10-dobbelte serielle fortyndinger op til 10^-7 af 200 μl kultur prøve i frisk medium. Plade 100 μL af den relevante fortynding på ikke-selektive LB-aganerings plader for at opnå mellem 3 − 300 kolonier efter natten inkubation ved 37 °C.
   Bemærk: seriel fortynding i frisk medium skal udføres hurtigt for at begrænse bakterie inddelinger. Alternativt kan forskerne overveje at bruge en saltvandsopløsning uden en kulstofkilde til at forhindre celle inddelinger under fortyndingsprocessen.
2. Den næste dag, tælle antallet af kolonier til at bestemme koncentrationen af levedygtige celler (CFU/mL) i hver kultur prøve. CFU/mL afbildes som en funktion af tiden for ubehandlede og behandlede cellekulturer.

3. strømnings cytometri

Bemærk: i det følgende afsnit beskrives forberedelsen af celleprøver til analyse af strømnings cytometri. Denne analyseteknik afslører fordelingen af Cellestørrelse og DNA-indhold for et stort antal celler. Når det er muligt, anbefales det at behandle flowcytometri-prøverne med det samme. Alternativt kan prøverne holdes på is (i op til 6 timer) og analyseres samtidigt i slutningen af dagen, når plating og mikroskopi Imaging er udført.

1. 250 μL af kultur prøven fortyndes for at opnå 250 μL ved en koncentration på ~ 15.000 celler/μL (svarende til en OD_600Nm ~ 0,06) i fersk medium ved 4 °c.
   Bemærk: inkubation på is vil begrænse væksten og morfologiske modifikation af cellerne. Alternativt kan brugeren overveje at udføre fiksering af cellerne i 75% ethanol, som normalt anbefales til strømnings cytometri¹⁰.
2. For DNA-farvning blandes bakterie prøven med en 10 μg/mL opløsning af DNA-fluorescerende farvestof (ratio 1:1) og Inkuber i mørket i 15 minutter, før prøven analyseres.
3. Prøven føres ind i flowcytometer med en ~ 120.000 celler/min. strømningshastighed. Erhverve fremad-spredt (FSC) og side-spredt (SSC) lys samt DNA fluorescerende farvestof fluorescens signal (FL-1) med de relevante indstillinger.
4. Plot FSC og FL-1 celletæthed histogrammer til at repræsentere fordelingen af Cellestørrelse og DNA-indhold i celle populationen.

4. snapshot mikroskopi Imaging

Bemærk: den følgende del beskriver forberedelsen af mikroskopi dias og billed erhvervelse for populations snapshot analyse. Denne procedure vil give oplysninger om morfologien af cellerne (celle længde, bredde, form) og den intracellulære organisation af nucleoid DNA.

1. Forvarm det termoformede mikroskop kammer ved 37 °C for at stabilisere temperaturen, før observationerne påbegyndes. Dette kammer giver mulighed for temperatur modulation af mikroskop optik og prøve fase under tidsforskudt eksperimenter.
2. Forbered de agopstået-monterede slides som beskrevet i Lesterlin og Dubarry⁷.
   1. Fjern plastfolie fra bunden af den blå ramme (Se tabel over materialer), forlader den udhulet plastfilm på den anden side. Stick den blå ramme på et mikroskop glas slide.
   2. Pipette ~ 150 μL smeltet 1% agopstået medium opløsning og hæld i det blå ramme rum. Dæk hurtigt med en ren dækseddel for at fjerne den overskydende væske, og vent et par minutter på, at agrose puden størkner ved stuetemperatur.
   3. Når celle prøven er klar, fjernes dæksedlen og plastik filmen fra den blå ramme. Hæld 10 μL celleprøve på agrose pad og VIP glaspladen forsigtigt for at sprede dråbe. Når al væsken er adsorbet, skal du holde en ren dækseddel på den blå ramme for at forsegle prøven. Mikroskopi-diaset er nu klar til mikroskopi.
3. Placer diaset på mikroskopet og Udfør billed erhvervelse ved hjælp af transmitteret lys (med et mål for fasekontrast) og med lyskilde excitation ved de relevante bølgelængder (560 nm for mCherry).
4. Vælg visningsfelter, der indeholder isolerede celler, for at lette automatiseret celle registrering under billedanalyse. Sørg for, at mindst 300 celler er afbildet for at tillade solid statistisk analyse af celle populationen.

