Summary
Burada bağırsak-homing düzenleyici T hücre indüksiyon invivo büyütme için bir protokol sıyoruz. Bu protokolde, dendritik hücreler lokal olarak aktif D vitamini (1,25-dihidroksivitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA) de novo yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanır.
Abstract
İnflamatuar barsak hastalığı (IBD) gastrointestinal sistemde (GUT) inflamatuar kronik bir hastalıktır. Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 1.4 milyon IBD hastası bulunmaktadır. Genellikle bağırsak bakterileri için bir disregulated bağışıklık yanıtı hastalığı başlatır ve mukozal epitel bariyeri bozar kabul edilir. Biz son zamanlarda gut-homing düzenleyici T (Treg) hücreleri IBD için umut verici bir tedavi olduğunu göstermektedir. Buna göre, bu makalede gut-homing Treg hücre indüksiyon in vivo büyütme için bir protokol sunar. Bu protokolde, dendritik hücreler iki molekül de novo, aktif D vitamini (1,25-dihidroksyvitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA) yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanır. 1,25(OH)2D ve RA'yı, 1,25(OH)2D'nin düzenleyici moleküllerin ekspresyonunu (örneğin, çatal kafa kutusu P3 ve interlökin-10) ve RA'nın T hücrelerindeki bağırsak-homing reseptörlerinin ekspresyonunu uyarabileceğini gösteren önceki bulgulara dayanarak seçtik. Bu tür mühendislik dendritik hücreleri oluşturmak için, dendritik hücreleri iki geni aşırı eksprese etmek için vermek için lentiviral vektör kullanıyoruz. Genlerden biri, fizyolojik olarak 1,25(OH) 2 D sentezini katalize eden 25-hidroksivitamin D 1α-hidroksilaz kodlayan sitokrom P450 familyası27alt familya 1'dir. Diğer gen aldehit dehidrogenaz 1 aile üyesi A2 retinaldehit dehidrogenaz kodlar 2, fizyolojik RA sentezini katalizler. Bu protokol in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin gelecekteki araştırma için kullanılabilir.
Introduction
İnflamatuar barsak hastalığı (IBD) gastrointestinal sistemde (GUT) inflamatuar kronik bir hastalıktır. Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 1.4 milyon IBD hastası bulunmaktadır. Genellikle bağırsak bakterileri için bir disregulated bağışıklık yanıtı hastalığı başlatır ve mukozal epitel bariyer bozan kabul edilir1,2. Bu nedenle, şu anda mevcut ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı ilaçlar inflamatuar mediatörlerin işlevlerini inhibe veya bağırsak içine bağışıklık hücrelerinin homing engellemek. Ancak, inflamatuar mediatörler ve hedeflenen bağışıklık hücreleri de bağışıklık savunması için gereklidir. Sonuç olarak, inflamatuar arabulucu inhibitörleri sistemik bağışıklık savunma ve bağışıklık hücresi homing blokerler bağışıklık bağışıklık savunma zayıflatmak, her ikisi de ciddi sonuçlara yol açabilir3,4. Buna ek olarak, bağışıklık hücresi homing blokerler de bağırsak içine düzenleyici T homing engelleyebilir (Treg) hücreleri ve dolayısıyla IBD hastalarında zaten tehlikeye bağırsak bağışıklık toleransı kötüleştirebilir. Ayrıca, bağırsak içine Treg hücre homing engelleme de kanda Treg hücrelerinin birikimi nedeniyle sistemik bağışıklık baskılanmasına yol açabilir5. Son olarak, inhibitörler ve blokerler geçici olarak çalışır ve bu nedenle sık sık yönetimgerektirir. Bu inhibitörlerve blokerlerin sık uygulanması daha da istenmeyen yan etkileri şiddetlendirebilir.
