Summary
Hier presenteren we een protocol voor in vivo vergroting van gut-homing regulatoire T Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen om lokaal hoge concentraties van de actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2d) en de actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA) de Novo te produceren.
Abstract
Inflammatoire darmziekte (IBD) is een inflammatoire chronische ziekte in het maagdarmkanaal (DARM). In de Verenigde Staten zijn er ongeveer 1.400.000 IBD patiënten. Het is algemeen aanvaard dat een disgereguleerde immuunrespons op darmbacteriën de ziekte initieert en de mucosale epitheliale barrière verstoort. We hebben onlangs laten zien dat gut-homing Regulatory T (Treg) cellen een veelbelovende therapie voor IBD zijn. Dienovereenkomstig, dit artikel presenteert een protocol voor in vivo augmentatie van gut-homing Treg Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen voor de productie van lokaal hoge concentraties van twee moleculen de Novo, actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2D) en actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA). We kozen voor 1,25 (OH)2d en RA op basis van eerdere bevindingen waaruit blijkt dat 1,25 (Oh)2D de expressie van regelgevende moleculen kan induceren (bijv. Forkhead Box P3 en interleukine-10) en dat Ra de expressie van gut-homing-receptoren in T-cellen kan stimuleren. Om dergelijke engineered dendritische cellen te genereren, gebruiken we een lentivirale vector om dendritische cellen te doorgeven om twee genen te overdrukken. Een gen is de cytochroom P450 familie 27 subfamilie B lid 1 die codeert 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase, die fysiologisch katalyseert de synthese van 1,25 (OH)2D. Het andere gen is de aldehyde dehydrogenase 1 familie lid a2 die codeert voor retinaldehyde dehydrogenase 2, die fysiologisch de synthese van RA katalyseert. Dit protocol kan worden gebruikt voor toekomstig onderzoek naar gut-homing Treg cellen in vivo.
Introduction
Inflammatoire darmziekte (IBD) is een inflammatoire chronische ziekte in het maagdarmkanaal (DARM). In de Verenigde Staten zijn er ongeveer 1.400.000 IBD patiënten. Het is algemeen aanvaard dat een disgereguleerde immuunrespons op darmbacteriën de ziekte initieert en de mucosale epitheliale barrière1,2verstoort. Om deze reden, momenteel beschikbare U.S. Food and Drug Administration (FDA)-goedgekeurde drugs remmen de functies van inflammatoire mediatoren of blokkeren het homing van immune cellen in de darm. Echter, de ontstekingsmediatoren en immuuncellen die gericht zijn zijn ook nodig voor immuun afweer. Dientengevolge, de inflammatoire mediator remmers compromitteren systemische immuun verdediging en de immuuncel homing blokkers verzwakken gut immuun verdediging, die beide kunnen leiden tot ernstige gevolgen3,4. Bovendien, de immuuncel homing blokkers kunnen ook blokkeren het homing van regelgevende T (Treg) cellen in de darm en dus kan verergeren de reeds gecompromitteerde gut immuun tolerantie bij IBD patiënten. Bovendien, blokkeren van Treg cel homing in de darm kan ook leiden tot systemische immuunsuppressie als gevolg van de accumulatie van Treg cellen in het bloed5. Tot slot, remmers en blokkers functioneren tijdelijk en, daardoor, vereisen frequente toedieningen. Frequente toediening van deze remmers en blokkers kan verder verergeren de ongewenste neveneffecten.
