Summary
Aqui apresentamos um protocolo para o aumento in vivo da ininvitro-homing indução de células T regulamentares. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir localmente altas concentrações da vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e a vitamina A ativa (ácido retinoico ou AR) de novo.
Abstract
A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa. Recentemente, mostramos que as células reguladoras t (Treg) são uma terapia promissora para a DII. Assim, este artigo apresenta um protocolo para o aumento in vivo da indução da pilha de Treg gut-homing. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo, vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e vitamina a-ida ativa (ácido retinóico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e AR com base em descobertas anteriores mostrando que 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeça de garfo P3 e interleucina-10) e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal nas células T. Para gerar tais células dendríticas projetadas, usamos um vetor lentiviral para transduzir células dendríticas para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase, que fisiologicamente catalisa a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 que codifica retinaldeído dehidrogenase 2, que fisiologicamente catalisa a síntese de AR. Este protocolo pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.
Introduction
A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa1,2. Por esta razão, atualmente disponíveis E.U. Food and Drug Administration (FDA) medicamentos aprovados inibem as funções dos mediadores inflamatórios ou bloquear o homing de células imunes no intestino. No entanto, os mediadores inflamatórios e células imunes que são alvo também são necessários para defesas imunológicas. Como resultado, os inibidores do mediador inflamatório comprometem a defesa imunológica sistêmica e os bloqueadores de homing de células imunes enfraquecem a defesa imunológica do intestino, ambos os quais podem levar a graves conseqüências3,4. Além disso, os bloqueadores de homing de células imunes também podem bloquear o homing de células reguladoras T (Treg) no intestino e, portanto, pode piorar a tolerância imune do intestino já comprometida em pacientes com DII. Além disso, o bloqueio de células Treg homing no intestino também pode levar à supressão imunológica sistêmica devido ao acúmulo de células Treg no sangue5. Finalmente, inibidores e bloqueadores funcionam de forma transitória e, assim, exigem administrações frequentes. A administração freqüente desses inibidores e bloqueadores pode exacerbar ainda mais os efeitos colaterais desagradáveis.
Recentemente, propusemos uma nova estratégia que pode potencialmente mitigar ou até mesmo eliminar os efeitos colaterais associados com medicamentos atuais para o tratamento de DII6. Esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing em tecidos linfóides periféricos6. A lógica desta estratégia é que as células Treg gut-homing especificamente lar do intestino e, portanto, não irá comprometer as defesas imunológicas sistêmicas. Além disso, uma vez que as células Treg podem potencialmente formar memória7,8,células Treg gut-homing pode potencialmente fornecer um controle estável da inflamação crônica do intestino em pacientes com DII e, assim, o tratamento não deve precisar ser administrado com tanta freqüência. Além disso, uma vez que esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing in vivo, não tem a preocupação de instabilidade in vivo em um ambiente altamente pró-inflamatório que está associado com a transferência adotiva de células Treg geradas in vitro9,10. A este respeito, as células Treg in vitro geradas são uma das estratégias propostas para o tratamento de doenças autoimunes11,12,13 e rejeição de transplante14,15. Finalmente, nesta estratégia, as células dendríticas (DCs) são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo: vitamina D ativa (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) e vitamina ativa A (ácido retinoico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e RA porque 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeceira P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal em células T18. Porque ambos 1,25 (OH)2D e RA também podem tolerizar DCs28,29, razão que os DCs projetados serão mantidos de forma evigorada em um status tolerogênico in vivo e,portanto,contornar as preocupações de instabilidade in vivo que estão associados com DCs tolerogenic in vitro gerados (TolDCs)19,20,21. A este respeito, toldcs também são uma das estratégias propostas para in vivo aumento das funções celulares Treg19,20,21. Para apoiar o nosso raciocínio, mostramos que os DCs projetados, após a entrega in vivo, podem aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos6.
Uma vantagem adicional de nossa estratégia proposta é que 1,25 (OH)2D também tem outras funções que podem beneficiar potencialmente pacientes com DII. Essas outras funções incluem a capacidade de 1,25 (OH)2D para estimular a secreção de antimicrobianos22 e suprimir a carcinogênese23. Infecções e cânceres são freqüentemente associados à DII24,25.
Para gerar os DCs que podem produzir concentrações localmente altas de 1,25 (OH)2D e RA de novo, usamos um vetor lentiviral para projetar DCs para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase (1α-hidroxilase), que catalisa fisiologicamente a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 (ALDH1a2) que codifica retinaldeído dehidrogenase 2 (RALDH2), que fisiologicamente catalisa a síntese de RA6.
Como o aumento in vivo da inin vivo de indução de células Treg de homing intestinal é potencialmente importante no tratamento da DII, no seguinte protocolo, detalharemos os procedimentos para a geração das DCs de 1α-hidroxilase-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.