Son zamanlarda, potansiyel olarak hafifletmek ve hatta IBD tedavisi için mevcut ilaçlar ile ilişkili yan etkileri ortadan kaldırmak yeni bir strateji önerdi6. Bu strateji periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artar6. Bu stratejinin mantığı gut-homing Treg hücreleri özellikle bağırsak ev ve dolayısıyla sistemik bağışıklık savunma ödün olmayacaktır. Buna ek olarak, Treg hücreleri potansiyel bellek oluşturabilir beri7,8, bağırsak-homing Treg hücreleri potansiyel IBD hastalarında kronik bağırsak iltihabı istikrarlı bir kontrol sağlayabilir ve, bu nedenle, tedavi sık sık uygulanması gerekmez. Ayrıca, bu strateji in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırır bu yana, in vitro oluşturulan Treg hücrelerinin benimseyen transferi ile ilişkili son derece proinflamatuar bir ortamda in vivo instabilite endişe yok9,10. Bu bağlamda, in vitro oluşturulan Treg hücreleri otoimmün hastalıkların tedavisi için önerilen stratejilerden biridir11,12,13 ve nakil reddi14,15. Son olarak, bu stratejide, dendritik hücreler (DCs) iki molekül de novo yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanmış: aktif D vitamini (1,25-dihidroksyvitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA). Biz 1,25 (OH)2D ve RA seçti, çünkü 1,25(OH)2D düzenleyici moleküllerin ekspresyonunu neden olabilir (örneğin, forkhead kutusu P3 [foxp3] ve interlökin-10 [IL-10])16,17 ve RA T hücrelerinde bağırsak-homing reseptörlerinin ekspresyonunu uyarabilir18. Her iki 1.25 (OH)2D ve RA da DCs28,29tolere çünkü, biz mühendislik DC'ler stably vivo bir tolerojenik statüde muhafaza edilecek ve dolayısıyla in vitro tolerojenik DCs (TolDCs)19,20,21oluşturulan in vivo invivo instabilite endişeleri atlatmak neden . Bu bağlamda, TolDCs da Treg hücre fonksiyonları19,20,21in vivo büyütme için önerilen stratejilerden biridir. Bizim akıl desteklemek için, biz mühendislik DC'ler, in vivo teslim üzerine, periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırabilirsiniz göstermiştir6.
Önerilen stratejimizin bir diğer avantajı da 1,25(OH)2D'nin IBD hastalarına fayda sağleyebilecek başka işlevlere sahip olmasıdır. Bu diğer fonksiyonlar antimikrobiyallerin salgılanmasını uyarmak için 1,25 (OH)2D yeteneği içerir22 ve karsinogenez bastırmak için23. Enfeksiyonlar ve kanserler sık lıkla IBD24,25ile ilişkilidir.
1,25(OH)2D ve RA de novo yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretebilir DC'ler oluşturmak için, iki gen aşırı ifade etmek için DC'ler mühendislik için bir lentiviral vektör kullanın. Genlerden biri, fizyolojik olarak 1,25(OH) 2 D sentezini katalize eden 25-hidroksivitamin D 1α-hidroksilaz (1α-hidroksilaz) kodlayan sitokrom P450 familyası27alt familya B üyesi 1 (CYP27B1) dir. Diğer gen aldehit dehidrogenaz 1 aile üyesi A2 (ALDH1a2) retinaldehit dehidrogenaz kodlar 2 (RALDH2), fizyolojik RAsentezinikatalizler 6 .
Gut-homing Treg hücre indüksiyonunun in vivo arttırılması IBD tedavisinde potansiyel olarak önemli olduğundan, aşağıdaki protokolde 1α-hidroksilaz-RALDH2-aşırı ifade edici DC'lerin (DC-CYP-ALDH hücreleri) üretimi için prosedürleri ayrıntılı olarak açıklayacaktır. in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin gelecekteki araştırma için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm in vivo hayvan çalışma protokolleri gözden geçirildi ve Loma Linda Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yanı sıra Hayvan Bakım ve Kullanım İnceleme Ofisi (ACURO) ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materiel Komutanlığı (USAMRMC) tarafından onaylandı Savunma Bakanlığı.
1. Hem 1α-hidroksilaz hem de RALDH2 (lenti-CYP-ALDH Virüs) ifade eden Lentivirüs hazırlanması
- 0. Gün: Sabahın erken saatlerinde CM-10-D hücre kültürü ortamında 293T hücrelerinin 5 x 105 hücre/mL'sini hazırlayın.
- 150 mm x 25 mm kültür yemeklerinde tohum 20 mL/tabak. Kültür hücreleri 37 °C ve 5% CO2 24 h. Birleştirme için ~ 80-90% 24 saat sonra ulaşacaktır.
