Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'aumento in vivo dell'induzione delle cellule T regolatorie gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre localmente alte concentrazioni della vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e la vitamina attiva A (acido retinoico o RA) de novo.
Abstract
La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epiteliale mucosale. Recentemente dimostriamo che le cellule T (Treg) regolatorie gut-homing sono una terapia promettente per l'IBD. Di conseguenza, questo articolo presenta un protocollo per l'aumento in vivo dell'induzione delle cellule Treg gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo, vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)2D e RA sulla base di risultati precedenti che mostrano che 1,25(OH)2D possono indurre l'espressione di molecole regolatorie (ad esempio, box forcella P3 e interleucina-10) e che l'AR può stimolare l'espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T. Per generare tali cellule dendritiche ingegnerizzate, utilizziamo un vettore lentivirale per traduciare le cellule dendritiche per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 che codifica 25-idrossivitamina D 1,idrossilasi, che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)2D. L'altro gene è la dehydrogenasi di aldeide 1 membro della famiglia A2 che codifica la retinaldedeide dehydrogenasi 2, che catalizza fisiologicamente la sintesi dell'AR. Questo protocollo può essere utilizzato per future indagini sulle cellule Treg gut-homing in vivo.
Introduction
La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epitelialemucosale 1,2. Per questo motivo, attualmente disponibili farmaci approvati U.S. Food and Drug Administration (FDA) inibiscono le funzioni dei mediatori infiammatori o bloccano l'homing delle cellule immunitarie nell'intestino. Tuttavia, i mediatori infiammatori e le cellule immunitarie che sono mirati sono necessari anche per le difese immunitarie. Di conseguenza, gli inibitori del mediatore infiammatorio compromettono la difesa immunitaria sistemica e i bloccanti dell'homing delle cellule immunitarie indeboliscono la difesa immunitaria intestinale, entrambe le quali possono portare a gravi conseguenze3,4. Inoltre, gli bloccanti delle cellule immunitarie possono anche bloccare l'homing delle cellule T (Treg) regolatorie nell'intestino e quindi possono peggiorare la tolleranza immunitaria intestinale già compromessa nei pazienti affetti da IBD. Inoltre, il blocco delle cellule di Treg homing nell'intestino può anche portare alla soppressione immunitaria sistemica a causa dell'accumulo di cellule Treg nel sangue5. Infine, gli inibitori e i bloccanti funzionano in modo transitorio e, di conseguenza, richiedono amministrazioni frequenti. La frequente somministrazione di questi inibitori e bloccanti può esacerbare ulteriormente gli effetti collaterali spiacevoli.
Recentemente, abbiamo proposto una nuova strategia che può potenzialmente mitigare o addirittura eliminare gli effetti collaterali associati ai farmaci attuali per il trattamento Con IBD6. Questa strategia aumenta l'induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici6. La logica di questa strategia è che le cellule Treg gut-homing specificamente casa per l'intestino e quindi non compromettere le difese immunitarie sistemiche. Inoltre, poiché le cellule Treg possono potenzialmente formare memoria7,8, cellule Treg gut-homing possono potenzialmente fornire un controllo stabile dell'infiammazione cronica dell'intestino nei pazienti Con IBD e, quindi, il trattamento non dovrebbe essere somministrato con la stessa frequenza. Inoltre, poiché questa strategia aumenta l'induzione delle cellule Treg gut-homing in vivo, non ha la preoccupazione di instabilità in vivo in un ambiente altamente proinfiammatorio che è associato con il trasferimento adottivo di cellule Treg generate in vitro9,10. A questo proposito, le cellule Treg generate in vitro sono una delle strategie proposte per il trattamento delle malattie autoimmuni11,12,13 e rigetto del trapianto14,15. Infine, in questa strategia, le cellule dendritiche (DC) sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo: vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)2D e RA perché 1,25(OH)2D possono indurre l'espressione di molecole regolatorie (ad esempio, forchetta box P3 [foxp3] e interleutra-10 [IL-10])16,17 e che l'AR può stimolare l'espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T18. Poiché sia 1,25(OH)2D che RA possono anche tollerare i controller di dominio28,29, ragioniamo che i controller di dominio ingegnerizzati saranno mantenuti stabilmente in uno stato tolerogenico in vivo e quindi eludere le preoccupazioni inpresentisti che sono associate con DC tolerogeni generati in vitro (TolDC)19,20,21. A questo proposito, i TolDC sono anche una delle strategie proposte per l'aumento in vivo delle funzioni cellulari Treg19,20,21. Per sostenere il nostro ragionamento, abbiamo dimostrato che i CONTROLLER di dominio ingegnerizzati, al momento della consegna in vivo, possono aumentare l'induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici6.
