Summary
Здесь мы представляем протокол для in vivo увеличения кишки-самонаведения регулятивной индукции Т-клеток. В этом протоколе дендритные клетки разработаны для локального производства высоких концентраций активного витамина D (1,25-дигидроксивитамин D или 1,25-ОХ)2D) и активного витамина А (ретиноевая кислота или РА) де-ново.
Abstract
Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является воспалительным хроническим заболеванием в желудочно-кишечном тракте (GUT). В Соединенных Штатах, Есть около 1,4 миллиона пациентов IBD. Общепризнано, что дисрегулируемый иммунный ответ на кишечные бактерии инициирует болезнь и нарушает слизистую оболочку эпителиального барьера. Недавно мы показываем, что кишки homing нормативных T (Treg) клетки являются перспективными терапии для IBD. Соответственно, эта статья представляет протокол для in vivo увеличения кишки-homing Treg клетки индукции. В этом протоколе, дендритные клетки разработаны для производства локально высоких концентраций двух молекул de novo, активного витамина D (1,25-dihydroxyvitamin D или 1,25-OH2D) и активного витамина А (ретиноиновая кислота или РА). Мы выбрали 1,25 (OH)2D и RA на основе предыдущих выводов, показывающих, что 1,25 (OH)2D может вызвать выражение регуляторных молекул (например, вилочная коробка P3 и интерлейкин-10) и что РА может стимулировать экспрессию рецепторов самонаведения кишечника в Т-клетках. Для генерации таких инженерных дендритных клеток мы используем лентивирусный вектор для преобразить дендритные клетки, чтобы переэкспрессировать два гена. Одним из генов является цитохром P450 семейства 27 подсемейства B член 1, который кодирует 25-гидроксивитамин D 1 "гидроксилаза, которая физиологически катализа синтеза 1,25 (OH)2D. Другой ген альдегид дегидрогеназы 1 член семьи A2, который кодирует ретинальдегид дегидрогеназы 2, который физиологически катализа синтеза РА. Этот протокол может быть использован для будущего исследования кишки самонаведения Treg клеток in vivo.
Introduction
Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является воспалительным хроническим заболеванием в желудочно-кишечном тракте (GUT). В Соединенных Штатах, Есть около 1,4 миллиона пациентов IBD. Принято считать, что дисрегулируемый иммунный ответ на кишечные бактерии инициирует болезнь и нарушает слизистую оболочку эпителиального барьера1,2. По этой причине, в настоящее время доступны США пищевых продуктов и медикаментов (FDA) утвержденных препаратов подавляют функции воспалительных посредников или блокировать самонаведения иммунных клеток в кишечнике. Тем не менее, воспалительные посредники и иммунные клетки, которые являются мишенью также необходимы для иммунной защиты. В результате, ингибиторы воспалительного посредника компрометируют системную иммунную защиту, а блокаторы самонаводящихся иммунных клеток ослабляют иммунную защиту кишечника, оба из которых могут привести к тяжелым последствиям3,4. Кроме того, блокаторы самонаведения иммунных клеток могут также блокировать самонаводящиеся регулятивные Клетки T (Treg) в кишечник и, следовательно, могут ухудшить уже скомпрометированную иммунную толерантность кишечника у пациентов IBD. Кроме того, блокирование Treg ячейки самонаведения в кишечнике может также привести к системному подавлению иммунной системы из-за накопления клеток Treg в крови5. Наконец, ингибиторы и блокаторы функционируют временно и, таким образом, требуют частых вводом. Частое введение этих ингибиторов и блокаторов может еще больше усугубить неблагоприятные побочные эффекты.
