Summary
هنا نقدم بروتوكول لزيادة الجسم الحي من الموجه الهضمية التعريفي الخلية T. في هذا البروتوكول ، يتم تصميم الخلايا الجذعية لإنتاج محليا تركيزات عاليه من فيتامين D النشط (1 ، 25-ديهيدروكسي فيتامين D أو 1 ، 25 [OH]2د) وفيتامين A النشط (حمض الريتينويك أو RA) دي نوفو.
Abstract
مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض التهابي مزمن في الجهاز الهضمي (GUT). في الولايات المتحدة الامريكيه, هناك تقريبا 1,400,000 [أبد] مريضات. ومن المقبول عموما ان الاستجابة المناعية dysregulated لبكتيريا الأمعاء يبدا المرض ويعطل الحاجز الظهاريه المخاطية. وقد أظهرنا مؤخرا ان خلايا T (Treg) التنظيمية الموجهة للأمعاء هي علاج واعد لل IBD. ووفقا لذلك ، يقدم هذا المقال بروتوكولا لزيادة الجسم المجري لحث الخلية Treg الموجه الأمعاء. في هذا البروتوكول ، تم تصميم الخلايا الجذعية لإنتاج تركيزات عاليه محليا من جزيئات من نوفو ، فيتامين D النشط (1 ، 25-ثنائي هيدروكسي فيتامين D أو 1 ، 25 [OH]2D) وفيتامين A النشط (حمض الريتينويك أو RA). اخترنا 1, 25 (OH)2d و ra استنادا إلى النتائج السابقة التي تبين ان 1, 25 (oh)2d يمكن ان تحفز التعبير عن الجزيئات التنظيمية (علي سبيل المثال ، فورخياد box P3 و interleukin-10) وان ra يمكن ان تحفز التعبير عن مستقبلات الأمعاء الموجه في الخلايا T. لتوليد مثل هذه الخلايا الجذعية المهندسة ، ونحن نستخدم متجه لينتيفيرال لتحويل الخلايا الجذعية إلى overexpress اثنين من الجينات. واحده مورثه ال [سيتوكروم] P450 أسره 27 [سوبف# اميلي] [ب] عضوه 1 ان [اينسلس] [25-هيدروكسيفيتامين د] [1 α-هيدروكسيلاز], اي [فيولوجكلي] يحفز التوليف من 1, 25 ([آه])2[د]. الجين الآخر هو ديجينداز الدهيد 1 فرد الاسره A2 ان الرموز الريديوالدهيد ديجينتاز 2, الذي يحفز فسيولوجيا تخليق RA. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في المستقبل من خلايا Treg القناة الهضمية في الجسم المجري.
Introduction
مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض التهابي مزمن في الجهاز الهضمي (GUT). في الولايات المتحدة الامريكيه, هناك تقريبا 1,400,000 [أبد] مريضات. ومن المقبول عموما ان الاستجابة المناعية dysregulated لبكتيريا الأمعاء يبدا المرض ويعطل الحاجز الظهاريه المخاطية1,2. ولهذا السبب ، فان الادويه التي وافقت عليها أداره الغذاء والدواء الامريكيه (FDA) المعتمدة حاليا تمنع وظائف الوسطاء التهابيين أو تمنع الخلايا المناعية من الحصول علي الأمعاء. ومع ذلك ، فان الوسطاء التهابيين والخلايا المناعية التي يتم استهدافها ضرورية أيضا للدفاعات المناعية. ونتيجة لذلك ، فان مثبطات الوسيط التهابيه تنال من الدفاع المناعي الجهازي ، وتضعف حاصرات الخلية المناعية من الدفاع المناعي للأمعاء ، وكلاهما يمكن ان يؤدي إلى عواقب وخيمه3،4. الاضافه إلى ذلك ، فان حاصرات موجه الخلية المناعية يمكن أيضا منع الموجه من الخلايا T (Treg) التنظيمية في القناة الهضمية ، التالي يمكن ان تتفاقم التسامح المناعي الأمعاء المهددة بالفعل في المرضي IBD. وعلاوة علي ذلك ، فان حجب الخلية الموجهة إلى الأمعاء قد يؤدي أيضا إلى كبت المناعة الجهازية بسبب تراكم خلايا Treg في الدم5. وأخيرا ، فان مثبطات وموانع وظيفة متعديه ، التالي ، تتطلب إدارات متكررة. الاداره المتكررة لهذه المثبطات والحاصرات قد تزيد من تفاقم الآثار الجانبية غير المرغوب فيها.