Un ulteriore vantaggio della nostra strategia proposta è che 1,25(OH)2D ha anche altre funzioni che possono potenzialmente beneficiare i pazienti con IBD. Queste altre funzioni includono la capacità di 1,25(OH)2D per stimolare la secrezione di antimicrobici22 e per sopprimere la carcinogenesi23. Infezioni e tumori sono spesso associati con IBD24,25.
Per generare i CONTROLLER di dominio in grado di produrre concentrazioni locali elevate sia di 1,25(OH)2D che di RA de novo, utilizziamo un vettore lentivirale per progettare dc per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 (CYP27B1) che codifica 25-idrossivitamina D 1-idrossilasi (1-idrossislasi), che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)2D. L'altro gene è l'aldeide dehydrogenasi 1 membro della famiglia A2 (ALDH1a2) che codifica retinaldeide dehydrogenasi 2 (RALDH2), che catalizza fisiologicamente la sintesi di RA6.
Poiché l'aumento in vivo dell'induzione delle cellule Treg gut-homing è potenzialmente importante nel trattamento dell'IBD, nel seguente protocollo ildettagliamo le procedure per la generazione dei DC inesprimibili 1-idrossilasi-RALDH2 (cellule DC-CYP-ALDH) che può essere utilizzato per la futura indagine sulle cellule Treg gut-homing in vivo.
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Protocol
Tutti i protocolli di studio sugli animali in vivo sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso istituzionale degli animali (IACUC) dell'Università di Loma Linda, nonché dall'Ufficio per la revisione della cura e l'uso degli animali (ACURO) del Comando per la ricerca medica e il materiel dell'esercito degli Stati Uniti (USAMRMC) Dipartimento della Difesa.
1. Preparazione del Lentivirus che esprime sia 1-idrossilasi e RALDH2 (lenti-CYP-ALDH Virus)
- Giorno 0: Al mattino presto, preparare 5 x 105 cellule / mL di 293T cellule nel mezzo di coltura cellulare CM-10-D.
- Seme 20 mL/piastra in 150 mm x 25 mm piatti di coltura. Colture le cellule a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 24 h. La confluenza raggiungerà l'80-90% dopo 24 h.
- Giorno 1: Fare 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, e 1.5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
- Fare 2 M CaCl2 e conservare a temperatura ambiente.
- Per ogni piatto di coltura da 150 mm x 25 mm, preparare una miscela di precipitazione del DNA in un tubo di coltura sterile da 50 mL. Aggiungete in primo luogo 1.620 luna di 2x HBS, 9,5 g di PMD2G (VSVG), 17,5 g di pCMVR8,74 (Capsid), 27 g di plasmide LentiP-ALDH (un vettore lentivirale che trasporta sia CYP27B1 che ALDH1a2). In secondo luogo, aggiungere H2O ad un volume finale di 3.037,5 l.
- Nell'ultimo, aggiungere 202,5 luna di 2 M CaCl2 dropwise mescolando la soluzione alle concentrazioni finali di 1x HBS e 125 mM CaCl2. CaCl2 deve essere l'ultimo ad essere aggiunto. Lasciare le miscele di trasfezione a temperatura ambiente per 20 min con miscelazione occasionale. Per più piatti di coltura da 150 mm x 25 mm, aumentare di conseguenza.