Недавно мы предложили новую стратегию, которая потенциально может смягчить или даже устранить побочные эффекты, связанные с текущими препаратами для лечения IBD6. Эта стратегия дополняет индукцию клеток Treg, наводящих кишки в периферических лимфоидных тканях6. Обоснование этой стратегии является то, что кишки самонаведения Treg клетки специально дома в кишечнике и, следовательно, не будет идти на компромисс системной иммунной защиты. Кроме того, так как клетки Treg потенциально могут формировать память7,8, кишки-homing Treg клетки потенциально могут обеспечить стабильный контроль хронического воспаления кишечника у пациентов IBD и, таким образом, лечение не должно быть введено так часто. Кроме того, так как эта стратегия увеличивает индукции кишки hom-homing Treg клеток in vivo, она не имеет озабоченность in vivo нестабильности в высокопровистской среде, которая связана с приемной передачи in vitro генерируемых Treg клеток9,10. В связи с этим, в пробирке генерируемых Treg клетки являются одной из предложенных стратегий для лечения аутоиммунных заболеваний11,12,13 и трансплантации отказ14,15. Наконец, в этой стратегии, дендритные клетки (DCs) разработаны для производства локально высоких концентраций двух молекул de novo: активного витамина D (1,25-dihydroxyvitamin D или 1,25-ОГ)2D) и активного витамина А (ретиноиновая кислота или РА). Мы выбрали 1,25 (OH)2D и РА, потому что 1,25 (OH)2D может вызвать экспрессию регуляторных молекул (например, вилочная коробка P3 «foxp3» и интерлейкин-10 «IL-10»)16,17 и что РА может стимулировать выражение рецепторов кишки в Т-клетках18. Потому что оба 1,25 (OH)2D и РА может также tolerize DCs28,29, мы считаем, что инженерии DCs будет стабильно поддерживается в толерогенном статусе in vivo и, следовательно, обойти in vivo нестабильности проблем, которые связаны с in vitro генерируемых DCs (TolDCs)19,20,21. В этом отношении, TolDCs также являются одной из предлагаемых стратегий для in vivo увеличения Treg функции клеток19,20,21. Для поддержки наших рассуждений, мы показали, что инженерии DCs, после доставки in vivo, может увеличить индукцию кишечника hom-homing Treg клеток в периферических лимфоидныхтканей 6.
Дополнительным преимуществом нашей предлагаемой стратегии является то, что 1,25 (OH)2D также имеет другие функции, которые потенциально могут принести пользу пациентам IBD. Эти другие функции включают в себя способность 1,25 (OH)2D, чтобы стимулировать секрецию противомикробных препаратов22 и подавляет канцерогенез23. Инфекции и раковые заболевания часто связаны с IBD24,25.
Для генерации ЦС, которые могут производить локально высокие концентрации как 1,25 (OH)2D и RA de novo, мы используем ленцивирусный вектор для инженера DCs для переэкспресса двух генов. Одним из генов является цитохром P450 семейства 27 подсемейства B член 1 (CYP27B1), который кодирует 25-гидроксивитамин D 1 "гидроксилаза" (1"-гидроксилаза), который физиологически катализает синтез 1,25 (OH)2D. Другой ген альдегид дегидрогеназы 1 член семьи A2 (ALDH1a2), который кодирует дегидрогеназы ретинальдегида 2 (RALDH2), который физиологически катализа синтеза РА6.
Потому что in vivo увеличение кишки-homing Treg клеточной индукции потенциально важно в обработке IBD, в следующем протоколе мы подробно процедуры для генерации 1 "-гидроксилаза-RALDH2-переэкспрессии DCs (DC-CYP-ALDH клеток), что может быть использован для будущего исследования кишки самонаведения Treg клеток in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы исследования животных in vivo были рассмотрены и одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Лома Линда (IACUC), а также Управлением по уходу и использованию животных (ACURO) Командования медицинских исследований и материальных исследований армии США (USAMRMC) Управления по медицинским исследованиям и материальным обеспечения (USAMRMC) Министерство обороны.
1. Подготовка лентивируса, который выражает как 1 "гидроксилазу и RALDH2 (ленти-CYP-ALDH Вирус)
- День 0: Ранним утром, подготовить 5 х 105 клеток / мл из 293T клеток в CM-10-D среды культуры клеток.
- Семена 20 мл/пластина в 150 мм х 25 мм культуры блюда. Культура клеток на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 на 24 ч. Confluency достигнет 80-90% после 24 ч.
- День 1: Сделать 2x HBS (50 мм HEPES, 280 мм NaCl, и 1,5 мм Na2HPO4, рН 7.1). Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
- Сделайте 2 M CaCl2 и храните при комнатной температуре.
- Для каждой 150 мм х 25 мм культуры блюдо, подготовить смесь осадков ДНК в стерильной 50 мл культуры трубки. Во-первых, добавьте 1620 л 2x HBS, 9,5 мкг PMD2G (VSVG), 17,5 мкг pCMVR8.74 (Capsid), 27 мкг пласмида Lenti-CYP-ALDH (лентивирусный вектор, который несет как CYP27B1, так и ALDH1a2). Во-вторых, добавьте H2O в окончательный объем 3037,5 л.