Onlangs, we hebben voorgesteld een nieuwe strategie die potentieel kan verzachten of zelfs elimineren van de bijwerkingen geassocieerd met de huidige drugs voor IBD behandeling6. Deze strategie vergroot de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels6. De logica van deze strategie is dat gut-homing Treg cellen specifiek de thuisbasis van de darm en dus zal niet in gevaar brengen systemische immuun afweer. Bovendien, aangezien Treg cellen potentieel geheugen kunnen vormen7,8, gut-homing Treg cellen kunnen mogelijk zorgen voor een stabiele controle van de chronische darmontsteking bij IBD patiënten en, daardoor, de behandeling moet niet zo frequent worden toegediend. Bovendien, aangezien deze strategie de inductie van gut-homing Treg cellen in vivo vergroot, heeft het niet de zorg van in vivo instabiliteit in een zeer proinflammatoire omgeving die gepaard gaat met adoptie overdracht van in vitro gegenereerde Treg cellen9,10. In dit verband, in vitro gegenereerde Treg cellen zijn een van de voorgestelde strategieën voor de behandeling van auto-immuunziekten11,12,13 en transplantatie afstoting14,15. Tot slot, in deze strategie, dendritische cellen (DCs) zijn ontworpen om lokaal hoge concentraties van twee moleculen de Novo te produceren: actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2D) en actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA). We kozen voor 1,25 (Oh)2d en RA omdat 1,25 (Oh)2d de expressie van regelgevende moleculen kan induceren (bijv. Forkhead Box P3 [foxp3] en interleukine-10 [Il-10])16,17 en dat Ra de expressie van gut-homing-receptoren in T-cellen kan stimuleren18. Omdat zowel 1,25 (Oh)2D en RA ook de DCS28,29kunnen vertolderen, reden we dat de engineered DCS in vivo in een tolerogene toestand zal worden gehandhaafd en daarmee de in vivo instabiliteit problemen die geassocieerd zijn met in vitro gegenereerde tolerogene dc's (toldc's)19,20,21te omzeilen. In dit opzicht zijn toldc's ook een van de voorgestelde strategieën voor in vivo vergroting van de Treg-celfuncties19,20,21. Ter ondersteuning van onze redenering, hebben we aangetoond dat de engineered DCs, bij in vivo levering, kan de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels te vergroten6.
Een bijkomend voordeel van onze voorgestelde strategie is dat 1,25 (OH)2D ook andere functies heeft die mogelijk ten goede komen aan IBD-patiënten. Deze andere functies omvatten het vermogen van 1,25 (OH)2D om de secretie van antimicrobiële geneesmiddelen22 te stimuleren en carcinogenese23te onderdrukken. Infecties en kankers worden vaak geassocieerd met IBD24,25.
Om de DCs te genereren die lokaal hoge concentraties van zowel 1,25 (OH)2D en Ra de Novo kan produceren, gebruiken we een lentivirale vector om DCS te overdrukken om twee genen over te brengen. Een gen is de cytochroom P450 familie 27 subfamilie B lid 1 (CYP27B1) die codeert 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase (1α-hydroxylase), die fysiologisch katalyseert de synthese van 1,25 (OH)2D. Het andere gen is de aldehyde-dehydrogenase 1-familielid a2 (ALDH1a2) die de retinaldehyde dehydrogenase 2 (RALDH2) codeert, wat de synthese van RA6fysiologisch katalyseert.
Omdat in vivo augmentatie van gut-homing Treg Cell inductie is mogelijk belangrijk bij de behandeling van IBD, in het volgende protocol zullen we de procedures voor het genereren van de 1α-hydroxylase-RALDH2-overuitdrukken DCs (DC-CYP-ALDH cellen) die kan gebruikt worden voor het toekomstig onderzoek van de Treg cellen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo dierenstudie protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Loma Linda University institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC), evenals het Bureau voor Dierverzorging en-gebruik (ACURO) van de US Army Medical Research and materiel Command (USAMRMC) van de Ministerie van defensie.
1. bereiding van het lentivirus dat zowel 1α-hydroxylase als RALDH2 (Lenti-CYP-ALDH virus) uitdrukt
- Dag 0: bereid in de vroege ochtend 5 x 105 cellen/ml 293t cellen in het cm-10-D celkweekmedium voor.
- Zaad 20 mL/plaat in 150 mm x 25 mm cultuur gerechten. Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 h. confluency zal ~ 80 – 90% bereiken na 24 uur.
- Dag 1: Maak 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl en 1,5 mM na2HPO4, pH 7,1). Aliquot en bewaren bij-20 °C.
- Maak 2 M CaCl2 en bewaar deze bij kamertemperatuur.