- Aggiungete il 3.240 l di miscela di precipitazione del DNA a un piatto di coltura da 150 mm x 25 mm contenente le cellule da 293T. Ruotare delicatamente il piatto di coltura da un lato all'altro aggiungendo la miscela di precipitazione del DNA. Incubare il piatto a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 24 h.
- Giorno 2: Rimuovere la soluzione di trasfezione di fosfato di calcio, lavare delicatamente con 1x PBS e alimentare nuovamente la coltura cellulare con il mezzo di coltura cellulare CM-4-D. Incubare le cellule a 37 e 5% CO2 per 24 h.
- Giorno 3: Raccogliere i supernatanti in bottiglie sterili e conservare a 4-8 gradi centigradi. Ricostituire la coltura cellulare con un nuovo mezzo di coltura cellulare CM-4-D. Colture le cellule a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2 per altri 24 h.
- Giorno 4: Raccogliere i supernatanti in bottiglie di stoccaggio sterili. Filtrare i supernatanti dal Giorno 3 e dal Giorno 4 attraverso un filtro 0,45 m. Per concentrare il virus pseudotipo VSVG, trasferire i supernatanti in tubi di centrifuga e girare a 4.780 x g per 24 h a 4 gradi centigradi.
- Giorno 5: Versare i supernatanti dai pellet (il pellet è spesso visibile) e lasciare che i tubi si scarichino su un tovagliolo di carta in un armadio sterile di biosicurezza per diversi minuti.
- Risospendere i pellet con il pipeting con PBS sterile contenente il 5% di glicerolo. Il volume per la sospensione sarà di 33,3 ìl per 150 mm x 25 mm piatto di coltura.
- Aliquota 200 l/tubo e conservare a -80 gradi centigradi. Fare un'aliquota separata di 50 gradi/fiala a scopo di titolazione. I titori devono essere compresi nell'intervallo di 108–109 unità trasduttrici (TUs)/mL.
- Aggiungere la candeggina nei piatti della cultura e scartarli.
NOTA: Queste cellule trasfetate sono la più grande preoccupazione per la sicurezza nel protocollo poiché tutti gli elementi lentivirali sono espressi nelle cellule.
2. Generazione di controller di dominio derivati del midollo osseo (BMDC)
- Raccogliere tibie e feor da 4-5 topi di balsamo/c in un tubo di polipropilene sterile da 50 mL contenente il mezzo di coltura6.
- Trasferire il tibi e i femori in un piatto di coltura da 100 mm x 20 mm contenente il mezzo di coltura. Rimuovere tessuti come i muscoli dai tibi e femori utilizzando forbici sezionanti e pinze.
- Tagliare entrambe le estremità del tibi e femori per esporre la cavità del midollo osseo.
- Disegnare 10 mL di coltura in una siringa da 10 mL attaccata ad un ago da 30 G.
- Inserire con attenzione l'ago nella cavità del midollo osseo e scovare il midollo osseo in un tubo di polipropilene sterile sterile da 50 mL pulito. Ripetere questa procedura se necessario, per assicurarsi che il midollo osseo sia stato completamente svuotato.
- Pellet le cellule del midollo osseo per centrifugazione (400 x g)a 2–8 gradi centigradi per 5 min. Aspirate il supernatante.
- Risospendere il pellet con 5 mL di 1x tampone di lisi di globuli rossi.
- Incubare le cellule a temperatura ambiente per 4-5 min con scosse occasionali.
- Interrompere la reazione aggiungendo 30 mL di mezzo di coltura.
- Pellet le cellule per centrifugazione (400 x g) a 2–8 s per 5 min. Risogli nuovamente le cellule in 10 mL di CM-10-R mezzo di coltura cellulare. Se necessario, le cellule possono essere passate attraverso un colino cellulare di 40 m per rimuovere i detriti.