5. microfluidics time-lapse mikroskopi Imaging

Bemærk: den følgende del forklarer forberedelsen af de mikrofluidiske plader (Se tabel over materialer), celle indlæsning, microfluidics program og tidsforskudt billed erhvervelse. Denne Imaging procedure afslører opførsel af individuelle celler i realtid.

1. Fjern bevarings opløsningen fra den mikrofluidiske plade, og Udskift den med frisk medium forvarmet til 37 °c, som beskrevet i brugervejledningen til mikrofluidisk software.
2. Forsegl mikrofluidic pladen til manifold systemet og klik på priming knappen.
3. Placer den mikrofluidiske plade med manifold-systemet på mikroskopet og Forvarm ved 37 °C i ~ 2 timer, før mikroskopi-købet påbegyndes.
   Bemærk: denne forvarmning skridt er afgørende for at undgå dilatation af mikrofluidisk kammer, som ville ændre fokus på mikroskopet under tidsforskudt eksperiment og kompromis image erhvervelse.
4. Forsegl mikrofluidic pladen. Udskift mediet fra godt 8 med 150 μL kultur prøve, og Udskift mediet fra brønd 1 til 5 ved det ønskede medium med eller uden det stress-inducerende reagens.
5. Forsegl mikrofluidic pladen og anbring den på mikroskopet.
6. På den mikrofluidisk software (Se tabel over materialer) køre celle lastning procedure. Kontroller, at belastningen af cellerne er tilfredsstillende ved at kigge under mikroskopet i overført lys. Kør celle indlæsnings proceduren en anden gang, hvis celletætheden i kammeret er utilstrækkelig.
7. Udfør omhyggeligt fokus i transmitteret lys tilstand og vælg flere synsfelter, der viser isolerede bakterier. Det er vigtigt at vælge felter, der ikke er overfyldte, for at kunne overvåge væksten af isolerede celler over tid (~ 10 − 20 celler pr. 100 μm² anbefales). Dette vil også lette celle detektering under billedanalyse.
8. På den mikrofluidisk software, klik på Opret en protokol knap. Programmer injektionen af vækstmedium for 1 − 2 generations tidsækvivalenter for at gøre det muligt for cellerne at tilpasse sig (valgfrit). Derefter programmere injektion af stress-inducerende medium under 10 min ved 2 PSI, efterfulgt af injektion ved 1 psi for den ønskede varighed af STRESSBEHANDLING. Hvis du har til hensigt at analysere genopretning af cellerne efter stress, programmere injektion af frisk vækstmedium for den ønskede varighed.
   Bemærk: i det eksperiment, der præsenteres her, blev cephalexin injiceret i 10 minutter ved 2 PSI, efterfulgt af 50 min ved 1 PSI. Derefter, frisk vækstmedium blev injiceret på 2 psi i 10 min, efterfulgt af 3 h ved 1 PSI.
9. Udfør mikroskopi Imaging i time-lapse-tilstand med 1 ramme hver 10 min ved hjælp af fasekontrast i transmitteret lys og en 560 nm excitation lyskilde til mCherry signal, hvis det kræves.
   Bemærk: det er vigtigt at starte mikroskopisk billed erhvervelse på samme tid som starten på den mikrofluidisk injektion protokol.

6. billedanalyse

Bemærk: dette afsnit beskriver kort de vigtigste trin i behandling og analyse af snapshot-og time-lapse-mikroskopi billeder. Åbning og visualisering af mikroskopi billeder sker med open source ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)¹¹. Kvantitativ billedanalyse udføres ved hjælp af open source ImageJ/Fiji software sammen med den gratis MicrobeJ plugin¹² (https://microbej.com). Denne protokol anvender MicrobeJ 5.13 I-versionen.