في الاونه الاخيره ، اقترحنا استراتيجية جديده يمكن ان تخفف أو حتى القضاء علي الآثار الجانبية المرتبطة بالادويه الحالية لعلاج IBD6. وهذه الاستراتيجية تقوي التحريض علي خلايا Treg الموجهة للأمعاء في الانسجه اللمفاوية الطرفية6. الأساس المنطقي لهذه الاستراتيجية هو ان خلايا Treg الموجهة إلى الأمعاء المنزل علي وجه التحديد إلى القناة الهضمية ، التالي لن يضر الدفاعات المناعية الجهازية. الاضافه إلى ذلك ، نظرا لان الخلايا treg يمكن ان تشكل الذاكرة7،8، القناة الهضمية الموجه الخلايا treg يمكن ان توفر السيطرة مستقره من التهاب الأمعاء المزمن في المرضي ibd ، التالي ، يجب ان لا تحتاج إلى ان تدار العلاج كما في كثير من الأحيان. وعلاوة علي ذلك ، نظرا لان هذه الاستراتيجية تزيد من تحريض خلايا الأمعاء الموجهة في الجسم الفيفو ، فانها لا تشعر بالقلق في عدم الاستقرار المجري في بيئة عاليه التهابات المرتبطة بالتبني نقل الخلايا treg المتولدة في المختبر9,10. في هذا الصدد ، في المختبر توليد خلايا treg هي واحده من الاستراتيجيات المقترحة لعلاج امراض المناعة الذاتية11،12،13 وزرع الرفض14،15. وأخيرا ، في هذه الاستراتيجية ، تم تصميم الخلايا الجذعية (DCs) لإنتاج تركيزات عاليه محليا من اثنين من جزيئات من نوفو: فيتامين D النشط (1 ، 25-ديهيدروكسي فيتامين D أو 1 ، 25 [OH]2د) وفيتامين A النشط (حمض الريتينويك أو RA). اخترنا 1, 25 (oh)2d و RA لان 1, 25 (oh)2d يمكن ان تحفز علي التعبير عن الجزيئات التنظيمية (علي سبيل المثال ، فورخيد box P3 [foxp3] و interleukin-10 [آيل-10])16,17 وان RA يمكن ان تحفز التعبير عن مستقبلات الأمعاء الموجه في الخلايا T18. لان كلا 1, 25 (OH)2D و RA يمكن أيضا تحمل dcs28,29, ونحن السبب في ان dcs المهندسة سيتم الاحتفاظ بثبات في حاله التحمل في الجسم الفيفو ، التالي التفاف في المخاوف عدم الاستقرار التي ترتبط في المختبر التي ولدت التسامح dc (toldcs)19,20,21. وفي هذا الصدد ، toldcs هي أيضا واحده من الاستراتيجيات المقترحة لتعزيز الجسم الخلوي لوظائف الخلية treg19،20،21. لدعم المنطق لدينا ، وقد أظهرنا ان الكائنات الدقيقة المهندسة ، وبناء علي في المجرية التسليم ، يمكن ان تزيد من التحريض من الأمعاء الموجه الخلايا Treg في الانسجه اللمفاوية الطرفية6.
ميزه اضافيه من استراتيجيتنا المقترحة هي ان 1, 25 (OH)2D أيضا وظائف أخرى يمكن ان تستفيد من المرضي ibd. وتشمل هذه الوظائف الأخرى قدره 1, 25 (OH)2د لتحفيز إفراز ميكروبات22 ويقمع السرطان23. وكثيرا ما ترتبط العدوى والسرطان مع ibd24,25.
لتوليد DCs التي يمكن ان تنتج تركيزات عاليه محليا من كل من 1 ، 25 (OH)2D و RA دي نوفو ، ونحن نستخدم متجه لينتيفيرال لهندسه DCs للتعبير عن اثنين من الجينات. واحده مورثه ال [سيتوكروم] P450 أسره 27 [سوبف# اميلي] [ب] عضوه 1 (CYP27B1) ان رموز [25-هيدروكسي] [د] [1 α-هيدروكسيلاز] ([1 α-هيدروكسيلاز]), اي [فيسيولوجكلي] يحفز التوليف من 25 ([آه])2[د.]. الجين الآخر هو ديجينداز الدهيد 1 فرد الاسره A2 (ALDH1a2) ان الرموز الريتينالدهيد ديجينتاز 2 (RALDH2) ، الذي يحفز فسيولوجيا تخليق RA6.
لأنه في زيادة الجسم المجري من القناة الهضمية الحث Treg التعريفي الخلية من المحتمل ان تكون مهمة في علاج IBD ، في البروتوكول التالي سنقوم بالتفصيل الإجراءات لتوليد 1α-هيدروكسيلاز-RALDH2-overexpressing dc (DC-CYP-ALDH الخلايا) التي يمكن استخدامها للتحقيق في المستقبل من خلايا Treg القناة الهضمية في الجسم المجري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استعراض جميع البروتوكولات الخاصة بدراسة الحيوانية والموافقة عليها من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه لوما ليندا (IACUC) ، فضلا عن مكتب العناية بالماشية واستخدامها (ACURO) من الجيش الأمريكي للبحوث الطبية والعتاد القيادة (USAMRMC) وزاره الدفاع.