- 1. Gün: 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl ve 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.1) yapın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
- 2 M CaCl2 yapın ve oda sıcaklığında saklayın.
- Her 150 mm x 25 mm kültür çanağı için steril 50 mL kültür tüpünde DNA çökeltme karışımı hazırlayın. İlk olarak, 2x HBS 1.620 μL, PMD2G 9.5 g (VSVG), 17.5 μg pCMVR8.74 (Capsid), Lenti-CYP-ALDH plazmid 27 μg (hem CYP27B1 ve ALDH1a2 taşıyan bir lentiviral vektör) ekleyin. İkinci olarak, H2O'yı 3,037,5 μL'lik son hacmine ekleyin.
- Son olarak, 202,5 μL 2 M CaCl2 damla ile çözeltiyi 1x HBS ve 125 mM CaCl2son konsantrasyonlarına karıştırArak ekleyin. CaCl2 eklenecek son olmalıdır. Transfeksiyon karışımlarını 20 dk oda sıcaklığında ara sıra karıştırılarak bekletin. Birden fazla 150 mm x 25 mm kültür yemekleri için, buna göre ölçeklendirin.
- 3.240 μL DNA çökeltme karışımını 293T hücreleri içeren 150 mm x 25 mm kültür kabına damla ile ekleyin. DNA yağış karışımı nı eklerken kültür çanamasını yan yana hafifçe döndürün. Yemeği 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
- 2. Gün: Kalsiyum fosfat transfeksiyon çözeltisini çıkarın, 1x PBS ile hafifçe yıkayın ve hücre kültürünü CM-4-D hücre kültürü ortamıyla yeniden besleyin. Hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
- 3. Gün: Steril depolama şişelerinde süpernatantları hasat edin ve 4-8 °C'de saklayın. Taze CM-4-D hücre kültürü ortamı ile hücre kültürünü yeniler. Kültür 37 °C ve 5% CO2 başka bir 24 saat için hücreleri.
- 4. Gün: Supernatants'ı steril saklama şişelerine topin. Supernatants'ı 3. VSVG psödotip virüsünü yoğunlaştırdık, süpernatanları santrifüj tüplere aktarın ve 4 °C'de 24 saat için 4.780 x g'de döndürün.
- Gün 5: Peletkapalı supernatants dökün (pelet genellikle görünür) ve tüpler birkaç dakika steril bir biyogüvenlik kabininde bir kağıt havlu üzerinde drenaj sağlar.
- % 5 gliserol içeren steril PBS ile pipetting tarafından peletre resuspend. Yeniden süspansiyon hacmi 150 mm x 25 mm kültür çanak başına 33,3 μL olacaktır.
- Aliquot 200 μL/tüp ve -80 °C'de saklayın. Titrasyon amacıyla 50 μL/şişeden ayrı bir aliquot yapın. Titers 108-109 transducing birimleri (TUs)/mL aralığında olmalıdır.
- Kültür yemekleri içine çamaşır suyu ekleyin ve onları atın.
NOT: Tüm lentiviral elementler hücrelerde ifade edildikten sonra bu transfektif hücreler protokoldeki en büyük güvenlik sorunudur.
2. Kemik İliği Türemiş DC'lerin (KBMK) Üretimi
- 4-5 Balb/c farelerinden kültürortamınıiçeren 50 mL steril polipropilen tüpe tibias ve femurhasat 6 .
- Tibias ve femurları kültür ortamını içeren 100 mm x 20 mm'lik bir kültür yemeğine aktarın. Diseksiyon makas ve forceps kullanarak tibias ve femurlar kasları gibi dokuları çıkarın.
- Kemik iliği boşluğunu ortaya çıkarmak için tibias ve femurların her iki ucunu kesin.
- 30 G iğneye bağlı 10 mL şırıngada 10 mL kültür ortamı çizin.
- İğneyi kemik iliği boşluğuna dikkatlice yerleştirin ve kemik iliğini temiz bir 50 mL steril polipropilen tüpe boşaltın. Kemik iliğinin tamamen dışarı atıldığından emin olmak için gerekirse bu işlemi tekrarlayın.