- Voor elke 150 mm x 25 mm kweek schaal bereidt u een DNA-precipitatie mengsel voor in een steriele 50 mL kweek buis. Voeg eerst 1.620 μL van 2x HBS, 9,5 μg PMD2G (VSVG), 17,5 μg pCMVR 8.74 (Capsid), 27 μg Lenti-CYP-ALDH plasmide (een linviraal vector dat zowel CYP27B1 als ALDH1a2 draagt). Voeg vervolgens H2O toe aan een eindvolume van 3.037,5 μL.
- Voeg in de laatste 202,5 μL 2 M CACL2 druppelsgewijs toe tijdens het mengen van de oplossing tot de eindconcentraties van 1x HBS en 125 mm CACL2. CaCl2 moet de laatste zijn die moet worden toegevoegd. Laat de transfectie mengsels bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten met occasioneel mengen. Voor meerdere 150 mm x 25 mm cultuur gerechten, opschalen dienovereenkomstig.
- Voeg de 3.240 μL DNA precipitatie mengsel druppelsgewijs toe aan 1 150 mm x 25 mm kweek schotel met de 293t cellen. Zwenk de cultuur schaal voorzichtig met de zijkant terwijl het DNA-precipitatie mengsel wordt toegevoegd. Incuberen de schaal bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur.
- Dag 2: Verwijder de calciumfosfaat transfectie oplossing, was zachtjes met 1x PBS en voer de celkweek opnieuw uit met het CM-4-D celkweekmedium. Inincuberen de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur.
- Dag 3: oogst de supernatanten in steriele opslag flessen en bewaar bij 4 – 8 °c. Vul de celcultuur aan met het verse CM-4-D celkweekmedium. Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor nog eens 24 uur.
- Dag 4: oogst de supernatanten in steriele opslag flessen. Filtreer de supernatanten van dag 3 en dag 4 door een filter van 0,45 μm. Om het vsvg pseudo type virus te concentreren, breng de supernatanten over in centrifugebuizen en spin op 4.780 x g gedurende 24 uur bij 4 °c.
- Dag 5: giet de supernatanten van de pellets (de pellet is vaak zichtbaar) en laat de buisjes gedurende enkele minuten op een papieren handdoek in een steriele bioveiligheids kast lekken.
- Respendeer de pellets door pipetteren met steriele PBS met 5% glycerol. Het volume voor resuspensie is 33,3 μL per 150 mm x 25 mm kweek schaal.
- Aliquot 200 μL/buis en bewaren bij-80 °C. Maak een apart aliquot van 50 μL/injectieflacon voor titratie doeleinden. Titers moeten binnen het bereik van 108– 109 Transducing units (TUs)/ml.
- Voeg Bleach toe aan de cultuur gerechten en gooi ze weg.
Opmerking: deze getransfunteerde cellen zijn de grootste veiligheidszorg in het Protocol, omdat alle linvirale elementen in de cellen worden uitgedrukt.
2. generatie van in het beenmerg afgeleide DCs (Bmdc's)
- Oogst scheen en dijbeen van 4 – 5 Balb/c muizen in een steriele polypropyleen buis van 50 ml met het kweekmedium6.
- Breng de scheen en dijbeen over in een kweek schaal van 100 mm x 20 mm die het kweekmedium bevat. Verwijder weefsels zoals spieren uit de scheen en dijbeen met behulp van ontleden schaar en Tang.
- Snijd beide uiteinden van de scheen en dijbeen om de beenmerg holte bloot.
- Trek 10 mL kweekmedium in een injectiespuit van 10 mL die aan een naald van 30 G is bevestigd.
- Steek de naald voorzichtig in de beenmerg Holte en spoel het beenmerg in een schone 50 mL steriele polypropyleen buis. Herhaal deze procedure indien nodig om ervoor te zorgen dat het beenmerg volledig is uitgespoeld.
- Pellet de beenmergcellen door centrifugeren (400 x g) bij 2 – 8 °c gedurende 5 min. aspireren de supernatant.