1. اعداد اللينتيفيروس التي تعبر عن كل من 1α-هيدروكسيلاز و RALDH2 (lenti-CYP-ALDH الفيروسات)
- اليوم 0: في الصباح الباكر ، واعداد 5 × 105 خلايا/مل من خلايا 293t في المتوسطة الخلية سم-10-D ثقافة.
- البذور 20 مل/لوحه في 150 مم × 25 مم الاطباق الثقافية. ثقافة الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 24 كونفلوينسي سوف تصل إلى ~ 80-90 ٪ بعد 24 ساعة.
- اليوم 1: جعل 2x HBS (50 mM HEPES ، 280 mM NaCl ، و 1.5 mM Na2hbs4، pH 7.1). Aliquot ومخزن في-20 درجه مئوية.
- جعل 2 M CaCl2 وتخزينها في درجه حرارة الغرفة.
- لكل 150 مم × 25 ملم الثقافة الطبق ، واعداد خليط ترسيب الحمض النووي في أنبوب الثقافة 50 mL معقمه. أولا ، أضافه 1,620 μl من 2x hbs ، 9.5 ميكروغرام من PMD2G (vsvg) ، 17.5 ميكروغرام من pcmvr 8.74 (capsid) ، 27 ميكروغرام من Lenti-CYP-aldh البلازميد (ناقل لينتيفيرال الذي يحمل كلا من CYP27B1 و ALDH1a2). ثانيا ، أضافه H2O إلى الحجم النهائي من 3,037.5 μl.
- في الماضي ، أضافه 202.5 μL من 2 M CaCl2 درووايز في حين خلط الحل للتركيزات النهائية من 1X hbs و 125 MM cacl2. يجب ان يكون CaCl2 آخر لتتم اضافته. اترك خليط الخلطة في درجه حرارة الغرفة لمده 20 دقيقه مع الاختلاط العرضي. لعده 150 مم × 25 ملم الثقافة الاطباق ، وتوسيع نطاق وفقا لذلك.
- أضافه 3,240 μL من الحمض النووي هطول الامطار خليط قطره إلى 1 150 مم × 25 ملم الثقافة التي تحتوي علي الخلايا 293T. دوامه بلطف طبق الثقافة جنبا إلى جنب مع أضافه خليط ترسيب الحمض النووي. احتضان الطبق في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة.
- اليوم الثاني: أزاله محلول فوسفات الكالسيوم المتحول ، يغسل برفق مع 1x تلفزيوني ، وأعاده تغذيه ثقافة الخلية مع سم-4-D ثقافة الخلية المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة.
- اليوم الثالث: حصاد المواد الخارقة في زجاجات التخزين المعقمة وتخزينها في 4 – 8 درجه مئوية. تجديد ثقافة الخلية مع المتوسطة الطازجة الخلية سم-4-D الثقافة. ثقافة الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لأخر 24 ساعة.
- اليوم الرابع: حصاد المواد الخارقة إلى زجاجات التخزين المعقمة. تصفيه supernatants من اليوم 3 واليوم 4 من خلال فلتر 0.45 μm. للتركيز علي فيروس النمط الكاذب VSVG, نقل supernatants إلى أنابيب الطرد المركزي وتدور في 4,780 x g ل 24 ح في 4 ° c.
- اليوم الخامس: صب المواد الخارقة من الكريات (البيليه غالبا ما تكون مرئية) والسماح للأنابيب لاستنزاف علي منشفه ورقيه في خزانه السلامة الاحيائيه معقمه لعده دقائق.
- أعاده تعليق الكريات عن طريق الأنابيب مع المعقمة التي تحتوي علي 5 ٪ الجلسرين. حجم لأعاده التعليق سيكون 33.3 μL لكل 150 مم × 25 ملم الثقافة الطبق.
- Aliquot 200 μL/أنبوب وتخزين في-80 درجه مئوية. جعل قسامه منفصلة من 50 μl/فيال لأغراض المعايرة. يجب ان تكون الترسات ضمن نطاق 108-109 وحدات المحولة (توس)/ml.
- أضافه التبييض في الاطباق الثقافية والتخلص منها.
ملاحظه: هذه الخلايا المقسمة هي أكبر قلق السلامة في البروتوكول حيث يتم التعبير عن جميع العناصر لينتيفيرال في الخلايا.
2. توليد النخاع العظمي المستمدة Dc (BMDCs)
- حصاد والظنبوب و فخذ من 4 إلى 5 الفئران balb/c إلى 50 mL أنبوب البولي بروبيلين معقمه التي تحتوي علي الثقافة المتوسطة6.