1. Åbn Fiji-softwaren og MicrobeJ-plugin'et.
2. For snapshot analyse, drop alle billeder svarende til en mikroskop slide (en prøve) i MicrobeJ loading bar at sammenkoble billeder og gemme den opnåede billede stakke fil. For time-lapse data, bare droppe billedet stakken i lastning bar af MicrobeJ.
3. Kør automatiseret detektion af cellernes konturer baseret på segmentering af fasekontrast billede og, hvis det er relevant, af nucleoider baseret på segmentering af det farvede DNA fluorescens signal. Kontroller nøjagtigheden af celle detektering visuelt og brug MicrobeJ redigeringsværktøjet til korrektion, hvis det er nødvendigt. Gem resultatfilen opnået.
   Bemærk: de indstillinger, der anvendes til påvisning af E. coli -celler, er angivet i tabellen over materialer (se kolonnen med kommentarer/beskrivelser af microbej). For andre bakteriearter (især for bakterier, som ikke er stang formede), skal brugeren justere indstillingerne før detektion (Se tutorial MicrobeJ). For time-lapse billeder, kører en semi-automatiseret detektion af cellerne ved hjælp af MicrobeJ redigeringsværktøj kan foretrækkes at tillade fokus på skæbnen for individuelle celler (Se MicrobeJ tutorial).
4. Klik på ikonet resultj for at fuldføre analysen og få vinduet resultj . Mange forskellige typer af output grafer kan genereres fra dette punkt. Plot de normaliserede histogrammer af celle form/længde og gennemsnitlige nucleoid tal pr. celle.

Representative Results

Den beskrevne procedure blev anvendt til at analysere adfærden af Escherichia coli K12-celler under forbigående udsættelse for cephalexin, et antibiotikum, der specifikt hæmmer celledelingen (figur 1A)¹³. Den hupa-mcherry E. coli stamme, der producerer fluorescently mærket Hu protein forbundet med kromosomal DNA blev brugt til at undersøge dynamikken i kromosom i hele denne behandling^8,9. De eksponentielt voksende Hupa-mCherry E. coli celler blev analyseret før (t₀) og 60 min efter inkubation med cephalexin (t₆₀). Derefter blev antibiotikummet skyllet væk, og genfinding af celle populationen efter 1 time (t₁₂₀) og 2 t (t₁₈₀) blev analyseret (figur 1B).

Figur 1: procedure for analyse af bakteriel respons på stress behandlinger. A) skematisk metode. B) tegneserie, som illustrerer cellernes morfologi under normal vækst i rigt medium og under forbigående udsættelse for cephalexin (CEPH.), fra tilsætning ved (t₀) og efter cephalexin vask fra (t₆₀) til (t₁₈₀). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den parallelle udvikling af OD og CFU/mL er en første indikator, der hjælper med at forstå effekten af stress behandlingerne. Disse to parametre er strengt korreleret under uforstyrrede vækst, men er ofte ukoblede og udvikle sig selvstændigt under stress. Cellekulturer vokser i nærværelse af cephalexin udstillet lignende OD_600Nm stigninger som de ustressede kulturer (figur 2A), viser, at stoffet ikke påvirkede cellemasse syntese. Koncentrationen af levedygtige celler steg imidlertid ikke, når cephalexin var til stede på grund af en streng hæmning af celledelingen (figur 2B). Cellerne begyndte at dividere igen, da cephalexin blev fjernet og nåede til sidst en koncentration svarende til den ustressede kultur ved (t₁₈₀). Disse resultater afspejler den bakteriostatiske virkning af cephalexin, som inducerer en fuldt reversibel hæmning af celledelingen. Forskellige belastninger vil resultere i forskellig frakobling af OD-og CFU/mL-kurver, afhængigt af den inducerede effekt (f. eks. ændring af cellernes morfologi såsom filamentation eller udbuling, celledød med eller uden lyse). En ikke-udtømmende liste over mulige resultat resultater, der indikerer forskellige stress-inducerede virkninger, er præsenteret i figur 2C.

Figur 2: bakterievækst overvågning af ubehandlet og cephalexin-behandlede celler på populationsniveau. (A) overvågning af optisk tæthed (OD_600Nm/ml). B) koncentration af levedygtig celle (CFU/ml) inden for ubehandlet og cephalexin-60min-behandlede kulturer. Fejllinjer angiver standardafvigelsen for et eksperimentelt triplicat. C) skemaer over mulige resultater og dermed forbundne stress effekter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