- В последнем, добавить 202,5 л 2 M CaCl2 dropwise при смешивании раствора для конечных концентраций 1x HBS и 125 мМ CaCl2. CaCl2 должен быть последним, который будет добавлен. Оставьте трансфекционные смеси при комнатной температуре в течение 20 минут при случайном смешивании. Для нескольких 150 мм х 25 мм культуры блюда, масштабирование соответственно.
- Добавьте 3240 л смеси осадков ДНК, капли в одну 150 мм х 25 мм культурную тарелку, содержащую 293T клетки. Аккуратно закружить культуры блюдо из стороны в сторону, добавляя смесь осадков ДНК. Инкубировать блюдо при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 24 ч.
- День 2: Удалить раствор трансфекции фосфата кальция, мыть осторожно с 1x PBS, и перекормить клеточной культуры с CM-4-D клеточной культуры среды. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 24 ч.
- День 3: Урожай супернатантов в стерильных бутылках хранения и хранить при 4-8 градусов по Цельсию. Пополнить клеточной культуры со свежим CM-4-D среды культуры клеток. Культура клеток на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 еще 24 ч.
- День 4: Урожай супернатантов в стерильных бутылках хранения. Фильтр супернатантов от 3-го дня и дня 4 через фильтр 0,45 мкм. Чтобы сконцентрировать вирус псевдотипа VSVG, перенесите супернационты в центрифуги и вращайтесь при 4780 х г на 24 ч при 4 градусах Цельсия.
- День 5: Налейте супернатанты с гранул (гранулы часто видны) и позволяют трубам стечь на бумажное полотенце в стерильных биобезопасности шкаф в течение нескольких минут.
- Приостановите гранулы путем пипетки со стерильным PBS, содержащим 5% глицерола. Объем для повторного действия составит 33,3 л на 150 мм х 25 мм.
- Aliquot 200 л/трубка и хранить при -80 градусах По Цельсию. Сделайте отдельный аликот в размере 50 л/флаал для целей титрования. Титры должны находиться в пределах 108-109 трансдукционных агрегатов (ТУ)/мл.
- Добавить отбеливатель в культуре блюда и отказаться от них.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти транс-инфицированные клетки являются самой большой проблемой безопасности в протоколе, так как все лентивирусные элементы выражаются в клетках.
2. Поколение ДК, полученных из костного мозга (BMDCs)
- Урожай tibias и бедренной кости от 4-5 Бальб / с мышей в 50 мл стерильной полипропиленовой трубки, содержащей культуру среды6.
- Перенесите тибии и бедренные кости в культовое блюдо размером 100 мм х 20 мм, содержащее культурную среду. Удалить ткани, такие как мышцы из tibias и бедренной кости с помощью вскрытия ножницы и щипцы.
- Вырежьте оба конца тибиаса и бедренной кости, чтобы разоблачить полость костного мозга.
- Нарисуйте 10 мл культуры среды в 10 мл шприц прилагается к 30 G иглы.
- Аккуратно вставьте иглу в полость костного мозга и промойте костный мозг в чистую стерильную полипропиленовая трубку 50 мл. Повторите эту процедуру, если это необходимо, чтобы убедиться, что костный мозг был полностью вымыт.
- Пелле клетки костного мозга центрифугированием (400 х г)при 2-8 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Аспирировать супернатант.
- Отрежь гранулы с 5 мл 1x красных кровяных клеток лиза буфера.
- Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 4-5 мин с редкими встряхивания.
- Остановите реакцию, добавив 30 мл культуры среды.
- Пеллети теки центрифугированием (400 х г)при 2-8 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Перенатяните клетки в 10 мл среды культуры клеток CM-10-R. При необходимости, клетки могут быть переданы через 40 мкм ячейки ситечко для удаления мусора.
- Выполните количество клеток и настроить ячейки до 1 х 106 ячеек/мл с помощью CM-10-R среды культуры клеток.