- Respendeer de pellet met 5 mL 1x rode bloedcel lysisbuffer.
- Incuberen de cellen bij kamertemperatuur gedurende 4 – 5 minuten met occasioneel schudden.
- Stop de reactie door 30 mL kweekmedium toe te voegen.
- Pellet de cellen door centrifugeren (400 x g) bij 2 – 8 °c gedurende 5 min. respendeer de cellen in 10 ml cm-10-R celkweekmedium. Indien nodig kunnen de cellen worden doorgegeven via een 40 μm celzeef om vuil te verwijderen.
- Voer een celtelling uit en pas de cellen aan op 1 x 106 cellen/ml met behulp van het celkweekmedium van cm-10-R.
- Voeg recombinant Murine granulocyt/macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF, uiteindelijke concentratie = 100 U/mL) en Murine Interleukine-4 (IL-4, uiteindelijke concentratie = 10 U/mL).
Opmerking: de stockoplossingen van GM-CSF en IL-4 worden opgeslagen bij-80 °C bij respectievelijk 100.000 U/mL (1.000 x) en 10.000 U/mL (1.000 x). - Verdeel de cellen in 6 goed cultuur platen op 4 mL/goed en kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 48 h.
- Verwijder niet-aanhangende cellen met zachte Pipetteer.
- Voeg een vers CM-10-R celkweekmedium toe dat de GM-CSF (100 U/mL) en IL-4 (10 U/mL) bevat. Kweek de cellen voor een ander 48 h.
- Oogst niet-aanhandige cellen (Bmdc's) voor transductie door het Lenti-CYP-ALDH-virus.
3. transductie van DCs met Lenti-CYP-ALDH-virus om DC-CYP-ALDH-cellen te genereren
- Bereid 1 x 106 DCS/goed voor in een totaal volume van 0,5 ml cm-10-R celkweekmedium met 50 μL virus en 8 μg/ml protamine in een 6-kweek plaat.
- Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur.
- Vervang het medium met het verse CM-10-R celkweekmedium en kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor nog eens 24 uur. Op dit moment kunnen de enzymatische activiteiten van 1α-hydroxylase en RALDH2 worden geëvalueerd (zie stap 4). Herhaal indien nodig de stappen 3.1 – 3.3 voor een tweede transductie.
- Toevoegen lipopolysaccharide (100 ng/mL) en cultuur van de cellen voor 24 h.
- Oogst de cellen (DC-CYP-ALDH-cellen) voor experimenten.
4. evaluatie van de overgebrachte 1α-hydroxylase en RALDH2 in DC-CYP-ALDH-cellen
- Evaluatie van de overgebrachte 1α-hydroxylase in DC-CYP-ALDH-cellen
- Zaad 1,0 x 106 DC-CYP-aldh cellen/goed in 2 ml cm-10-R cel cultuurmedium in 12 goed cultuur platen.
- Voeg 25 (OH) D toe aan de eindconcentratie van 2,5 μM. Incuberen de DC-CYP-ALDH-cellen gedurende 24 uur.
- Oogst de supernatanten en bewaar bij-20 °c.
- Test voor 1,25 (Oh)2D concentraties in de supernatanten met behulp van een in de handel verkrijgbare radioimmunoassay (RIA) (Zie tabel met materialen).
- Bepaal de expressie van 1α-hydroxylase in DC-CYP-ALDH-cellen door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met behulp van een anti-CYP27B1 antilichaam.
- Evaluatie van de overgeuite RALDH2 in DC-CYP-ALDH-cellen
Opmerking: de expressie en activiteit van de overgebrachte RALDH2 worden bepaald met behulp van een commerciële aldehyde dehydrogenase (ALDH)-detectiekit (Zie tabel met materialen).- Zaai 1 mL DC-CYP-ALDH-of controle cellen (1 x 105 cellen/ml in de test buffer) in elk van de twee buisjes van 5 ml (één gelabeld als "controle" en het andere gelabeld als "test").