En enkelt celle analyse er afgørende for en nøjagtig fortolkning af den observerede stress respons på populationsniveau. Flow cytometri gør det muligt at undersøge Cellestørrelse og DNA-indhold i flere tusinde celler^14,15 (figur 3). Eksponeringen for cephalexin medførte parallel øgning af Cellestørrelse og DNA-indhold (t₆₀). Da cephalexin blev fjernet, faldt befolknings cellens størrelse og DNA-indholdet gradvist for at blive magen til den ustressede population ved t₁₈₀. Disse resultater viser, at cephalexin ikke hæmmer DNA-replikation og provokeret dannelsen af filamentøse celler, der indeholdt flere kromosom ækvivalenter. Disse filamenter opdelt i celler med normal Cellestørrelse og DNA-indhold, når stoffet blev vasket væk. Flow cytometri resultater ville være meget forskellige for understreger, der hæmmer DNA-syntese, som fører til dannelsen af filamentøse celler, der kun indeholder en ikke-replicerende kromosom. I så fald ville cellestørrelsen stige tilsvarende, men ville ikke være forbundet med øget DNA-indhold.

Figur 3: repræsentativ flow cytometri analyse af ubehandlet og cephalexin-60min-behandlede celler. (A) celle størrelsesfordeling histogrammer (FSC-H). B) DNA-indhold HISTOGRAMMER (FL1-SYTO9). n = 120.000 celler analyseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Snapshot mikroskopi Imaging blev brugt til at undersøge cellernes morfologi og den intracellulære organisering af det DNA, der blev vist ved Hu-mcherry lokalisering (figur 4A). Cephalexin provokeret dannelsen af lange celler med normal cellebredde og ingen division septa. Disse glatte filamenter indeholdt jævnligt fordelte DNA-strukturer kaldet nucleoider, hvilket bekræfter, at cephalexin ikke påvirkede kromosom replikation og adskillelse. Kvantitativ billedanalyse bekræftede i vid udstrækning den stigning i Cellestørrelse og DNA-indhold, som tidligere blev observeret med flowcytometri (figur 4B, C). Resultaterne vil være meget forskellige for belastninger, der inducerer DNA-skader, som fører til dannelsen af filamentøse celler, hvor replikation fortsætter, men segregation er forringet. I dette tilfælde ville Cellestørrelse og DNA-indhold stige på samme måde, men cellerne ville havne en enkelt ustruktureret masse af DNA. Snapshot billeder kan også afsløre andre slags afvigende celle former eller tilstedeværelsen af mini, anucleate eller lyseres celler (spøgelses celler).

Figur 4: mikroskopi snapshot analyse af ubehandlet og cephalexin-60min-behandlede celler. A) repræsentative mikroskopi billeder,derviser fasekontrast (grå) og hu-mcherry signal (rød). (B) celle længde fordeling histogrammer. Skala bar = 5 μm.C) histogrammer af antallet af nukleoid pr. celle. Mellem 800 og 2.000 celler blev analyseret for hver prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tidsforskudt mikroskopi i forbindelse med mikrofluidisk-apparatet¹⁶ hjalp med at bestemme de tidligere observerede fænotyper og giver yderligere indsigt i udviklingen og årsagssammenhængen i vækst manglen. Tidsforskudt billeder (figur 5A og film 1) bekræftede, at celle forlængelse (cellemasse syntese) og kromosom replikation og segregation ikke blev hæmmet af eksponering for cephalexin. Desuden afslørede det processen med genopretning, når cephalexin blev fjernet. Analyse af filamentøse celle Lineage viste, at celle division genstarter ~ 20 min efter vask væk lægemidlet (figur 5B). De resulterende opdelte celler var levedygtige, fordi de igen opdelt, i sidste ende fører til dannelsen af 33 celler udviser normal størrelse og DNA-indhold. Dette tillod beregning af en samlet generation tid på ~ 31 min over 180 min af eksperimentet, som svarer til den generation tid beregnet for den ustressede population fra CFU/mL målinger (~ 33 min).

Figur 5: mikroskopi time-lapse analyse af cephalexin-60min-behandlede celler. A) repræsentative mikroskopi billeder,derviser fasekontrast (grå) og hu-mcherry signal (rød). Den overvågede filamentøse-celle er angivet med den hvide kontur og opdelte celler med forskellige farver. Skala bjælke = 5 μm.B) skematisk gengivelse af den filamentøse cellelinje svarende til panel (A) og til film 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1: Microfluidic film af E. coli Hu-mcherry behandlet med cephalexin. Cephalexin blev injiceret efter 60 min, efterfulgt af injektion af frisk RDM medium for 3 h. tid angivet med gult (1 ramme hver 10 min). Skala bar = 5 μm. Klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).