- Добавьте рекомбинантный мурин гранулоцит/макрофаг колоний-стимулирующего фактора (ГМ-CSF, конечная концентрация 100 U/mL) и мурин интерлейкин-4 (IL-4, окончательная концентрация 10 U/mL).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы GM-CSF и IL-4 хранятся при -80 градусов по Цельсию при уровне 100 000 U/mL (1000x) и 10 000 U/mL (1000x), соответственно. - Распределите клетки на 6 культивационных пластин на 4 мл/хорошо и культивации клеток на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 на 48 ч.
- Удалите непристыжие клетки с нежным пипеттингом.
- Добавьте свежий средокультуры клеток CM-10-R, содержащий GM-CSF (100 U/mL) и IL-4 (10 U/mL). Культура клетки еще 48 ч.
- Урожай непридерживаемых клеток (BMDCs) для трансдукции вирусом lenti-CYP-ALDH.
3. Трансдукция DCs с ленти-CYP-ALDH Вирус для создания DC-CYP-ALDH клеток
- Подготовка 1 х 106 DCs / хорошо в общей объеме 0,5 мл CM-10-R клеточной культуры среды, содержащей 50 зл вируса и 8 мкг /мл протамина в 6 хорошо культуры пластины.
- Культура клеток на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 на 24 ч.
- Замените среду со свежимCM CM-10-R среды культуры клеток и культуры клеток на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 еще на 24 ч. На данный момент можно оценить ферментативную деятельность 1"-гидроксилазы и RALDH2 (см. шаг 4). При необходимости повторите шаги 3.1-3.3 для второго трансдукции.
- Добавить липополисахарид (100 нг/мл) и культуры клеток для 24 ч.
- Урожай клеток (DC-CYP-ALDH клетки) для экспериментов.
4. Оценка переэкспрессии 1 "гидроксилаза и RALDH2 в DC-CYP-ALDH клеток
- Оценка переэкспрессии 1"-гидроксилаза в клетках DC-CYP-ALDH
- Семена 1.0 x 106 DC-CYP-ALDH клетки/хорошо в 2 мл CM-10-R клеточной культуры среднего в 12 хорошо культуры пластин.
- Добавьте 25 (OH)D к конечной концентрации 2,5 мкм. Инкубировать клетки DC-CYP-ALDH на 24 ч.
- Урожай супернационтов и хранить при -20 градусах Цельсия.
- Анализ на 1,25 (OH)2D концентрации в супернатантов с использованием коммерчески доступных радиоиммуноанализ (РИА) (см. Таблица материалов).
- Определите экспрессию 1"-гидроксилаза в клетках DC-CYP-ALDH с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) с помощью анти-CYP27B1 антитела.
- Оценка переэкспрессов RALDH2 в клетках DC-CYP-ALDH
ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение и активность overexpressed RALDH2 определяются с помощью коммерческого альдегида дегидрогеназы (ALDH) обнаружения комплекта (см. Таблица материалов).- Семя 1 мл DC-CYP-ALDH или контрольных ячеек (1 х 105 ячеек/мл в буфере анализа) в каждой из двух трубок 5 мл (одна помечена как "Контроль", а другая помечена как "Тест").
- Добавьте 10 юл диэтиламинобензолальдегида (DEAB) раствор (1,5 мМ в 95% этанола) к каждой из контрольных труб и немедленно перемешайте. DEAB является ингибитором RALDH2.
- Добавьте в контрольные и тест-трубки 5 л активированного флуоресценции RALDH (300 мкм) и немедленно перемешайте.
- Инкубировать трубки в течение 45 мин.
- Пелле клетки центрифугации при 400 х г при 2-8 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Аспирировать супернатанты.
- Восстановите ячейки в 200 злителе буфера асссе.