- نقل التحيز و فخذ إلى 100 مم × 20 ملم الثقافة التي تحتوي علي الوسط الثقافي. أزاله الانسجه مثل العضلات من التحيز و فخذ باستخدام مقص تشريح وملقط.
- قطع كلا طرفي الانحياز و فخذ للكشف عن تجويف نخاع العظم.
- ارسم 10 مل من الوسط الثقافي في حقنه 10 مل مرفقه بابره 30 جرام.
- ادخل الابره بعناية في تجويف نخاع العظم وامسح نخاع العظم إلى أنبوب البولي بروبيلين المعقم 50 mL النظيف. كرر هذا الاجراء إذا لزم الأمر ، للتاكد من ان نخاع العظم قد تم مسحها بالبالكامل.
- بيليه خلايا نخاع العظم بواسطة طرد (400 x g) في 2 – 8 درجه مئوية لمده 5 دقائق. يستنشق العملاق.
- أعاده التعليق بيليه مع 5 مل من 1x خليه الدم الحمراء تحلل العازلة.
- احتضان الخلايا في درجه حرارة الغرفة لمده 4 – 5 دقيقه مع الاهتزاز في بعض الأحيان.
- وقف رد الفعل عن طريق أضافه 30 مل من الثقافة المتوسطة.
- بيليه الخلايا بواسطة طرد (400 x g) في 2 – 8 درجه مئوية لمده 5 دقائق. أعاده تعليق الخلايا في 10 مل من سم-10-R خليه الثقافة المتوسطة. إذا لزم الأمر ، يمكن تمرير الخلايا من خلال مصفاه خليه 40 μm لأزاله الحطام.
- اجراء عدد خليه وضبط الخلايا إلى 1 × 106 خلايا/مل باستخدام سم-10-R خليه الثقافة المتوسطة.
- أضافه المؤتلف murine الحبيبية/الضامة عامل تحفيز مستعمره (GM-السائل الدماغي الشوكي ، والتركيز النهائي = 100 U/mL) ومورين interleukin-4 (IL-4 ، التركيز النهائي = 10 U/mL).
ملاحظه: يتم تخزين حلول الأسهم من جنرال موتورز-السائل الدماغي الشوكي و IL-4 في-80 درجه مئوية في 100,000 U/mL (1 ، 000x) و 10,000 U/mL (1 ، 000x) ، علي التوالي. - توزيع الخلايا في 6 لوحات ثقافة جيدا في 4 مل/بئر وثقافة الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 48 h.
- قم بازاله الخلايا غير الملتصقة بالأنابيب اللطيفة.
- أضافه الجديدة سم-10-R خليه الثقافة المتوسطة التي تحتوي علي GM-السائل الدماغي الشوكي (100 U/mL) و IL-4 (10 U/مل). ثقافة الخلايا ل آخر 48 h.
- حصاد الخلايا غير الملتصقة (BMDCs) لتوصيلها بفيروس lenti-CYP-ALDH.
3. محول dc مع lenti-CYP-ALDH الفيروسات لتوليد الخلايا العاصمة-CYP-ALDH
- اعداد 1 × 106 DCs/بئر في حجم الإجمالي من 0.5 مل من سم-10-R خليه ثقافة المتوسطة التي تحتوي علي 50 μl من الفيروس و 8 ميكروغرام/مل بروتامين في 6 لوحه ثقافة جيدا.
- ثقافة الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة.
- استبدلت المتوسطة مع جديده [سم-10-ر] خليه ثقافة وسط وثقافة الخلايا في 37 [ك] و 5% [كو2 ] ل آخر 24 [ه.]. في هذه النقطة الزمنيه ، يمكن تقييم الانشطه الانزيميه من 1α-هيدروكسيلاز و RALDH2 (انظر الخطوة 4). إذا لزم الأمر ، كرر الخطوات 3.1-3.3 للحصول علي محول ثان.
- أضافه عديد السكاريد (100 ng/mL) والثقافة الخلايا لمده 24 ساعة.
- حصاد الخلايا (DC-CYP-ALDH الخلايا) للتجارب.
4. تقييم الإفراط في التعبير عن 1α-هيدروكسيلاز و RALDH2 في الخلايا العاصمة-CYP-ALDH
- تقييم الإفراط في التعبير عن 1α-هيدروكسيلاز في خلايا DC-CYP-ALDH
- البذور 1.0 x 106 DC-CYP-aldh الخلايا/بئر في 2 مل من سم-10-R خليه الثقافة المتوسطة في 12 لوحات ثقافة جيدا.
- أضافه 25 (OH) D إلى التركيز النهائي من 2.5 μM. احتضان خلايا DC-CYP-ALDH لمده 24 ساعة.
- حصاد سوبرناتانتس وتخزين في-20 درجه مئوية.
- فحص ل 1, 25 (OH)2D تركيزات في سوبرناتانتس باستخدام المناعية الاشعاعيه المتاحة تجاريا (ريا) (انظر جدول المواد).