Discussion

Det er vigtigt at være opmærksom på vækst tilstand af cellerne under proceduren. Udvid cellerne over flere generationer, før du når en fuld eksponentiel fase. For succesen med denne metode, er det vigtigt, at alle celler prøver indsamles samtidigt, og det er bedst at analysere kun én behandlet og en ubehandlet kultur på samme tid. Celleprøver til mikroskopi-billeddannelse skal opretholdes ved forsøgstemperaturen under hele proceduren. Det er så vigtigt at forvarme mikroskop kammeret og mikrofluidisk kammer før begyndelsen af forsøget. Hvis celleprøver til strømnings cytometri ikke kan analyseres let, kan de holdes på is i op til 6 timer. inkubation på is vil begrænse væksten og morfologiske modifikation af cellerne. Alternativt kan brugeren overveje at bruge fiksering af cellerne i ethanol 75%, hvilket normalt anbefales til strømnings cytometri¹⁰. Hvis protokollen kræver at vaske stress indutoren fra mediet, centrifugeres og pipetter celler meget omhyggeligt for at undgå at beskadige de potentielle afvigende celler.

Både flow flowcytometri og snapshot analyse giver adgang til Cellestørrelse og DNA-indholds parametre, med Snapshots, der giver yderligere observation af cellens morfologi. DNA-farvning med DAPI¹⁰ (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) eller andre stabile DNA-farvestoffer kan udføres, hvis der ikke er nogen fluorescerende fusion til rådighed til at observere nucleoider i organismen af interesse. Hvis flowcytometry analyse ikke kan udføres, er det vigtigt at billede og analysere et stort antal celler ved mikroskopi.

Mikroskopi Imaging kan også udføres ved hjælp af stammer, der transporterer fluorescerende fusioner til proteiner, der er involveret i specifikke veje af interesse. Dette ville bidrage til at afsløre effekten af stress på en række cellulære processer såsom replikation, transskription, cellevæg syntese, eller celle division. Metoden kan anvendes på en række bakteriearter, idet det eneste krav er, at det mikrofluidiske apparat skal være kompatibelt med cellernes morfologi. Standard mikrofluidisk plader er bekvemme for stang-form bakterier med en cellebredde mellem 0,7 μm og 4,5 μm. Dog skal cocci, ovococci eller andre bakteriestammer med ejendommelige former testes. Alternativt, hvis der ikke kan udføres mikrofluidiske eksperimenter på grund af manglende tilgængelighed af udstyret eller uforenelige bakteriestammer, kan tidsforskudt billeddannelse udføres på agopstået-monterede slides i en maksimal varighed på 2 timer.

Den samlede fordel ved denne multi-skala analyse er at give en global vision af effekten af stress induktion på flere aspekter af bakterievækst evne (dvs. masse syntese, cellelevedygtighed, celle morfologi, membran integritet, DNA-indhold) og den måde disse udvikler sig med tiden i en bakteriepopulation vokser under stress betingelser. Det giver også mulighed for at analysere genoprettelsen af normal vækst på enkelt celleniveau og befolkningsniveau. Tilgangen gælder for en lang række bakteriearter og for praktisk talt enhver form for STRESSBEHANDLING, såsom udsættelse for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, analyse af indflydelsen af interaktion med andre organismer i flere arter populationer eller virkningen af genetisk mutation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	BioRad	1613100	Certified molecular biology agarose
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	ThermoFisher scientific	A24858	Cytometer
CellASIC ONIX Microfluidic System	Merck Millipore	CAX2-S0000	Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG	Merck Millipore	ONIX2 1.0.1	Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic	Merck Millipore	CAX2-MBC20	Manifold system
CytoOne 96-well plate with lid	Starlab	CC7672-7596	Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion			Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc/	Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication
Gene Frame	Thermo Scientific	AB-0578	Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm)
Luria-Broth agarose medium	MP Biomedicals	3002232	Growth medium for plating assay
MicrobeJ	Imagej/Fiji plugin	https://www.microbej.com/	Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters
Microfluidic Plates CellASIC ONIX	Merck Millipore	B04A-03-5PK	Plate for Microfluidic system
Microscope Nikon eclipse Ti	Nikon		Fluorescence microscope
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)	Teknova	M2105	Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S34854	DNA fluorescent dye
TECAN Infinite M1000	TECAN	30034301	Automated plate reader