- Pelet tarafından kemik iliği hücreleri santrifüj (400 x g) 2-8 °C 5 dk. Aspire supernatant.
- 1x kırmızı kan hücresi lisis tampon 5 mL ile pelet resuspend.
- Ara sıra sallayarak 4-5 dakika oda sıcaklığında hücreleri kuluçkaya yatırın.
- 30 mL kültür ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- 5 dk. CM-10-R hücre kültürü ortamının 10 mL'sinde hücreleri 2-8 °C'de santrifüj (400 x g)ile peletleyin. Gerekirse, hücreler enkaz kaldırmak için 40 μm hücresüz geçilebilir.
- CM-10-R hücre kültür ortamını kullanarak hücre sayısını gerçekleştirin ve hücreleri 1 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın.
- Rekombinant murine granülosit/makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF, son konsantrasyon = 100 U/mL) ve murine interlökin-4 (IL-4, son konsantrasyon = 10 U/mL) ekleyin.
NOT: GM-CF ve IL-4'ün stok çözümleri sırasıyla -80 °C'de 100.000 U/mL (1.000 x) ve 10.000 U/mL (1.000x) olarak saklanır. - Hücreleri 4 mL/kuyuda 6 kuyu kültür plakasına dağıtın ve 48 saat boyunca hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de kültüre alın.
- Yapışmaz hücreleri nazik pipetleme ile çıkarın.
- GM-CSF (100 U/mL) ve IL-4 (10 U/mL) içeren taze CM-10-R hücre kültürü ortamını ekleyin. Kültür başka bir 48 saat için hücreleri.
- Lenti-CYP-ALDH virüsü nün transdüksiyonu için yapışmayan hücreleri (KBM) hasat edin.
3. DC-CYP-ALDH Hücreleri Üretmek için lenti-CYP-ALDH Virüsü ile DC'lerin Transdüksiyonu
- 50 μL virüs ve 8 μg/mL protamin içeren 0,5 mL CM-10-R hücre kültür ortamı hacminde toplam 1 x 106 DC/kuyu hazırlayın.
- 37 °C ve %5 CO2'de 24 saat boyunca hücreleri kültürlendirin.
- Orta yı taze CM-10-R hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat daha pişirin. Bu noktada, 1α-hidroksilaz ve RALDH2 enzimatik faaliyetleri değerlendirilebilir (bkz. adım 4). Gerekirse, ikinci bir transdüksiyon için 3.1-3.3 adımlarını tekrarlayın.
- Lipopolisakkarit (100 ng/mL) ekleyin ve 24 saat boyunca hücreleri kültür.
- Deneyler için hücreleri (DC-CYP-ALDH hücreleri) hasat edin.
4. DC-CYP-ALDH Hücrelerinde Aşırı Ifade Edilen 1α-hidroksilaz ve RALDH2'nin değerlendirilmesi
- DC-CYP-ALDH hücrelerinde aşırı ifade edilen 1α-hidroksilaz değerlendirilmesi
- Tohum 1.0 x 106 DC-CYP-ALDH hücreleri/iyi CM-10-R hücre kültürü orta 2 mL içinde 12 kuyu kültür plakaları içine.
- 2,5 μM'lik son konsantrasyona 25(OH)D ekleyin. DC-CYP-ALDH hücrelerini 24 saat kuluçkaya yatırın.
- Supernatants hasat ve -20 °C'de saklayın.
- Ticari olarak kullanılabilen bir radyoimmünoassay (RIA) kullanarak süpernatantlarda 1,25(OH)2D konsantrasyonları için bir assay (Bkz. Malzeme Tablosu).
- DC-CYP-ALDH hücrelerindeki 1α-hidroksilaz ekspresyonunu floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile bir anti-CYP27B1 antikor kullanarak belirleyin.
- DC-CYP-ALDH hücrelerinde aşırı ifade edilen RALDH2'nin değerlendirilmesi
NOT: Aşırı ifade edilen RALDH2'nin ekspresyonu ve aktivitesi ticari aldehit dehidrogenaz (ALDH) tespit kiti kullanılarak belirlenir (bkz. Malzeme Tablosu).- Dc-CYP-ALDH veya kontrol hücrelerinin tohum 1 mL 'si (1 x 105 hücre/mL, test tamponu) her iki 5 mL'lik tüplerin her birinde (biri "Kontrol" olarak, diğeri ise "Test" olarak etiketlenmiştir).