- تحديد التعبير من 1α-هيدروكسيلاز في الخلايا العاصمة-CYP-ALDH بواسطة الفرز الخلية المنشطة فلوري (FACS) باستخدام الأجسام المضادة لCYP27B1.
- تقييم الRALDH2 المكشوفة في خلايا DC-CYP-ALDH
ملاحظه: يتم تحديد التعبير والنشاط RALDH2 المعبر عنها باستخدام مجموعه الكشف عن النازعة (ALDH) التجارية الديجينداز (انظر جدول المواد).- بذور 1 مل من DC-CYP-ALDH أو خلايا التحكم (1 × 105 خلايا/مل في المخزن المؤقت المقايسة) في كل من اثنين من أنابيب 5 مل (واحد المسمي باسم "السيطرة" والاخر وصفت بأنها "اختبار").
- أضافه 10 μL من ديثيلامينوبينزالدهيدي (DEAB) الحل (1.5 mM في 95 ٪ الايثانول) لكل من أنابيب التحكم وتخلط علي الفور. DEAB هو مثبط RALDH2.
- أضافه 5 μL من الركيزة الفلورية المنشطة RALDH (300 μM) إلى أنابيب التحكم والاختبار وتخلط علي الفور.
- احتضان الأنابيب لمده 45 دقيقه.
- بيليه الخلايا بواسطة طرد في 400 x ز في 2-8 درجه مئوية لمده 5 دقائق. يستنشق الديدان الخارقة.
- أعاده تشكيل الخلايا في 200 μL من المخزن المؤقت الفحص.
- الحفاظ علي الخلايا علي الجليد والمضي قدما للتحليل من قبل FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العاصمة-CYP-ALDH الخلايا التي أعربت عن زيادة كبيره في كميه 1α-هيدروكسيلاز. لتحديد ما إذا كانت الخلايا DC-CYP-ALDH التي تم إنشاؤها من BMDCs عبرت عن زيادة كبيره في كميه 1α-هيدروكسيلاز ، تم محوله BMDCs مع فيروس lenti-CYP-ALDH لإنتاج خلايا النخاع العظمي المستمدة من العاصمة-CYP-aldh (خلايا BMDC-CYP-ALDH). وفي وقت لاحق ، تم فحص خلايا BMDC-CYP-ALDH للتعبير عن 1α-هيدروكسيلاز من قبل FACS. وأظهرت بياناتنا ان الخلايا BMDC-CYP-ALDH ، بالمقارنة مع BMDCs الابويه ، عرض تعزيز التعبير عن 1α-هيدروكسيلاز (الشكل 1ا). ونحن أيضا تحديد النشاط الانزيمي من 1α-هيدروكسيلاز في الخلايا BMDC-CYP-ALDH. للقيام بذلك ، تمت أضافه 1.0 x 106 BMDC-CYP-aldh الخلايا في 2 مل من سم-10-R خليه الثقافة المتوسطة في 12 لوحات ثقافة جيدا. 25 (OH) D ثم أضيف إلى ثقافة الخلية في التركيز النهائي من 2.5 μM. تم استزراع الخلايا في 37 درجه مئوية و 5% CO2 لمده 24 ساعة وتم حصاد المواد الفائقة لقياس 1, 25 (OH)2D باستخدام الفحص المناعي الإشعاعي (RIA). وأظهرت البيانات لدينا ان 1, 25 (OH)2D تركيزات في الثقافة supernatants من الخلايا bmdc-cyp (بالمحولات بفيروس LENTI-CYP-gfp) و bmdc-cyp-وكانت خلايا aldh كل منها تقريبا 20 x اعلي من تلك الموجودة في bmdcs الابويه وخلايا bmdc-Aldh (bmdcs محوله مع فيروس LENTI-aldh) (الشكل 1ب).