- Eseguire un numero di celle e regolare le celle a 1 x 106 celle/mL utilizzando il supporto di coltura delle celle CM-10-R.
- Aggiungere il fattore di stimolazione della colonia murine ricombinante/macrofago (GM-CSF, concentrazione finale 100 U/mL) e murino interleucolo-4 (IL-4, concentrazione finale - 10 U/mL).
NOTA: le soluzioni stock di GM-CSF e IL-4 sono conservate rispettivamente a -80 gradi centigradi a -80.000 U/mL (1.000x) e 10.000 U/mL (1.000x). - Distribuisci le cellule in 6 piastre di coltura ben a 4 mL/pozzo e colture le cellule a 37 e 5% CO2 per 48 h.
- Rimuovere le cellule non aderenti con pipettaggio delicato.
- Aggiungere un nuovo mezzo di coltura cellulare CM-10-R contenente i valori GM-CSF (100 U/mL) e IL-4 (10 U/mL). Coltura le cellule per altri 48 h.
- Raccogliere cellule non aderenti (BMC) per la trasduzione da parte del virus lenti-CYP-ALDH.
3. Trasduzione di controller di dominio con il virus lenticchio-CYP-ALDH per generare cellule DC-CYP-ALDH
- Preparare 1 x 106 dC/pozzo in un volume totale di 0,5 mL di CM-10-R misura di coltura cellulare contenente 50 -L di virus e 8 g/mL di protamina in una piastra di coltura a 6 pozze.
- Colture le cellule a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 24 h.
- Sostituire il mezzo con un nuovo mezzo di coltura cellulare CM-10-R e le cellule a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per altri 24 h. A questo punto, è possibile valutare le attività ezymatiche di 1-idrossilasi e RALDH2 (vedere il passaggio 4). Se necessario, ripetere i passaggi da 3.1 a 3.3 per una seconda trasduzione.
- Aggiungere il lipopolissaccharide (100 ng/mL) e la coltura delle cellule per 24 h.
- Raccogliere le cellule (cellule DC-CYP-ALDH) per esperimenti.
4. Valutazione dell'iperespresso 1-idrossistio e RALDH2 nelle cellule DC-CYP-ALDH
- Valutazione dell'iperstima dell'iperstima nelle cellule DC-CYP-ALDH
- Seme 1.0 x 106 celle DC-CYP-ALDH /bene in 2 mL di CM-10-R cellulare coltura medio in 12 piastre di coltura bene.
- Aggiungere 25(OH)D alla concentrazione finale di 2,5 m. Incubare le cellule DC-CYP-ALDH per 24 ore.
- Raccogliere i supernatanti e conservarli a -20 gradi centigradi.
- Saggio per 1,25(OH)2D concentrazioni nei supernatanti utilizzando un radioimmunoassay disponibile in commercio (RIA) (vedi Tabella dei materiali).
- Determinare l'espressione di 1-idrossilasi nelle cellule DC-CYP-ALDH mediante lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) utilizzando un anticorpo anti-CYP27B1.
- Valutazione della RALDH2 sovraespressa nelle cellule DC-CYP-ALDH
NOTA: L'espressione e l'attività del RALDH2 sovraespresso sono determinate utilizzando un kit di rilevamento di dishydrogenasi di aldeide commerciale (ALDH) (vedi Tabella dei materiali).- Seme 1 mL di DC-CYP-ALDH o celle di controllo (1 x 105 celle / mL nel buffer di asino) in ciascuno dei due tubi da 5 mL (uno etichettato come "Controllo" e l'altro etichettato come "Test").
- Aggiungere 10 -L di soluzione di ethylaminobenzaldedeide (DEAB) (1,5 mM in 95% di etanolo) a ciascuno dei tubi di controllo e mescolare immediatamente. DEAB è un inibitore RALDH2.