- Kontrol tüplerinin her birine 10 μL dietilaminobenzaldehit (DEAB) çözeltisi (%95 etanolde 1,5 mM) ekleyin ve hemen karıştırın. DEAB bir RALDH2 inhibitörüdür.
- Kontrol ve Test tüplerine 5 μL aktif RALDH floresan substrat (300 μM) ekleyin ve hemen karıştırın.
- Tüpleri 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- 400 x g'de 2-8 °C'de 5 dk. Aspiratörlere aspirasyon yaparak hücreleri peletleyin.
- 200 μL'lik bir istinat arabelleğindeki hücreleri yeniden oluştur.
- Hücreleri buzda tutun ve FACS tarafından analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DC-CYP-ALDH hücreleri 1α-hidroksilaz miktarının önemli ölçüde arttığını ifade etti. KBM'lerden üretilen DC-CYP-ALDH hücrelerinin 1α-hidroksilaz miktarını önemli ölçüde ifade edip etmediğini belirlemek için, KBM'ler lenti-CYP-ALDH virüsü ile kemik iliği kaynaklı DC-CYP-ALDH hücreleri (BMDC-CYP-ALDH hücreleri) üretmek için transe geçirildi. Daha sonra, BMDC-CYP-ALDH hücreleri FACS tarafından 1α-hidroksilaz ekspresyonu için incelendi. Verilerimiz, BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin ebeveyn KBM'leri ile karşılaştırıldığında, 1α-hidroksilaz(Şekil 1A)gelişmiş ekspresyonu gösterdiğini göstermiştir. Ayrıca BMDC-CYP-ALDH hücrelerinde 1α-hidroksilaz enzimatik aktivitesini belirledik. Bunun için 12 kuyu kültür plakasına CM-10-R hücre kültür ortamının 2 mL'lik 1.0 x 106 BMDC-CYP-ALDH hücresi eklenmiştir. 25(OH)D daha sonra 2.5 μM son konsantrasyonda hücre kültürüne eklendi. Hücreler 37 °C ve %5 CO2 ile 24 saat kültürlendi ve supernatants radyoimmünoassay (RIA) kullanılarak 1,25(OH)2D ölçümü için hasat edildi. Verilerimiz, BMDC-CYP hücrelerinin (BMDC-CYP-GFP virüsü ile transeked) ve BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin kültür süpernatantlarında 1,25(OH)2D konsantrasyonlarının her birinin BMDC'lerden ve BMDC-ALDH hücrelerinden (BMDC-ALDH virüsü ile transekçi) yaklaşık 20 kat daha yüksek olduğunu göstermiştir ( 1 ŞekilBŞekil).
DC-CYP-ALDH hücreleri RALDH2 miktarının önemli ölçüde arttığını ifade etti. BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin önemli ölçüde artmış miktarda RALDH2 ifade edip etmediğini belirlemek için RALDH2 inhibitörü diethylaminobenzaldehit (DEAB) (15 μM) varlığında veya yokluğunda hücre kültürlerine raldh2 substratı eklendi. Hücrelerin içinde tutulan floresan ürün FACS tarafından analiz edildi. Verilerimiz, BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin ortalama floresan yoğunluklarının (MFI) ebeveyn BmDC'lerinden yaklaşık 6 kat daha yüksek olduğunu gösterdi, bu da BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin ebeveyn KBMC'lerine kıyasla önemli ölçüde gelişmiş RALDH2 enzimatik aktivitesini ifade ettiğini düşündürmektedir(Şekil 2A,B).