وأعربت الخلايا العاصمة-CYP-ALDH زيادة كبيره في كميه RALDH2. لتحديد ما إذا كانت الخلايا BMDC-CYP-ALDH أعربت عن كميه متزايدة بشكل كبير من RALDH2 ، تمت أضافه RALDH2 الركيزة في ثقافات الخلية في وجود أو غياب المثبط RALDH2 ديثيلامينوبينزالدهيدي (DEAB) (15 μM). تم تحليل المنتج الفلوري المحتفظ به داخل الخلايا من قبل FACS. وأظهرت بياناتنا ان يعني كثافة فلوري (مؤسسات التمويل الأصغر) من الخلايا BMDC-CYP-ALDH كانت تقريبا 6x اعلي من تلك التي BMDCs الابويه ، مما يوحي بان الخلايا BMDC-CYP-ALDH ، بالمقارنة مع BMDCs الابويه ، وأعرب تعزيز النشاط الانزيمي RALDH2بشكلكبير (ال
العاصمة-CYP-ALDH الخلايا زيادة التحريض منfoxp3 +CCR9 + القناة الهضمية الموجه الخلايا في المختبر. للتحقيق في ما إذا كانت الخلايا العاصمة-cyp-aldh قادره علي زيادة التحريض من خلايا treg الأمعاء الموجه في المختبر ، ونحن محوله dc 2.4 الخلايا (نخاع العظم المستمدة العاصمة خط26،27،28،29) ، مع lenti-cyp-aldh الفيروسات وتوليد dc 2.4-cyp-aldh الخلايا. وبعد ذلك ، حددنا ما إذا كانت الخلايا 2.4-CYP-ALDH العاصمة قادره علي زيادة التحريض من خلايا Treg القناة الهضمية في المختبر. وفقا لذلك ، تم تنقيه خلايا السذاجة الساذجة من C57BL/6 فئران. تنقيه الخلايا الساذجة السذاجة في 5 × 105 خلايا/وكانت جيدا ثم الدوس مع اما العاصمة الابويه 2.4 الخلايا (1 × 105 خلايا/بئر) أو DC 2.4-CYP-aldh الخلايا (1 × 105 خلايا/بئر) في 24 لوحات الثقافة جيدا في وسط المصل خاليه في وجود الأجسام المضادة الاحاديه CD3 (5 ميكروغرام/مل) والمؤتلف الإنسان IL-2 (50 U/ml). الاضافه إلى ذلك ، تمت أضافه 25 (OH) D و الريتينول في تركيزات مختلفه أيضا إلى الثقافات. حضنت الخلايا كان في 37 [ك] و 5% [كو]2. بعد خمسه أيام ، تم تحليل الخلايا من قبل FACS للتعبير عن foxp3 و c-ج chemokine المستقبلات نوع 9 (CCR9). وأظهرت بياناتنا انه في وجود ركائز, العاصمة 2.4 الخلايا لم تغير بشكل كبير وفره منfoxp3 +CCR9 + الخلايا في السكان خليه الخلايا التائية + T ( الشكل 3ا, ب). وفي المقابل ، عززت خلايا DC 2.4-CYP-ALDH وفرهfoxp3 +CCR9 + الخلايا بين الخلاياالتائية . الاضافه إلى ذلك ، فان أكثر 25 (OH) D وأضاف ، وزيادة قدره الخلايا 2.4-CYP-ALDH العاصمة لزيادة وفره منfoxp3 +CCR9 + خلايا بين الخلاياالتائية . ولذلك ، لدينا دعم البيانات التي الخلايا DC-CYP-ALDH يمكن ان تزيد من التحريض من الأمعاء الموجهة الخلايا Treg في المختبر.
العاصمة-CYP-ALDH الخلايا زيادة التحريض منfoxp3 +CCR9 + القناة الهضمية الموجه الخلايا في فيفو. لتحديد ما إذا كانت الخلايا DC-CYP-ALDH يمكن ان تزيد من التحريض من خلايا Treg القناة الهضمية في الجسم المجري ، نحن داخل أداره واحده من الخلايا التالية في Balb/c الفئران: الابويه العاصمة 2.4 الخلايا ، والخلايا العاصمة 2.4-CYP (DC 2.4 خلايا محوله مع lenti-CYP-GFP الفيروس) ، والعاصمة-2.4-CYP-ALDH الخلايا. بعد أربعه أيام من أداره الخلية ، تم فحص الغدد الليمفاوية المساريقي من قبل FACS (الشكل 4ا). وأظهرت بياناتنا ان الخلايا العاصمة 2.4-CYP-ALDH, بالمقارنة مع الضوابط, زيادة كبيره في وفرهfoxp3 +CCR9 + خلايا بينCD3 + T الخلايا (الشكل 4ب, ج). واستنادا إلى هذه النتائج ، نستنتج ان أداره الخلية DC-CYP-ALDH يعزز بشكل كبير التحريض منfoxp3 +CCR9 + T الخلايا في الانسجه اللمفاوية الطرفية.