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Protocol
Todos os protocolos in vivo de estudo animal foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Loma Linda (IACUC), bem como pelo Animal Care and Use Review Office (ACURO) do Comando de Pesquisa médica e Material do Exército dos EUA (USAMRMC) do Departamento de Defesa.
1. Preparação do Lentivirus que expressa 1α-hydroxylase e RALDH2 (vírus lenti-CYP-ALDH)
- Dia 0: No início da manhã, prepare 5 x 105 células/mL de células 293T no meio de cultura celular CM-10-D.
- Semente 20 mL/prato em pratos de cultura de 150 mm x 25 mm. Cultura as células em 37 °C e 5% CO2 para 24 h. Confluência vai chegar a ~ 80-90% após 24 h.
- Dia 1: Faça 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl e 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquot e armazenar a -20 °C.
- Faça 2 M CaCl2 e guarde à temperatura ambiente.
- Para cada prato de cultura de 150 mm x 25 mm, prepare uma mistura de precipitação de DNA em um tubo de cultura estéril de 50 mL. Primeiro, adicione 1.620 μL de 2x HBS, 9,5 μg de PMD2G (VSVG), 17,5 μg de pCMVR8.74 (Capsid), 27 μg de Lenti-CYP-ALDH plasmid (um vetor lentiviral que transporta cyp27b1 e ALDH1a2). Em segundo lugar, adicione o H2O a um volume final de 3.037,5 μL.
- No último, adicione 202,5 μL de 2 M CaCl2 dropwise ao misturar a solução para concentrações finais de 1x HBS e 125 mM CaCl2. CaCl2 deve ser o último a ser adicionado. Deixe as misturas de transfecção à temperatura ambiente por 20 min com mistura ocasional. Para vários pratos de cultura de 150 mm x 25 mm, a uscale em conformidade.
- Adicione os 3.240 μL da mistura da precipitação do ADN dropwise a um prato da cultura de 150 mm x 25 milímetros que contem as pilhas 293T. Delicadamente redemoinho o prato cultura lado a lado, acrescentando a mistura de precipitação de DNA. Incubar o prato em 37 °C e 5% CO2 para 24 h.
- Dia 2: Retire a solução de transfecção de fosfato de cálcio, lave suavemente com 1x PBS e realiça a cultura celular com meio de cultura celular CM-4-D. Incubar as células a 37 °C e 5% CO2 para 24 h.
- Dia 3: Colha as supernatantes em garrafas de armazenamento estéreis e guarde a 4-8°C. Reabastecer a cultura celular com o novo meio de cultura de células CM-4-D. Cultura as células em 37 °C e 5% CO2 para mais 24 h.
- Dia 4: Colha as supernatantes em garrafas de armazenamento estéreis. Filtre os supernatants do dia 3 e do dia 4 através de um filtro de 0,45 μm. Para concentrar o vírus pseudotipo VSVG, transfira as supernatantes para tubos de centrífuga e gire a 4.780 x g para 24 h a 4 °C.
- Dia 5: Despeje os supernatants fora das pelotas (a pelota é muitas vezes visível) e permitir que os tubos para drenar em uma toalha de papel em um armário de biossegurança estéril por vários minutos.
- Resuspenda as pelotas por pipetting com PBS estéril contendo 5% glicerol. O volume de resuspensão será de 33,3 μL por prato de cultura de 150 mm x 25 mm.
- Aliquot 200 μL/tubo e armazenar a -80 °C. Faça um alibamento separado de 50 μL/frasco para fins de titration. Os titers devem estar dentro da escala de 108-109 unidades transducing (TUs)/mL.
- Adicione a lixívia nos pratos de cultura e descartá-los.
NOTA: Estas células transfeccionadas são a maior preocupação de segurança no protocolo, uma vez que todos os elementos lentivirais são expressos nas células.
2. Geração de DCs derivados da medula óssea (BMDCs)
- Tibias colheita e fêmures de 4-5 ratos Balb / c em um tubo de polipropileno estéril de 50 mL contendo o meio de cultura6.
- Transfira o tibias e os fêmures em um prato da cultura de 100 mm x 20 mm que contem o meio da cultura. Retire os tecidos, como os músculos do tibias e fêmures usando tesoura dissecando e fórceps.
- Corte ambas as extremidades do tibias e fêmures para expor a cavidade da medula óssea.
- Desenhe 10 mL cultura média em uma seringa de 10 mL ligado a uma agulha de 30 G.
- Insira cuidadosamente a agulha na cavidade da medula óssea e lave a medula óssea em um tubo de polipropileno estéril de 50 mL limpo. Repita este procedimento, se necessário, para garantir que a medula óssea tenha sido completamente eliminada.
- Pelotas as células da medula óssea por centrífuga (400 x g)a 2-8 °C para 5 min. Aspirar o supernatant.