- Voeg 10 μL diëthylaminobenzaldehyde (DEAB) oplossing (1,5 mM in 95% ethanol) toe aan elk van de regel buizen en meng onmiddellijk. DEAB is een RALDH2 remmer.
- Voeg 5 μL geactiveerd RALDH fluorescentie substraat (300 μM) toe aan de besturings-en reageerbuisjes en meng onmiddellijk.
- Inincuberen van de buizen voor 45 min.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 400 x g bij 2 – 8 °c gedurende 5 min. aspireren de supernatants.
- Reconstitueer de cellen in 200 μL test buffer.
- Houd de cellen op ijs en ga voor analyse door FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DC-CYP-ALDH cellen uitgedrukt significant toegenomen hoeveelheid 1α-hydroxylase. Om te bepalen of DC-CYP-ALDH-cellen die zijn gegenereerd uit Bmdc's een significant toegenomen hoeveelheid van 1α-hydroxylase uitmaakten, werden Bmdc's met het Lenti-CYP-ALDH-virus in de met beenmerg afkomstige DC-CYP-ALDH-cellen (BMDC-CYP-ALDH-cellen). Vervolgens werden de BMDC-CYP-ALDH-cellen onderzocht op de uitdrukking van 1α-hydroxylase door FACS. Uit onze gegevens bleek dat de cellen van het BMDC-CYP-ALDH in vergelijking met de ouderlijke Bmdc's een verbeterde uitdrukking van de 1α-hydroxylase vertoonden (Figuur 1A). We bepaalden ook de enzymatische activiteit van de 1α-hydroxylase in de BMDC-CYP-ALDH-cellen. Om dit te doen, werden 1,0 x 106 BMDC-CYP-aldh cellen in 2 ml cm-10-R celkweekmedium toegevoegd in 12 put cultuur platen. 25 (OH) D werd vervolgens toegevoegd aan de celkweek bij de eindconcentratie van 2,5 μM. De cellen werden gekweekt bij 37 °c en 5% Co2 voor 24 uur en de supernatanten werden geoogst voor de meting van 1,25 (Oh)2D met behulp van een radioimmunoassay (RIA). Uit onze gegevens bleek dat 1,25 (Oh)2D concentraties in de kweek supernatanten van de bmdc-CYP cellen (bmdcs getransduceerde met Lenti-CYP-GFP-virus) en het bmdc-CYP-aldh-cellen waren elk ongeveer 20x hoger dan die van de ouderlijke bmdc's en de bmdc-aldh-cellen (bmdc's die met het Lenti-aldh-virus werden getransducteerd) (Figuur 1B).
DC-CYP-ALDH cellen uitgedrukt significant toegenomen hoeveelheid RALDH2. Om te bepalen of de cellen van BMDC-CYP-ALDH een significant toegenomen hoeveelheid RALDH2, werd een RALDH2 substraat toegevoegd aan de celculturen in de aanwezigheid of afwezigheid van de RALDH2 remmer diethylaminobenzaldehyde (DEAB) (15 μM). Het fluorescerende product dat in de cellen werd bewaard, werd geanalyseerd door FACS. Uit onze gegevens bleek dat de gemiddelde fluorescentie intensiteiten (Mfi's) van de BMDC-CYP-ALDH-cellen ongeveer 6x hoger waren dan die van de ouderlijke Bmdc's, wat suggereert dat de cellen van het BMDC-CYP-ALDH in vergelijking met de ouder Bmdc's significant verbeterde RALDH2 enzymatische activiteit (Figuur 2A,B).