DC-CYP-ALDH hücreleri foxp3 indüksiyonu artırdı+CCR9+ in vitro gut-homing Treg hücreleri. DC-CYP-ALDH hücrelerinin indüksiyonu in vitro olarak artırıp artıramadığını araştırmak için DC2.4 hücrelerini (kemik iliği kaynaklı DC hattı26,27,28,29),lenti-CYP-ALDH virüsü ile aktardık ve DC2.4-CYP-ALDH hücreleri oluşturduk. Daha sonra, DC2.4-CYP-ALDH hücrelerinin bağırsak-homing Treg hücrelerinin indüksiyonu in vitro artırmak mümkün olup olmadığını belirledik. Buna göre, saf CD4+ T hücreleri C57BL/6 farelerden saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış naif CD4+ T hücreleri 5 x 105 hücre/iyi sonra ya ebeveyn DC2.4 hücreleri (1 x 105 hücreleri / iyi) veya DC2.4-CYP-ALDH hücreleri (1 x ile cokültüred edildi 105 hücre/ iyi) bir anti-CD3 monoklonal antikor (5 μg/mL) ve rekombinant insan IL-2 (50 U/mL) varlığında bir serum içermeyen ortamda 24 iyi kültür plakaları. Ayrıca çeşitli konsantrasyonlarda 25(OH)D ve retinol de kültürlere eklenmiştir. Hücreler 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırıldı. Beş gün sonra, hücreler FACS tarafından foxp3 ve c-c kemokin reseptör tip 9 (CCR9) ifadeleri için analiz edildi. Verilerimiz, substratların varlığında DC2.4 hücrelerininCD4 +T hücre popülasyonlarında foxp3 + CCR9+ hücrelerin bolluğunu önemli ölçüde değiştirmediğini göstermiştir(Şekil 3A,B). Buna karşılık, DC2.4-CYP-ALDH hücreleri önemli ölçüde CD4+ T hücreleri arasında foxp3+CCR9+ hücrelerin bolluğu arttı. Buna ek olarak, daha fazla 25 (OH)D eklendi, DC2.4-CYP-ALDH hücrelerinin yeteneği cd4+ T hücreleri arasında foxp3+CCR9+ hücrelerin bolluğunu artırmak için daha fazla yeteneği. Bu nedenle, verilerimiz DC-CYP-ALDH hücrelerinin bağırsak-homing Treg hücrelerinin indüksiyonu in vitro artırabilirsiniz destek.
DC-CYP-ALDH hücreleri invivo foxp3+CCR9+ gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırDı. DC-CYP-ALDH hücrelerinin indüksiyonu in vivo olarak artırıp artıramayacağını belirlemek için, intraperitoneal olarak aşağıdaki hücrelerden birini Balb/c farelere uyguladık: ebeveyn DC2.4 hücreleri, DC2.4-CYP hücreleri (DC2.4 hücreleri lenti-CYP-GFP virüsü ile transetilmiştir) ve DC-2.4-CYP-ALDH hücreleri. Hücre yönetiminden dört gün sonra mezenterik lenf nodları FACS(Şekil 4A)ile incelendi. Verilerimiz, DC2.4-CYP-ALDH hücrelerinin kontrollere kıyasla, CD3+ T hücreleri arasında foxp3+CCR9+ hücrelerin bolluğunu önemli ölçüde artırdığını göstermiştir(Şekil 4B,C). Bu sonuçlara dayanarak, DC-CYP-ALDH hücre uygulamasının periferik lenfoid dokularda foxp3+CCR9+ T hücrelerinin indüksiyonuna neden olduğu sonucuna varıldı.