- Держите клетки на льду и приступить к анализу FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки DC-CYP-ALDH выразили значительное увеличение количества 1"-гидроксилаза. Чтобы определить, были ли клетки DC-CYP-ALDH, генерируемые из BMDCs, значительно увеличенным количеством 1"-гидроксилаза, БМДК были трансдуцированы с помощью вируса ленти-CYP-ALDH для производства клеток DC-CYP-ALDH с костным мозгом (клетки BMDC-CYP-ALDH). Впоследствии, клетки BMDC-CYP-ALDH были исследованы на выражение 1"-гидроксилаза FACS. Наши данные показали, что клетки BMDC-CYP-ALDH, по сравнению с родительскими BMDc, отображаются расширенное выражение 1 "гидроксилаза (Рисунок 1А). Мы также определили ферментативную активность 1"-гидроксилазы в клетках BMDC-CYP-ALDH. Для этого в 12 колодцев были добавлены 1,0 х 106 BMDC-CYP-ALDH в 2 мл среды клеточной культуры CM-10-R. 25(OH)D затем был добавлен в клеточную культуру при окончательной концентрации 2,5 мкм. Клетки были культивированы при температуре 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 на 24 ч, а супернатанты были собраны для измерения 1,25 (OH)2D с помощью радиоиммуноассии (РИА). Наши данные показали, что 1,25 (OH)2D концентрации в культуре supernatants из BMDC-CYP клеток (BMDCs трансиндуированных с ленти-CYP-GFP вирус) и BMDC-CYP-ALDH клетки были примерно в 20раз выше,чем у родителей BMDCs и BMDC-ALDH клеток (BMDc-ALDH).
Клетки DC-CYP-ALDH выразили значительное увеличение количества RALDH2. Чтобы определить, были ли клетки BMDC-CYP-ALDH значительно увеличенным количеством RALDH2, субстрат RALDH2 был добавлен в клеточные культуры в присутствии или отсутствии ингибитора RALDH2 диэтиламинобензолальдегида (DEAB) (15 мкм). Флуоресцентный продукт, сохраненный внутри клеток, был проанализирован FACS. Наши данные показали, что средняя интенсивность флуоресценции (МФО) клеток BMDC-CYP-ALDH была примерно в 6 раз выше, чем у родительских БМДК, что свидетельствует о том, что клетки BMDC-CYP-ALDH, по сравнению с родительскими БМДК, выразили значительно повышенную ферментативную активность RALDH2(рисунок 2A,B).
Клетки DC-CYP-ALDH увеличили индукцию foxp3иCCR9и кишки-homing Treg клетки in vitro. Чтобы исследовать ли DC-CYP-ALDH клетки смогли увеличить индукцию кишечника самонаведения Treg клеток в пробирке, мы transduced DC2.4 клеток (костного мозга полученных DC линии26,27,28,29), с ленти-CYP-ALDH вируса и генерируется DC2.4-CYP-ALDH клеток. Впоследствии мы определили, удалось ли клеткам DC2.4-CYP-ALDH увеличить индукцию клеток Treg в пробирке. Соответственно, наивные CD4и Т-клетки были очищены от мышей C57BL/6. Очищенные наивные КЛЕТКи CD4и Т на 5 х 105 клетках/колодце были затем сфабрикованы либо с родительскими клетками DC2.4 (1 x 105 клетки/хорошо) или клетками DC2.4-CYP-ALDH (1 x 1 05 клеток/хорошо) в 24 хорошо культурных пластин в сыворотке свободной среде в присутствии анти-CD3 моноклональных антител (5 мкг/мл) и рекомбинантных человека IL-2 (50 U/mL). Кроме того, в культуры были добавлены 25(OH)D и ретинол в различных концентрациях. Клетки были инкубированы при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Пять дней спустя, клетки были проанализированы FACS для выражения foxp3 и c-c хемокин рецептор типа 9 (CCR9). Наши данные показали, что в присутствии субстратов, DC2.4 клетки не существенно изменить обилие foxp3иCCR9- клетки в CD4и Т-клеток населения (Рисунок 3A,B). В отличие от этого, клетки DC2.4-CYP-ALDH значительно усилили обилиеклеток foxp3иCCR9 среди клеток CD4и Т. Кроме того, чем больше 25(OH)D добавил, тем больше способность DC2.4-CYP-ALDH клеток, чтобы увеличить обилие foxp3иCCR9- клетки среди CD4и Т-клеток. Таким образом, наши данные подтверждают, что dc-CYP-ALDH клетки могут увеличить индукцию кишечника самонаведения Treg клеток in vitro.
Клетки DC-CYP-ALDH увеличили индукцию foxp3иCCR9и клеток Treg в инвиво. Чтобы определить, может ли клетки DC-CYP-ALDH увеличить индукцию клеток Treg в инреге, мы интраперитонеально вводили одну из следующих клеток в мышей Balb/c: родительские клетки DC2.4, клетки DC2.4-CYP (клетки DC2.4, трансцируемые с нилли-CYP-GFP вирусом), и DC-2.4-CY-CY-. Через четыре дня после введения клеток, мезентерические лимфатические узлы были обследованы FACS(Рисунок 4A). Наши данные показали, что клетки DC2.4-CYP-ALDH, по сравнению с элементами управления, значительно увеличили обилие foxp3иCCR9- клеток среди клеток CD3и Т(Рисунок 4B,C). Основываясь на этих результатах, мы пришли к выводу, что DC-CYP-ALDH клеточной администрации значительно увеличивает индукцию foxp3иCCR9и Т-клеток в периферических лимфоидных тканях.