DC-CYP-ALDH cellen verhoogde de inductie van foxp3+CCR9+ gut-homing Treg cellen in vitro. Om te onderzoeken of DC-CYP-aldh cellen in staat waren om de inductie van gut-homing Treg cellen in vitro te vergroten, we transduceerden DC 2.4 cellen (een beenmerg-afgeleide DC-lijn26,27,28,29), met Lenti-CYP-aldh virus en gegenereerde DC 2.4-CYP-aldh cellen. Vervolgens bepaalden we of de DC 2.4-CYP-ALDH cellen in vitro de inductie van gut-homing Treg cellen konden vergroten. Dienovereenkomstig werden naïeve CD4+ T-cellen gezuiverd van C57BL/6 muizen. Gezuiverde naïeve CD4+ T-cellen bij 5 x 105 -cellen/goed werden vervolgens gecocultureerd met ofwel de ouder DC 2.4-cellen (1 x 105 cellen/goed) of de DC 2.4-CYP-aldh-cellen (1 x 105 cellen/goed) in 24 goed cultuur platen in een serumvrij medium in aanwezigheid van een anti-CD3 monoklonaal antilichaam (5 μg/ml) en recombinant humane Il-2 (50 U/ml). Daarnaast werden ook 25 (OH) D en retinol in verschillende concentraties toegevoegd aan de culturen. De cellen werden geïnineerd bij 37 °C en 5% CO2. Vijf dagen later werden de cellen geanalyseerd door FACS voor de uitdrukkingen van foxp3 en c-c Chemokine receptor type 9 (CCR9). Uit onze gegevens bleek dat de DC 2.4-cellen in aanwezigheid van de substraten de overvloed van foxp3+CCR9+ cellen in de CD4+ T-celpopulaties niet significant wijzigde (Figuur 3A, B). In tegenstelling, de DC 2.4-CYP-ALDH cellen aanzienlijk verbeterd de overvloed van foxp3+CCR9+ cellen tussen CD4+ T-cellen. Bovendien, hoe meer 25 (OH) D toegevoegd, hoe groter het vermogen van de DC 2.4-CYP-ALDH cellen om de overvloed van foxp3+CCR9+ cellen tussen CD4+ T-cellen te verhogen. Daarom ondersteunen onze gegevens dat de DC-CYP-ALDH-cellen de inductie van darm-homing-Treg cellen in vitro kunnen vergroten.
DC-CYP-ALDH cellen verhoogde de inductie van foxp3+CCR9+ gut-homing Treg cellen in vivo. Om te bepalen of DC-CYP-aldh-cellen de inductie van de Treg-cellen van gut-homing in vivo kunnen vergroten, we intraperitoneaal toegediend een van de volgende cellen in Balb/c muizen: de ouderlijke DC 2.4 cellen, de DC 2.4-CYP cellen (DC 2.4 cellen getransduceerde met Lenti-CYP-GFP virus), en de DC-2,4-CYP-aldh cellen. Vier dagen na de celtoediening werden mesenterische lymfeklieren onderzocht door FACS (Figuur 4A). Onze gegevens toonden aan dat de DC 2.4-CYP-ALDH-cellen, in vergelijking met de besturingselementen, de overvloed van foxp3+CCR9+ cellen aanzienlijk hebben verhoogd tussen CD3+ T-cellen (Figuur 4B, C). Op basis van deze resultaten concluderen we dat de DC-CYP-ALDH celadministratie de inductie van foxp3+CCR9+ T cellen in perifere lymfoïde weefsels aanzienlijk vergroot.