الشكل 1: الخلايا DC-CYP-ALDH التي أعربت عن زيادة كبيره في كميه 1 α-هيدروكسيلاز. (ا) تم إنشاء وتحليل خلايا BMDC-CYP-aldh من قبل facs. مؤامرة ممثل FACS يظهر التعبير عن 1α-هيدروكسيلاز في BMDCs الابويه و BMDC-CYP-ALDH الخلايا (بوابات علي الخلايا الحية). (ب) أضيفت ركيزة واحده هيدروكسيلاز (اي 25 (OH) D) إلى ثقافات العاصمة. 24 ح في وقت لاحق ، تم جمع supernatants و 1 ، 25 (OH)2D تم قياس تركيزات. تظهر البيانات تركيزات 1 ، 25 (OH)2D في ثقافات BMDCs الابويه ، وخلايا BMDC-cyp ، وخلايا BMDC-aldh ، وخلايا BMDC-CYP-aldh. * * p < 0.01. اختبار ANOVA. n = 4. وقد تم تكييف هذا الرقم من شو وآخرون6. حقوق الطبع والنشر 2019. الرابطة الامريكيه لعلم المناعة ، وشركه يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وأعربت الخلايا العاصمة-CYP-ALDH زيادة كبيره في كميه RALDH2. (ا) تم إنشاء وتحليل خلايا BMDC-CYP-aldh علي النحو الموصوف في البروتوكول. ممثل المؤامرات FACS تظهر الفلورية BODIPY الامينيه في BMDCs وخلايا BMDC-CYP-ALDH في وجود (+ DEAB) أو غياب (-DEAB) من مثبط RALHD2 ديثيلامينوبينزالدهيدي (DEAB). (ب) يعني كثافة مضان (مؤسسات التمويل الأصغر) من الامينيه BODIPY في BMDCs وخلايا BMDC-CYP-aldh في غياب deab. * ف < 0.05 ؛ t-اختبار ؛ n = 4. وقد تم تكييف هذا الرقم من شو وآخرون6. حقوق الطبع والنشر 2019. الرابطة الامريكيه لعلم المناعة ، وشركه يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الخلايا DC-CYP-ALDH زيادة التحريض منfoxp3 +CCR9 + القناة الهضمية الموجه الخلايا الانبوبيه في المختبر. (ا) تم عزل خلايا Tالساذجة من C57BL/6 طحال الماوس. وبعد ذلك تم تنشيط الخلايا في الثقافات بواسطة ماب المضادة لCD3 (5 ميكروغرام/مل) في وجود اما الابويه العاصمة 2.4 الخلايا أو الخلايا العاصمة 2.4-CYP-aldh. بالاضافه إلى ذلك ، تمت أضافه الثقافات مع تركيزات المشار اليها من 25 (OH) D و الريتينول. بعد خمسه أيام ، تم جمع الخلايا وتحليلها من قبل FACS للتعبير عن foxp3 و CCR9 فيCD3 +الخلاياالتائية . المؤامرات التمثيلية لل FACS تظهر تعبيرات foxp3 و CCR9 فيCD3 +الخلاياالتائية . (ب) البيانات التراكمية من (ا). * ف < 0.05 ؛ اختبار ANOVA; n = 4. وقد تم تكييف هذا الرقم من شو وآخرون6. حقوق الطبع والنشر 2019. الرابطة الامريكيه لعلم المناعة ، وشركه يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الخلايا العاصمة-CYP-ALDH زيادة التحريض منfoxp3 +CCR9 + القناة الهضمية الموجه الخلايا في فيفو. (ا) تلقت الفئران balb/c داخل الصفاق (i.p.) واحده من التحويلات dc التالية (نقل): لا نقل Dc (لا نقل) ، الابويه العاصمة 2.4 الخلايا ، العاصمة الخلايا 2.4-cyp ، والعاصمة الخلايا 2.4-CYP-aldh. بعد أربعه أيام ، تم تحليل الغدد الليمفاوية المساريقي (MLNs) من قبل FACS. (ب) المؤامرات التمثيلية لهذا البرنامج تظهر تعبيري FOXP3 و CCR9في CD3 خليه السكان. (ج) تظهر البيانات التراكمية من (ب) النسبة المئوية للخلاياfoxp3 +CCR9 + في عدد الخلايا الCD3ه + T. تم بوابات الخلايا عليCD3 + T الخلايا لجميع التحاليل. وحيثما ينطبق ذلك ، فان البيانات المقدمة تعني ± SEM. * p < 0.05 ؛ اختبار ANOVA; n = 4 – 6. وقد تم تكييف هذا الرقم من شو وآخرون6. حقوق الطبع والنشر 2019. الرابطة الامريكيه لعلم المناعة ، وشركه يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة ونحن وصف استخدام الخلايا DC-CYP-ALDH ، لزيادة التحريض من الأمعاء الموجه الخلايا Treg في الانسجه اللمفاوية الطرفية. وقد أظهرت بياناتنا ان الخلايا DC-CYP-ALDH يمكن توليف تركيزات عاليه محليا من نوفو من كل من 1, 25 (OH)2D و RA في المختبر في وجود ركائز المقابلة (اي, 25 [OH] D و الريتينول, علي التوالي). لان ما يكفي من تركيزات الدم من 25 (oh) د و الريتينول يمكن ان يتحقق بسهوله من خلال فيتامين (د) و A استكمال علي التوالي في المرضي الذين لديهم عيوب30،31، ونحن السبب في ان الخلايا DC-CYP-aldh يمكن ان تزيد من التحريض من الأمعاء الموجه الخلايا treg في الانسجه اللمفاوية الطرفي ولدعم هذا المنطق ، توضح بياناتنا انه في الحياة الطبيعية للحيوانات التي لا تحتوي علي فيتامين د ونقص فيتامين (ا) ، تزيد خلايا DC-CYP-ALDH من استقراء خلايا Treg التي تعبر عن كل من الجزيئات التنظيمية (اي foxp3 و IL-10) ومستقبلات القناة الهضمية (اي CCR9). ولذلك ، يمكن استخدام هذه التكنولوجيا لمزيد من التحقيق في خلايا الأمعاء الموجهة Treg لعلاج IBD.