- Aggiungere 5 oL del substrato di fluorescenza RALDH attivato (300 m) alle prove di controllo e di prova e mescolare immediatamente.
- Incubare i tubi per 45 min.
- Pellet le cellule per centrifugazione a 400 x g a 2–8 gradi centigradi per 5 min. Aspirate i supernatanti.
- Ricostituire le cellule in 200 - L di assaggio tampone.
- Tenere le cellule sul ghiaccio e procedere per l'analisi da parte del FACS.
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Representative Results
Le cellule DC-CYP-ALDH hanno espresso una quantità significativamente aumentata di 1 -idrossisciosi. Per determinare se le cellule DC-CYP-ALDH generate da BMDC hanno espresso una quantità significativamente aumentata di 1- idrossiderosi, i BMCC sono stati transdotti con il virus lenticchie-CYP-ALDH per produrre cellule DC-CYP-ALDH derivate dal midollo osseo (cellule BMDC-CYP-ALDH). Successivamente, le cellule BMDC-CYP-ALDH sono state esaminate per l'espressione di 1 -idrossilasi da parte della FACS. I nostri dati hanno mostrato che le cellule BMDC-CYP-ALDH, rispetto alle BMDC parentali, mostravano un'espressione avanzata dell'idrossilasi 1 (Figura 1A). Abbiamo anche determinato l'attività ezimatica dell'idrossilasi 1 - nelle cellule BMDC-CYP-ALDH. A tale scopo, 1,0 x 106 celle BMDC-CYP-ALDH in 2 mL di cm-10-R gamma di coltura cellulare sono state aggiunte in 12 piastre di coltura del pozzo. 25(OH)D è stato poi aggiunto alla coltura cellulare alla concentrazione finale di 2,5 M. Le cellule sono state coltivate a 37 e 5% di CO2 per 24 h e i supernatanti sono stati raccolti per la misurazione di 1,25 (OH)2D utilizzando un radioimmunoassay (RIA). I nostri dati hanno mostrato che 1,25(OH)2concentrazioni di D nei supernatanti di coltura delle cellule BMDC-CYP (BMDC trasserie con il virus lenticchiere-CYP)e le cellule BMDC-CYP-ALDH erano circa 20 volte superioria quelle dei BMDC parentali e delle cellule BMDC-ALDH (BMCDC trasldette con-lentiH).
Le cellule DC-CYP-ALDH hanno espresso una quantità significativamente aumentata di RALDH2. Per determinare se le cellule BMDC-CYP-ALDH hanno espresso una quantità significativamente aumentata di RALDH2, è stato aggiunto un substrato RALDH2 nelle colture cellulari in presenza o assenza dell'inibitore RALDH2 etilobenzaminoaldedeide (DEAB) (15 M). Il prodotto fluorescente mantenuto all'interno delle cellule è stato analizzato dalla FACS. I nostri dati hanno mostrato che le intensità medie di fluorescenza (MfI) delle cellule BMDC-CYP-ALDH erano circa 6 volte superiori a quelle dei BMDC parentali, suggerendo che le cellule BMDC-CYP-ALDH, rispetto ai BMDC parentali, esprimevano un'attività enzimatica RALDH2 significativamente migliorata (Figura 2A,B).