Figuur 1: DC-CYP-ALDH cellen uitgedrukt significant toegenomen hoeveelheid 1α-hydroxylase. (A) de cellen van BMDC-CYP-aldh werden gegenereerd en geanalyseerd door FACS. Een representatieve FACS plot toont de uitdrukking van 1α-hydroxylase in de ouderlijke Bmdc's en de BMDC-CYP-ALDH cellen (gated op levende cellen). (B) 1α-hydroxylase-substraat (d.w.z. 25 (Oh) D) is toegevoegd aan de DC-culturen. 24 uur later werden de supernatanten verzameld en werden 1,25 (Oh)2D-concentraties gemeten. De gegevens tonen concentraties van 1,25 (OH)2D in de culturen van de Ouderbmdc's, de BMDC-CYP-cellen, de BMDC-aldh-cellen en de BMDC-CYP-aldh-cellen. * * p < 0,01. ANOVA-test. n = 4. Dit cijfer is aangepast van Xu et al.6. Copyright 2019. De Amerikaanse vereniging van Immunologist, Inc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: DC-CYP-ALDH cellen uitgedrukt significant toegenomen hoeveelheid RALDH2. (A) de cellen van BMDC-CYP-aldh zijn gegenereerd en geanalyseerd zoals beschreven in het protocol. Representatieve overgelegde FACS plots tonen het BODIPY aminoacetaat fluorescentie in de Bmdc's en de BMDC-CYP-ALDH cellen in aanwezigheid (+ DEAB) of afwezigheid (-DEAB) van de RALHD2 remmer diëthylaminobenzaldehyde (DEAB). B) de gemiddelde fluorescentie intensiteiten (mfi's) van het bodipy-aminoacetaat in de bmdc's en de BMDC-CYP-aldh-cellen bij afwezigheid van deab. * p < 0,05; t-toets; n = 4. Dit cijfer is aangepast van Xu et al.6. Copyright 2019. De Amerikaanse vereniging van Immunologist, Inc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: DC-CYP-ALDH-cellen verhoogde de inductie van foxp3+CCR9+ gut-homing Treg cellen in vitro. (A) CD4+ -naïeve T-cellen werden geïsoleerd van C57BL/6-muis milt. De CD4+ T-cellen werden vervolgens in culturen geactiveerd door een anti-CD3 MAB (5 μg/ml) in aanwezigheid van de ouder DC 2.4-cellen of de DC 2.4-CYP-aldh-cellen. Daarnaast werden de culturen toegevoegd met de aangegeven concentraties van 25 (OH) D en retinol. Vijf dagen later werden de cellen verzameld en geanalyseerd door FACS voor de uitdrukkingen van foxp3 en CCR9 in CD3+CD4+ T celpopulatie. Representatieve FACS plots tonen de uitdrukkingen van foxp3 en CCR9 in de CD3+CD4+ T celpopulaties. B) cumulatieve gegevens van (a). * p < 0,05; ANOVA-test; n = 4. Dit cijfer is aangepast van Xu et al.6. Copyright 2019. De Amerikaanse vereniging van Immunologist, Inc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: DC-CYP-ALDH-cellen verhoogde de inductie van foxp3+CCR9+ gut-homing Treg cellen in vivo. A) Balb/c-muizen intraperitoneaal (i.p.) ontving een van de volgende DC-overdrachten (overdracht): geen DC-overdracht (geen overdracht), ouderlijke DC 2.4-cellen, DC 2.4-CYP-cellen en DC 2.4-CYP-aldh-cellen. Vier dagen later werden mesenterische lymfeklieren (Mln's) geanalyseerd door FACS. B) representatieve FACS plots tonen de uitdrukkingen van FOXP3 en CCR9 in CD3+ T celpopulatie. C) cumulatieve gegevens van (B) tonen het percentage van foxp3+CCR9+ cellen in de CD3+ T celpopulatie. Cellen werden voor alle analyses op CD3+ T-cellen gegated. In voorkomend geval zijn de gepresenteerde gegevens gemiddelden ± SEM. * p < 0,05; ANOVA-test; n = 4 – 6. Dit cijfer is aangepast van Xu et al.6. Copyright 2019. De Amerikaanse vereniging van Immunologist, Inc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel beschrijven we het gebruik van DC-CYP-ALDH cellen, voor het verhogen van de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels. Onze gegevens hebben aangetoond dat de DC-CYP-ALDH-cellen lokaal hoge concentraties de Novo van zowel 1,25 (OH)2D en RA in vitro kunnen synthetiseren in de aanwezigheid van overeenkomstige substraten (d.w.z. 25 [Oh] D en retinol, respectievelijk). Omdat voldoende bloed concentraties van 25 (Oh) D en retinol gemakkelijk kunnen worden bereikt door middel van vitamine D en een supplementatie respectievelijk bij patiënten met een tekort van30,31, reden waarom de DC-CYP-aldh-cellen de inductie van darm-homing-Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels kunnen vergroten wanneer normale bloed concentraties van 25 (Oh) D en retinol aanwezig zijn. Om deze redenering te ondersteunen, blijkt uit onze gegevens dat bij normale gezonde dieren die geen vitamine D en vitamine A vertonen, de DC-CYP-ALDH-cellen de inductie van Treg-cellen vergroten die zowel regelgevende moleculen (d.w.z. foxp3 en IL-10) als een gut-homing-receptor (d.w.z. CCR9) uitdrukken. Daarom kan deze technologie worden gebruikt voor verder onderzoek van gut-homing Treg cellen voor de behandeling van IBD.