Рисунок 1: DC-CYP-ALDH клетки выразили значительно увеличилось количество 1 "гидроксилаза. (A) КЛЕТКи BMDC-CYP-ALDH были созданы и проанализированы FACS. Представитель FACS сюжет показывает выражение 1 "гидроксилаза в родительских BMDCs и BMDC-CYP-ALDH клеток (приложенные на живых клетках). (B) 1 "гидроксилаза субстрат (т.е., 25 (OH)D) был добавлен в dc культур. 24 ч спустя, супернатанты были собраны и 1,25 (OH)2D концентрации были измерены. Данные показывают концентрацию 1,25 (OH)2D в культурах родительских BMDCs, клетки BMDC-CYP, клетки BMDC-ALDH, и клетки BMDC-CYP-ALDH. Злт; 0,01. Тест ANOVA. n No 4. Эта цифра адаптирована из Сюй и др.6. Авторское право 2019. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: DC-CYP-ALDH клетки выразили значительно увеличенное количество RALDH2. (A) Клетки BMDC-CYP-ALDH были созданы и проанализированы, как описано в протоколе. Представитель наложенных FACS участков показать BODIPY аминоацета флуоресценции в BMDCs и BMDC-CYP-ALDH клеток в присутствии (ДЕАБ) или отсутствие (-DEAB) из ингибитора RALHD2 диэтиламинобензальдегид (DEAB). (B) Средняя интенсивность флуоресценции (МФИ) аминоацета BODIPY в BMDCs и клетках BMDC-CYP-ALDH при отсутствии DEAB. Злт; 0,05; t-тест; n No 4. Эта цифра адаптирована из Сюй и др.6. Авторское право 2019. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: DC-CYP-ALDH клетки увеличили индукцию foxp3иCCR9- кишки-homing Treg клеток в пробирке. (A) CD4и наивные Т-клетки были изолированы от селезенки c57BL/6 мыши. Затем cd4и T-клетки были активированы в культурах анти-CD3 mAb (5 мкг/мл) в присутствии либо родительских клеток DC2.4, либо клеток DC2.4-CYP-ALDH. Кроме того, культуры были добавлены с указанными концентрациями 25 (OH)D и ретинол. Пять дней спустя, клетки были собраны и проанализированы FACS для выражения foxp3 и CCR9 в CD3иCD4и T-клеточной популяции. Представитель FACS участки показывают выражения foxp3 и CCR9 в CD3иCD4и Т-клеток населения. (B) Совокупные данные от (A). Злт; 0,05; Тест ANOVA; n No 4. Эта цифра адаптирована из Сюй и др.6. Авторское право 2019. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: DC-CYP-ALDH клетки увеличили индукцию foxp3иCCR9и кишки-homing Treg клеток in vivo. (A) Balb/c мышей интраперитонально (i.p.) получил один из следующих передач DC (Передача): нет передачи DC (Нет передачи), родительские клетки DC2.4, DC2.4-CYP клетки, и DC2.4-CYP-ALDH клеток. Четыре дня спустя, мезентерические лимфатические узлы (MLNs) были проанализированы FACS. (B) Представитель FACS участки показывают выражения foxp3 и CCR9 в CD3и Т-клеток населения. (C) Совокупные данные из (B) показывают процент foxp3иCCR9- клетки в CD3и Т-клеток населения. Клетки были закрыты на CD3и Т-клетки для всех анализов. В тех случаях, когда это применимо, представленные данные являются средствами- изумитом- Тест ANOVA; n 4-6. Эта цифра адаптирована из Сюй и др.6. Авторское право 2019. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы описываем использование dc-CYP-ALDH клеток, для увеличения индукции кишки homing Treg клеток в периферических лимфоидных тканей. Наши данные показали, что клетки DC-CYP-ALDH могут синтезировать локально высокие концентрации de novo как 1,25(OH)2D и RA in vitro в присутствии соответствующих субстратов (т.е. 25-ОГЗД и ретинола, соответственно). Потому что достаточная концентрация крови 25(OH)D и ретинол может быть легко достигнуто с помощью витамина D и добавок, соответственно, у пациентов, которые имеют недостатки30,31, мы считаем, что DC-CYP-ALDH клетки могут увеличить индукцию кишечника homing Treg клеток в периферических лимфоидных тканей, когда нормальная концентрация крови 25 (OH)D и ret. Для поддержки этих рассуждений, наши данные показывают, что в нормальных здоровых животных, которые не имеют витамина D и витамина А недостатки, DC-CYP-ALDH клетки увеличить индукции Treg клеток, которые выражают как регулирующие молекулы (нат.е., foxp3 и IL-10) и рецептор омнахия (т.е., CCR9). Таким образом, эта технология может быть использована для дальнейшего исследования кишки самонаведения Treg клеток для лечения IBD.