Le cellule DC-CYP-ALDH hanno aumentato l'induzione delle cellule foxp3-CCR9- Gut-homing Treg in vitro. Per verificare se le cellule DC-CYP-ALDH erano in grado di aumentare l'induzione delle cellule treg gut-homing in vitro, abbiamo trasposto cellule DC2.4 (una linea DC derivata dal midollo osseo26,27,28,29), con il virus lentiP-ALDH e generato DC2.4-CYP-ALDH cellule. Successivamente, abbiamo determinato se le cellule DC2.4-CYP-ALDH erano in grado di aumentare l'induzione delle cellule Treg gut-homing in vitro. Di conseguenza, le cellule T ingenuiCD4 - T sono state purificate dai topi C57BL/6. Le cellule T purificatee le cellule T a 5 x 105 cellule/pozzo sono state poi costati con le cellule DC2.4 parentali (1 x 105 cellule/pozzetto) o con le cellule DC2.4-CYP-ALDH (1 x 105 cellule/pozzo) in 24 piastre di coltura ben in un mezzo privo di siero in presenza di un anticorpo monoclonale anti-CD3 (5 g/mL) e il-2 umano ricombinante (50 U/mL). Inoltre, sono stati aggiunti nelle culture 25(OH)D e retinolo a varie concentrazioni. Le cellule sono state incubate a 37 e al 5% di CO2. Cinque giorni dopo, le cellule sono state analizzate dalla FACS per le espressioni del recettore foxp3 e c-c chemiokine tipo 9 (CCR9). I nostri dati hanno mostrato che, in presenza dei substrati, le cellule DC2.4 non hanno modificato in modo significativo l'abbondanza di foxp3-CCR9- cellule nel CD4- popolazioni di cellule T (Figura 3A,B). Al contrario, le cellule DC2.4-CYP-ALDH hanno migliorato significativamente l'abbondanza di foxp3-CCR9, cellule tra le cellule CD4e T. Inoltre, più 25(OH)D aggiunti, maggiore è la capacità delle cellule DC2.4-CYP-ALDH di aumentare l'abbondanza di foxp3-CCR9- cellule tra le cellule CD4- T. Pertanto, i nostri dati supportano che le cellule DC-CYP-ALDH possono aumentare l'induzione delle cellule Treg gut-homing in vitro.
Le cellule DC-CYP-ALDH hanno aumentato l'induzione delle cellule foxp3-CCR9- Gut-homing Treg in vivo. Per determinare se le cellule DC-CYP-ALDH potrebbero aumentare l'induzione delle cellule Treg gut-homing in vivo, abbiamo somministrato intraperitonealmente una delle seguenti cellule nei topi di balb/ c: le cellule DC2.4 parentali, le cellule DC2.4-CYP (DC2.4-CYP tradusse con il virus lenti-CYP-GFP) e le cellule DC-2.4-CYP-ALDH. Quattro giorni dopo l'amministrazione cellulare, i linfonodi mesentici sono stati esaminati dalla FACS (Figura 4A). I nostri dati hanno mostrato che le celle DC2.4-CYP-ALDH, rispetto ai controlli, hanno aumentato significativamente l'abbondanza di foxp3-CCR9- celle tra le celle CD3- T (Figura 4B,C). Sulla base di questi risultati, concludiamo che la somministrazione cellulare DC-CYP-ALDH aumenta significativamente l'induzione delle cellule foxp3-CCR9- T nei tessuti linfoidi periferici.
Figura 1: Le cellule DC-CYP-ALDH hanno espresso una quantità significativamente aumentata di 1-idrossilasi. (A) Le cellule BMDC-CYP-ALDH sono state generate e analizzate dalla FACS. Un grafico FACS rappresentativo mostra l'espressione di 1-idrossilasi nei BMDC parentali e nelle cellule BMDC-CYP-ALDH (gated su cellule vive). (B) È stato aggiunto nelle colture DC 1 -indice idrossilasi (cioè 25(OH)D). 24 h più tardi, i supernatanti sono stati raccolti e 1,25 (OH)2D concentrazioni sono state misurate. I dati mostrano concentrazioni di 1,25(OH)2D nelle colture dei BMDC parentali, delle cellule BMDC-CYP, delle cellule BMDC-ALDH e delle cellule BMDC-CYP-ALDH. < 0,01. test ANOVA. n - 4 . Questa cifra è adattata da Xu et al.6. Diritto d'autore 2019. L'American Association of Immunologist, Inc.