Şekil 1: DC-CYP-ALDH hücreleri 1α-hidroksilaz miktarının önemli ölçüde arttığını ifade etti. (A) BMDC-CYP-ALDH hücreleri FACS tarafından üretildi ve analiz edildi. Temsili bir FACS çizimebeveyn BMDC ve BMDC-CYP-ALDH hücreleri (canlı hücreler üzerinde kapılı) 1α-hidroksilaz ifadesini gösterir. (B) 1α-hidroksilaz substratı (yani, 25(OH)D) DC kültürlerine eklendi. 24 saat sonra süpernatantlar toplandı ve 1,25(OH)2D konsantrasyonu ölçüldü. Veriler, ebeveyn BmDC'lerin, BMDC-CYP hücrelerinin, BMDC-ALDH hücrelerinin ve BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin kültürlerinde 1,25(OH)2D konsantrasyonlarını göstermektedir. **p < 0.01. ANOVA testi. n = 4 olarak Bu rakam Xu ve ark.6'danuyarlanmıştır. Telif Hakkı 2019. Amerikan Bağışıkolog Derneği, Inc Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: DC-CYP-ALDH hücreleri RALDH2 miktarının önemli ölçüde arttığını ifade etti. (A) BMDC-CYP-ALDH hücreleri protokolde açıklandığı şekilde oluşturuldu ve analiz edildi. Temsili overlaid FACS arsalar Varlığı NDA BMDC-CYP-ALDH hücreleri (+DEAB) veya yokluğu (-DEAB) RALHD2 inhibitörü diethylaminobenzaldehit (DEAB) BODIPY aminoasetat floresans göstermektedir. (B) DEAB yokluğunda BMDC-CYP-ALDH hücrelerinde BODIPY aminoasetat ortalama floresan yoğunlukları (MFIs). *p < 0.05; t-testi; n = 4 olarak Bu rakam Xu ve ark.6'danuyarlanmıştır. Telif Hakkı 2019. Amerikan Bağışıkolog Derneği, Inc Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DC-CYP-ALDH hücreleri foxp3+CCR9+ gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyonu in vitro artırıldı. (A) CD4+ naif T hücreleri C57BL/6 fare dalaklarından izole edildi. CD4+ T hücreleri daha sonra bir anti-CD3 mAb (5 μg/mL) ya ebeveyn DC2.4 hücreleri veya DC2.4-CYP-ALDH hücreleri varlığında kültürlerde aktive edildi. Ayrıca, kültürler 25 (OH)D ve retinol belirtilen konsantrasyonları ile eklendi. Beş gün sonra hücreler CD3 +CD4 +T hücre popülasyonundaki foxp3 ve CCR9 ifadeleri için FACS tarafından toplandı ve analiz edildi. Temsilci FACS çizimleri CD3 +CD4 +T hücre popülasyonlarında foxp3 ve CCR9 ifadelerini gösterir. (B) (A)kümülatif veri. *p < 0.05; ANOVA testi; n = 4 olarak Bu rakam Xu ve ark.6'danuyarlanmıştır. Telif Hakkı 2019. Amerikan Bağışıkolog Derneği, Inc Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: DC-CYP-ALDH hücreleri foxp3+CCR9+ gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyonu invivo artırıldı. (A) Balb/c farelerintraperitoneally (i.p.) aşağıdaki DC transferlerinden birini (Transfer): DC transferi (transfer yok), ebeveyn DC2.4 hücreleri, DC2.4-CYP hücreleri ve DC2.4-CYP-ALDH hücrelerini aldı. Dört gün sonra mezenterik lenf nodları (MLN) FACS tarafından incelendi. (B) Temsilci FACS çizimleri CD3+ T hücre popülasyonundaki foxp3 ve CCR9 ifadelerini gösterir. (C) (B) gelen kümülatif verilerCD3 + T hücre popülasyonundaki foxp3+CCR9+ hücrelerin yüzdesini gösterir. Tüm analizler için hücreler CD3+ T hücrelerine geçit lendi. Uygun olduğu durumlarda, sunulan veriler ± SEM anlamına gelir. *p < 0.05; ANOVA testi; n = 4-6 olarak Bu rakam Xu ve ark.6'danuyarlanmıştır. Telif Hakkı 2019. Amerikan Bağışıkolog Derneği, Inc Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, dc-CYP-ALDH hücrelerinin kullanımı açıklanır, periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırmak için. Verilerimiz DC-CYP-ALDH hücrelerinin sırasıyla 1,25(OH)2D ve RA in vitro yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda sentezleyebildiği gösterilmiştir (sırasıyla 25[OH]D ve retinol). 25(OH)D ve retinol yeterli kan konsantrasyonları kolayca eksikliği olan hastalarda sırasıyla D vitamini ve A takviyesi ile elde edilebilir çünkü30,31, biz DC-CYP-ALDH hücreleri periferik lenfoid dokularda bağırsak homing Treg hücrelerinin indüksiyon uyğun artırmak neden 25 (OH)D ve retinol normal kan konsantrasyonları mevcut olduğunda. Bu akıl yürütmeyi desteklemek için, verilerimiz D vitamini ve A vitamini eksikliği olmayan normal sağlıklı hayvanlarda, DC-CYP-ALDH hücrelerinin hem düzenleyici molekülleri (yani foxp3 ve IL-10) hem de bağırsak-homing reseptörü (yani, CCR9) ifade Treg hücrelerinin indüksiyonu artırmak olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, bu teknoloji IBD tedavisi için gut-homing Treg hücrelerinin daha fazla araştırma için kullanılabilir.