خطوه حاسمه واحده من هذا البروتوكول هو إنتاج فيروس lenti-CYP-ALDH مع titers عاليه. يجب ان يكون الترس المفضل للفيروس 108– 109 توس/مل. A عيار عاليه من فيروس lenti-CYP-aldh ضروري لكفاءة عاليه الطاقة في الشركات النامية.
ومن الخطوات الحاسمة الأخرى في هذا البروتوكول كفاءه المحولات في النامية. لان الخلايا DC-CYP-ALDH لا تحمل في المختبر في هذه التكنولوجيا ، فمن الضروري ان يكون معدل المحولة أكثر من 90 ٪ لضمان ان خلايا DC-CYP-ALDH يمكن زيادة كفاءه الحث من خلايا الأمعاء الموجهة Treg في الجسم الحيوي. الاضافه إلى ذلك ، يمكن تنقيه الخلايا DC-CYP-ALDH من قبل FACS قبل في الاداره المجرية32.
ميزه فريدة من هذا البروتوكول هو ان خلايا DC-CYP-ALDH لا تحتاج إلى ان تكون مقبوله في المختبر قبل في الاداره المجرية. ومن المتوقع ان الخلايا DC-CYP-aldh, نتيجة للإجراءات مجتمعه من 1, 25 (oh)2d و ra, سيتم الاحتفاظ في حاله التحمل في الجسم الفيفو لان كلا 1, 25 (oh)2d و ra وقد ثبت ان تحمل DCs33,34. ولذلك ، فاننا نتوقع ان الخلايا DC-CYP-ALDH لن يكون لها مخاوف عدم الاستقرار في بيئة التهابات في الجسم الخارجي.
حاليا ، لقد أظهرنا فقط ان الخلايا DC-CYP-ALDH يمكن زيادة التردد (عدد) من خلايا الأمعاء الموجهة Treg في الانسجه اللمفاوية الطرفية والأمعاء6. التالي ، يتم تعزيز الوظيفة التنظيمية في الأمعاء ككل لأنه يتم زيادة النسبة المئوية من خلايا Treg في الأمعاء. ويبين الشكل 4 انه بالمقارنة مع تلك التي لديها علاجات التحكم ، والعلاج داخل الصفاق مع الخلايا العاصمة-CYP-aldh زيادة كبيره في النسبة المئوية للخلاياCCR9 +foxp3 + treg في الغدد الليمفاوية المساريقي ، وهذا يعني ان المزيد من الخلايا treg في الغدد الليمفاوية المساريقي قادر ويبين الشكل 4 كذلك ان معظم الخلاياfoxp3 + T في الغدد الليمفاوية المساريقي سلبيه بالنسبة CCR9 التالي لا تملك قدره القناة الهضمية. ومع ذلك ، ما إذا كانت الخلايا DC-CYP-ALDH يمكن أيضا تعزيز الوظيفة التنظيمية لكل خليه Treg في حد ذاته (مثل تعزيز مستويات التعبير من foxp3 و/أو IL-10) يتطلب المزيد من التحقيق.
الكواشف والمواد الموصوفة هنا هي للدراسات الحيوانية فقط. ومع ذلك ، فان البروتوكول ينطبق علي الدراسات البشرية باستخدام الكواشف البشرية المقابلة والمواد ، الا ان DCs سيتم إنشاؤها من الخلايا الدموية المحيطيه في البشر. الهدف النهائي لهذا البروتوكول هو توليد خلايا الصف السريرية DC-CYP-ALDH لعلاج IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
السيد شياوولي تانغ وديفيد ج. بايلينك مخترعان لبراءة الاختراع المعلقة المتعلقة بهذه الدراسة.
Acknowledgments
وقد حظي هذا العمل بدعم مكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية من خلال برنامج البحوث الطبية الذي استعرضه النظراء في اطار الجائزة رقم W81XWH-15-1-0240 (XT). الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي تلك التي للمؤلف ولا تؤيدها بالضرورة وزاره الدفاع. وقد دعم هذا العمل أيضا جزئيا بمنح الابتكار البحثي من قسم الطب في جامعه لوما ليندا (681207-2967 [XT و GG] ، 681205-2967 [XT] ، و 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