Figura 2: Le cellule DC-CYP-ALDH hanno espresso una quantità significativamente aumentata di RALDH2. (A) Le cellule BMDC-CYP-ALDH sono state generate e analizzate come descritto nel protocollo. I grafici FACS sovrapposti mostrano la fluorescenza degli aminoaceti BODIPY nei BMDC e nelle cellule BMDC-CYP-ALDH in presenza o assenza (-DEAB) dell'inibitore RALHD2 diethylaminobenzaldede (DEAB). (( B) Intensità medie di fluorescenza (MfI) di aminoati BODIPY nei BMDC e nelle cellule BMDC-CYP-ALDH in assenza di DEAB. < 0,05; test t; n - 4 . Questa cifra è adattata da Xu et al.6. Diritto d'autore 2019. L'American Association of Immunologist, Inc.
Figura 3: Le cellule DC-CYP-ALDH hanno aumentato l'induzione delle cellule foxp3-CCR9- Gut-homing Treg in vitro. (A) Le cellule T dell'ingenua CD4 sono state isolate dalle milza del topo C57BL/6. Le cellule CD4e T sono state poi attivate nelle colture da un mAb anti-CD3 (5 g/mL) in presenza delle cellule DC2.4 parentali o DC2.4-CYP-ALDH. Inoltre, le culture sono state aggiunte con le concentrazioni indicate di 25(OH)D e retinolo. Cinque giorni dopo, le cellule sono state raccolte e analizzate dalla FACS per le espressioni di foxp3 e CCR9 in CD3-CD4- popolazione di cellule T. Le trame FACS rappresentative mostrano le espressioni di foxp3 e CCR9 nella popolazione di cellule T cd3-CD4- T. (B) Dati cumulativi da (A). < 0,05; test ANOVA; n - 4 . Questa cifra è adattata da Xu et al.6. Diritto d'autore 2019. L'American Association of Immunologist, Inc.
Figura 4: Le cellule DC-CYP-ALDH hanno aumentato in vivo l'induzione di foxp3-CCR9- cellule Treg gut-homing. (A) I topi di balsamo/c intraperitinalmente (i.p.) hanno ricevuto uno dei seguenti trasferimenti DC (Trasferimento): nessun trasferimento DC (Nessun trasferimento), cellule DC2.4 parentali, cellule DC2.4-CYP e cellule DC2.4-CYP-ALDH. Quattro giorni dopo, i linfonodi mestemerici (MLN) sono stati analizzati dalla FACS. (B) Le trame FACS rappresentative mostrano le espressioni di foxp3 e CCR9 in CD3- popolazione di cellule T. (C) I dati cumulativi di (B) mostrano la percentuale di foxp3-CCR9- celle nella popolazione di celluleT CD3 . Per tutte le analisi, le celle sono state sbarrate sulle cellule CD3e T. Ove applicabile, i dati presentati sono i mezzi : SEM. test ANOVA; n - 4–6. Questa cifra è adattata da Xu et al.6. Diritto d'autore 2019. L'American Association of Immunologist, Inc.
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Discussion
In questo articolo viene descritto l'uso di cellule DC-CYP-ALDH, per aumentare l'induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici. I nostri dati hanno dimostrato che le cellule DC-CYP-ALDH possono sintetizzare localmente alte concentrazioni de novo sia di 1,25 (OH)2D e RA in vitro in presenza di substrati corrispondenti (cioè, 25[OH]D e retinolo, rispettivamente). Poiché sufficienti concentrazioni ematiche di 25(OH)D e retinolo possono essere facilmente raggiunte attraverso i supplementi di vitamina D e A rispettivamente nei pazienti con carenze30,31, ragioniamo che le cellule DC-CYP-ALDH possono aumentare l'induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici quando sono presenti concentrazioni di sangue normali di 25(OH)D e retinolo. Per sostenere questo ragionamento, i nostri dati dimostrano che negli animali sani normali che non hanno carenze di vitamina D e vitamina A, le cellule DC-CYP-ALDH aumentano l'induzione di cellule Treg che esprimono sia molecole regolatorie (cioè foxp3 e IL-10) che un recettore gut-homing (cioè, CCR9). Pertanto, questa tecnologia può essere utilizzata per ulteriori indagini sulle cellule treg gut-homing per il trattamento di IBD.