Bu protokolün kritik adımlarından biri yüksek titrelerle lenti-CYP-ALDH virüsü üretimidir. Tercih edilen virüs titreleri 108-109 TUs/mL olmalıdır. DC'lerde yüksek transdüksiyon verimi için lenti-CYP-ALDH virüsünün yüksek bir titreti gereklidir.
Bu protokolün bir diğer kritik adımı da DC'lerde transdüksiyon verimliliğidir. DC-CYP-ALDH hücreleri bu teknolojide in vitro olarak tolere edilmediğinden, DC-CYP-ALDH hücrelerinin indüksiyonu indüksiyonu etkin bir şekilde arttırabilmek için transdüksiyon oranının %90'dan fazla olması esastır. Buna ek olarak, DC-CYP-ALDH hücreleri daha fazla in vivo uygulama32önce FACS tarafından saflaştırılmış olabilir.
Bu protokolün benzersiz bir avantajı DC-CYP-ALDH hücrelerinin in vivo uygulamadan önce in vitro tolere edilmesi gerekmez olmasıdır. Dc-CYP-ALDH hücrelerinin, 1,25(OH)2D ve RA'nın kombine eylemleri sonucunda, 1,25(OH)2D ve RA'nın TOLere33,34'ü tolere ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, DC-CYP-ALDH hücrelerinin in vivo proinflamatuar bir ortamda istikrarsızlık endişeleri olmayacağını öngörüyoruz.
Şu anda, biz sadece DC-CYP-ALDH hücrelerinin frekansını artırabilir göstermiştir (sayı) periferik lenfoid dokuve bağırsaklarda bağırsak homing Treg hücrelerinin sayısı6. Sonuç olarak, bağırsaklarda Treg hücrelerinin yüzdesi arttığı için bir bütün olarak bağırsaklarda düzenleyici fonksiyon geliştirilmiştir. Şekil 4 kontrol tedavileri ile karşılaştırıldığında, DC-CYP-ALDH hücreleri ile intraperitoneal tedavi önemli ölçüde mezenterik lenf düğümlerinde CCR9+foxp3+ Treg hücrelerinin yüzdesini artırdı gösterir, mezenterik lenf düğümlerinde daha Fazla Treg hücreleri özellikle bağırsak dokularına ev edebiliyoruz anlamına gelir. Şekil 4 daha mezenterik lenf düğümlerinde en foxp3+ T hücrelerinin CCR9 için negatif olduğunu ve bu nedenle gut-homing kapasitesine sahip olmadığını göstermektedir. Ancak, DC-CYP-ALDH hücrelerinin her Treg hücresinin düzenleyici işlevini kendi başına geliştirip geliştiremeyeceği (foxp3 ve/veya IL-10'un gelişmiş ifade düzeyleri gibi) daha fazla araştırma gerektirir.
Burada açıklanan reaktifler ve malzemeler sadece hayvan çalışmaları içindir. Ancak, protokol insan reaktifleri ve malzemeleri kullanılarak insan çalışmaları için geçerlidir, dcs insanlarda periferik kan monositleri üretilecektir dışında. Bu protokolün nihai hedefi IBD tedavisi için klinik sınıf DC-CYP-ALDH hücrelerinin üretimidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Xiaolei Tang ve David J. Baylink bekleyen bir patent bu çalışma ile ilgili mucitler vardır.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sağlık İşleri Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi tarafından Ödül No altında Peer Reviewed Tıbbi Araştırma Programı ile desteklenmiştir. W81XWH-15-1-0240 (XT). Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve öneriler yazarın görüşleridir ve Savunma Bakanlığı tarafından mutlaka onaylanmaz. Bu çalışma aynı zamanda Kısmen Loma Linda Üniversitesi Tıp Bölümü (681207-2967 [XT ve GG], 681205-2967 [XT] ve 325491 [DJB] Araştırma Yenilik Hibetarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