Одним из важнейших этапов этого протокола является производство вируса lenti-CYP-ALDH с высокими титрами. Предпочтительные вирусные титры должны быть 108-109 TUs/mL. Высокий титр вируса lenti-CYP-ALDH необходим для высокой эффективности трансдукции в DC.
Другим важным шагом этого протокола является эффективность трансдукции в DC. Поскольку dc-CYP-ALDH клетки не терпят в пробирке в этой технологии, важно, чтобы скорость трансдукции быть более чем на 90%, чтобы гарантировать, что DC-CYP-ALDH клетки могут эффективно увеличить индукцию кишки самонаведения Treg клеток in vivo. Кроме того, DC-CYP-ALDH клетки могут быть дополнительно очищены FACS до in vivo администрации32.
Уникальным преимуществом этого протокола является то, что dc-CYP-ALDH клетки не должны быть терпимы в пробирке до введения in vivo. Ожидается, что DC-CYP-ALDH клетки, в результате комбинированных действий 1,25 (OH)2D и РА, будет поддерживаться в толерогенном статусе in vivo, потому что оба 1,25 (OH)2D и РА было показано, чтобы толерантность DCs33,34. Таким образом, мы ожидаем, что DC-CYP-ALDH клетки не будут иметь нестабильности проблем в in vivo провоспалительных среде.
В настоящее время мы только показали, что DC-CYP-ALDH клетки могут увеличить частоту (число) кишечника hom-homing Treg клеток в периферических лимфоидных тканей и кишечника6. Следовательно, регулятивная функция в кишечнике в целом усиливается, потому что процент клеток Treg в кишечнике увеличивается. Рисунок 4 показывает, что по сравнению с теми, с контролем лечения, интраперитонеальное лечение с DC-CYP-ALDH клеток значительно увеличили процент CCR9иfoxp3и Treg клеток в мезентериальных лимфатических узлов, а это означает, что больше Treg клетки в мезентерических лимфатических узлов способны специально домой в кишечные ткани. На рисунке 4 далее показано, что большинство foxp3и Т-клеток в мезентерическом лимфатических узлах являются отрицательными для CCR9 и, следовательно, не имеют потенциала для самонаведения кишечника. Однако, могут ли клетки DC-CYP-ALDH также повысить регулирующую функцию каждой клетки Treg как таковой (например, повышенные уровни экспрессии foxp3 и/или IL-10) требует дальнейшего изучения.
Реагенты и материалы, описанные здесь, только для исследований на животных. Тем не менее, протокол применим для исследований человека с использованием соответствующих человеческих реагентов и материалов, за исключением того, что DC будут генерироваться из периферических моноцитов крови у людей. Конечной целью этого протокола является генерация клеток клинического класса DC-CYP-ALDH для лечения IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Д-р Xiaolei Тан и Дэвид J. Baylink являются изобретателями в ожидании патента, связанного с этим исследованием.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Управлением помощника министра обороны по вопросам здравоохранения в рамках программы медицинских исследований Peer Reviewed в соответствии с премией No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Мнения, толкования, выводы и рекомендации являются мнениями автора и не обязательно одобрены министерством обороны. Эта работа также была частично поддержана научно-исследовательскими инновационными грантами от Кафедры Медицины Университета Лома Линда (681207-2967 (XT и GG), 681205-2967 «XT» и 325491 «DJB»).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