Un passo critico di questo protocollo è la produzione di virus lenti-CYP-ALDH con alti titers. I titer virus preferiti devono essere 108–109 TUs/mL. Un alto tiboredelone del virus lenticchiere-CYP-ALDH è necessario per un'elevata efficienza di trasduzione nei controller di dominio.
Un'altra fase critica di questo protocollo è l'efficienza della trasduzione nei controller di dominio. Poiché le cellule DC-CYP-ALDH non sono tollerate in vitro in questa tecnologia, è essenziale che il tasso di trasduzione sia superiore al 90% per garantire che le cellule DC-CYP-ALDH possano aumentare in modo efficiente l'induzione delle cellule Treg gut-homing in vivo. Inoltre, le cellule DC-CYP-ALDH possono essere ulteriormente purificate dal FACS prima dell'amministrazione in vivo32 .
Un vantaggio unico di questo protocollo è che le cellule DC-CYP-ALDH non hanno bisogno di essere tolerizzate in vitro prima dell'amministrazione in vivo. Si prevede che le cellule DC-CYP-ALDH, a seguito delle azioni combinate di 1,25(OH)2D e RA, saranno mantenute in stato tolerogenico in vivo perché sia 1,25 (OH)2D che RA hanno dimostrato di tolerizzare i controller di dominio33,34. Pertanto, prevediamo che le cellule DC-CYP-ALDH non avranno problemi di instabilità in un ambiente infiammatorio in vivo.
Attualmente, abbiamo solo dimostrato che le cellule DC-CYP-ALDH possono aumentare la frequenza (numero) delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici e nell'intestino6. Di conseguenza, la funzione regolatore nell'intestino nel suo complesso è migliorata perché la percentuale di cellule Treg nell'intestino è aumentata. La figura 4 mostra che rispetto a quelli con trattamenti di controllo, il trattamento intraperitale con cellule DC-CYP-ALDH ha aumentato significativamente la percentuale di CCR9-foxp3- Treg nei linfonodi mestenei, il che significa che più cellule Treg nei linfonodi meseraici sono in grado di ospitare specificamente nei tessuti intestinali. La figura 4 mostra inoltre che la maggior parte delle cellule T foxp3- T nei linfonodi mesentinei sono negative per CCR9 e quindi non hanno capacità di gut-homing. Tuttavia, se le cellule DC-CYP-ALDH possono anche migliorare la funzione regolatrice di ogni cellula Treg di per sé (come livelli di espressione migliorati di foxp3 e/o IL-10) richiede ulteriori indagini.
I reagenti e i materiali qui descritti sono solo per studi sugli animali. Tuttavia, il protocollo è applicabile per gli studi umani utilizzando reagenti e materiali umani corrispondenti, ad eccezione del fatto che i DC saranno generati da monociti del sangue periferici nell'uomo. L'obiettivo finale di questo protocollo è la generazione di cellule DC-CYP-ALDH di grado clinico per il trattamento dell'IBD.
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Disclosures
I dottori Xiaolei Tang e David J. Baylink sono inventori di un brevetto in attesa relativo a questo studio.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Ufficio dell'Assistente Segretario della Difesa per gli Affari Sanitari attraverso il Peer Reviewed Medical Research Program sotto il premio N. . W81XWH-15-1-0240 (XT). Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelli dell'autore e non sono necessariamente approvati dal Dipartimento della Difesa. Questo lavoro è stato anche parzialmente sostenuto da Research Innovation Grants del Dipartimento di Medicina dell'Università di Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT] e 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
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