Een kritieke stap van dit protocol is de productie van Lenti-CYP-ALDH-virus met hoge titers. De gewenste virus Antilichaamtiters moeten 108– 109 TUs/ml zijn. Een hoge titer van het Lenti-CYP-ALDH-virus is noodzakelijk voor een hoge transductie-efficiëntie in DCs.
Een andere kritieke stap van dit protocol is de transductie-efficiëntie in DCs. Omdat DC-CYP-ALDH-cellen niet in vitro in deze technologie worden getold, is het van essentieel belang dat de transductie snelheid meer dan 90% is om ervoor te zorgen dat de DC-CYP-ALDH-cellen de inductie van Treg-cellen in de darmen in vivo efficiënt kunnen verbeteren. Bovendien kunnen de DC-CYP-ALDH-cellen verder worden gezuiverd door FACS voordat in vivo administratie32.
Een uniek voordeel van dit protocol is dat de DC-CYP-ALDH-cellen niet in vitro hoeven te worden getolëd voordat ze in vivo worden toegediend. Verwacht wordt dat de DC-CYP-aldh-cellen, als gevolg van de gecombineerde acties van 1,25 (Oh)2d en RA, in een tolerogene toestand in vivo zullen worden gehandhaafd, omdat zowel 1,25 (Oh)2D als RA is aangetoond dat de DCS33,34wordt getolgeld. Daarom verwachten we dat de DC-CYP-ALDH-cellen geen instabiliteit zorgen zullen hebben in een in vivo proinflammatoire omgeving.
Momenteel hebben we alleen aangetoond dat DC-CYP-ALDH-cellen de frequentie (aantal) van gut-homing-Treg-cellen in perifere lymfoïde weefsels en darmen6kunnen verhogen. Bijgevolg, regelgevende functie in de darmen als geheel wordt versterkt omdat het percentage van de Treg cellen in de darmen wordt verhoogd. Figuur 4 laat zien dat in vergelijking met die met controle behandelingen, intraperitoneale behandeling met DC-CYP-aldh-cellen aanzienlijk het percentage van CCR9+foxp3+ Treg-cellen in de mesenterische lymfeklieren heeft verhoogd, wat betekent dat meer Treg-cellen in de mesenterische lymfeklieren in staat zijn om specifiek thuis in de intestinale weefsels Figuur 4 toont verder aan dat de meeste foxp3+ T-cellen in mesenterische lymfeklieren negatief zijn voor CCR9 en daarom geen gut-homing-capaciteit hebben. Echter, of DC-CYP-ALDH-cellen ook de regelgevende functie van elke Treg-cel per se kunnen verbeteren (zoals verbeterde uitdrukkings niveaus van foxp3 en/of IL-10) vereist verder onderzoek.
De hier beschreven reagentia en materialen zijn alleen voor dierproeven. Het protocol is echter van toepassing op menselijke studies met behulp van overeenkomstige menselijke reagentia en materialen, behalve dat DCs zal worden gegenereerd uit perifere bloed monocyten bij de mens. Het uiteindelijke doel van dit protocol is de generatie van klinische grade DC-CYP-ALDH-cellen voor de behandeling van IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Drs. Xiaolei Tang en David J. Baylink zijn uitvinders van een octrooi in behandeling met betrekking tot deze studie.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het Bureau van de adjunct-secretaris van defensie voor gezondheidszaken via het peer reviewed medisch onderzoeksprogramma onder Awardnr. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van defensie. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door onderzoeks-innovatie subsidies van het departement geneeskunde aan de Loma Linda University (681207-2967 [XT en GG], 681205-2967 [XT] en 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K.
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