- Resuspenda a pelota com 5 mL de 1x de r$-teto de glóbulo vermelho.
- Incubar as células em temperatura ambiente por 4-5 min com agitação ocasional.
- Pare a reação adicionando 30 mL do meio da cultura.
- Pelotas as células por centrífuga (400 x g)em 2-8 °C para 5 min. Resuspender as células em 10 mL de CM-10-R meio de cultura celular. Se necessário, as células podem ser passadas através de um filtro de células de 40 μm para remover detritos.
- Executar uma contagem celular e ajustar as células para 1 x 106 células/mL usando cm-10-R célula si médio.
- Adicione fator estimulante recombinante de granulócito de murine/macrofago (GM-CSF, concentração final = 100 U/mL) e interleucina-4 (IL-4, concentração final = 10 U/mL).
NOTA: As soluções de ações da GM-CSF e IL-4 são armazenadas a -80 °C a 100.000 U/mL (1.000x) e 10.000 U/mL (1.000x), respectivamente. - Distribua as células em 6 placas de cultura de poços a 4 mL/bem e cultura as células a 37 °C e 5% CO2 para 48 h.
- Remova as células não aderentes com tubulação suave.
- Adicione o novo meio de cultura de células CM-10-R contendo o GM-CSF (100 U/mL) e il-4 (10 U/mL). Cultura as células para mais 48 h.
- Colhe células não aderentes (BMDCs) para transdução pelo vírus lenti-CYP-ALDH.
3. Transdução de DCs com vírus lenti-CYP-ALDH para gerar células DC-CYP-ALDH
- Prepare 1 x 106 DCs/bem em um volume total de 0,5 mL de m-10-R de cultura celular médio contendo 50 μL de vírus e 8 μg/mL protamina em uma placa de cultura de 6 poços.
- Cultura as células em 37 °C e 5% CO2 para 24 h.
- Substitua o meio por um meio fresco de cultura de células CM-10-R e cultura as células em 37 °C e 5% CO2 para mais 24 h. Neste momento, as atividades enzimáticas de 1α-hidroxilase e RALDH2 podem ser avaliadas (ver passo 4). Se necessário, repita os passos 3,1-3,3 para uma segunda transdução.
- Adicione o lipopolissacarídeo (100 ng/mL) e cultura as células para 24 h.
- Colher as células (células DC-CYP-ALDH) para experimentos.
4. Avaliação das 1α-hidroxilase superexpressa e RALDH2 nas células DC-CYP-ALDH
- Avaliação do 1α-hidroxilase superexpressa em células DC-CYP-ALDH
- Semente 1.0 x 106 células DC-CYP-ALDH/bem em 2 mL de mL de m-10-R de cultura celular em 12 placas de cultura de poços.
- Adicione 25 (OH)D à concentração final de 2,5 μM. Incubar as células DC-CYP-ALDH por 24 h.
- Colher os supernatants e armazenar a -20 °C.
- Ensaio para 1,25 (OH)2D concentrações nos supernatants usando um radioimmunoassay comercialmente disponível (RIA) (ver Tabela de Materiais).
- Determine a expressão de 1α-hidroxilase nas células DC-CYP-ALDH por triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) usando um anticorpo anti-CYP27B1.
- Avaliação do RALDH2 superexpressa nas células DC-CYP-ALDH
NOTA: A expressão e atividade do RALDH2 superexpressa são determinadas usando um kit de detecção de aldeído dehidrogenase comercial (ALDH) (ver Tabela de Materiais).- Semente 1 mL de DC-CYP-ALDH ou células de controle (1 x 105 células/mL no buffer de ensaio) em cada um dos dois tubos de 5 mL (um rotulado como "Controle" e o outro rotulado como "Teste").
- Adicione 10 μL de solução diethylaminobenzaldeída (DEAB) (1,5 mM em 95% etanol) a cada um dos tubos de controle e misture imediatamente. Deab é um inibidor RALDH2.
- Adicione 5 μL de substrato de fluorescência RALDH ativado (300 μM) aos tubos de controle e teste e misture imediatamente.
- Incubar os tubos por 45 min.
- Pelotas as células por centrífuga em 400 x g em 2-8 °C para 5 min. Aspirar os supernatants.
- Reconstitua as células em 200 μL de buffer de ensaio.
- Mantenha as células no gelo e proceder para análise pela FACS.
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Representative Results
As células DC-CYP-ALDH expressaram um aumento significativo na quantidade de 1α-hidroxilase. Para determinar se as células DC-CYP-ALDH geradas a partir de BMDCs expressaram um aumento significativo da quantidade de 1α-hidroxilase, os BMDCs foram transinduzidos com o vírus lenti-CYP-ALDH para produzir células DC-CYP-ALDH derivadas de medula óssea (células BMDC-CYP-ALDH). Posteriormente, as células BMDC-CYP-ALDH foram examinadas para a expressão de 1α-hidroxilase pela FACS. Nossos dados mostraram que as células BMDC-CYP-ALDH, quando comparadas aos BMDCs parentais, apresentaram maior expressão da 1α-hidroxilase (Figura 1A). Também determinamos a atividade enzimática das 1α-hidroxilase nas células BMDC-CYP-ALDH. Para fazer isso, 1,0 x 106 células BMDC-CYP-ALDH em 2 mL de mL de m-10-R de cultura celular média foram adicionados em 12 placas de cultura bem. 25 (OH)D foi então adicionado à cultura celular na concentração final de 2,5 μM. As células foram cultivadas a 37 °C e 5% DECO 2 por 24 h e os supernatantes foram colhidos para a medição de 1,25 (OH)2D usando um radioimmunoassay (RIA). Nossos dados mostraram que 1,25 (OH)2Concentrações D nas supernatantes culturais das células BMDC-CYP (BMDCs transduced with lenti-CYP-GFP virus) e as células BMDC-CYP-ALDH foram aproximadamente 20x maiores do que as dos BMDCs parentais e das células BMDC-ALDH (BMDCs transinduzidas com o vírus quari-ALDH) ( Figura BDH) ( Figura BDH) (FiguraBDH).
As células DC-CYP-ALDH expressaram um aumento significativo na quantidade de RALDH2. Para determinar se as células BMDC-CYP-ALDH expressaram um aumento significativo da quantidade de RALDH2, um substrato RALDH2 foi adicionado às culturas celulares na presença ou ausência do inibidor de RALDH2 diethylaminobenzaldeído (DEAB) (15 μM). O produto fluorescente retido dentro das células foi analisado pela FACS. Nossos dados mostraram que as intensidades médias de fluorescência (MFIs) das células BMDC-CYP-ALDH foram aproximadamente 6x maiores do que as dos BMDCs parentais, sugerindo que as células BMDC-CYP-ALDH, quando comparadas aos BMDCs parentais, expressaram atividade enzimática RALDH2 significativamente aprimorada (Figura 2A,B).
As células DC-CYP-ALDH aumentaram a indução de células treg foxp3+CCR9+ gut-homing in vitro. Para investigar se as células DC-CYP-ALDH foram capazes de aumentar a indução de células Treg de calagem in vitro, transduzimos células DC2.4 (uma linha DC derivada da medula óssea26,27,28,29), com o vírus lenti-CYP-ALDH e geramos células DC2.4-CYP-ALDH. Posteriormente, determinamos se as células DC2.4-CYP-ALDH foram capazes de aumentar a indução de células Treg de calagem in vitro. Assim, as células CD4+ T ingênuas foram purificadas de camundongos C57BL/6. As células CD4+ T ingênuas purificadas em 5 x 105 células/poço foram então coculturadas com as células DC2.4 parentais (1 x 105 células/poço) ou as células DC2.4-CYP-ALDH (1 x 105 células/poço) em 24 placas de cultura de poços em meio livre de soro na presença de um anticorpo monoclonal anti-CD3 (5 μg/mL) e IL-2 humano recombinante (50 U/mL). Além disso, 25 (OH)D e retinol em várias concentrações também foram adicionados às culturas. As células foram incubadas a 37 °C e 5% DE CO2. Cinco dias depois, as células foram analisadas pela FACS para as expressões do receptor de quimioterapia foxp3 e c-c tipo 9 (CCR9). Nossos dados mostraram que, na presença dos substratos, as células DC2.4 não alteraram significativamente a abundância de foxp3+CCR9+ células nas populações de células T CD4+ T (Figura 3A,B). Em contraste, as células DC2.4-CYP-ALDH aumentaram significativamente a abundância de células foxp3+CCR9+ entre as células CD4+ T. Além disso, quanto mais 25 (OH)D adicionados, maior a capacidade das células DC2.4-CYP-ALDH de aumentar a abundância de células foxp3+CCR9+ entre as células CD4+ T. Portanto, nossos dados suportam que as células DC-CYP-ALDH podem aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal in vitro.
As células DC-CYP-ALDH aumentaram a indução de células de Foxp3+CCR9+ treg de calagem in vivo. Para determinar se as células DC-CYP-ALDH poderiam aumentar a indução das células Treg de nivelamento in vivo, administramos intraperitoneally uma das seguintes células em camundongos Balb/c: as células DC2.4 parentais, as células DC2.4-CYP (células DC2.4 transduzidas com vírus lenti-CYP-GFP) e as células DC-2.4-CYP-ALDH. Quatro dias após a administração celular, os gânglios linfáticos mesentéricos foram examinados pela FACS (Figura 4A). Nossos dados mostraram que as células DC2.4-CYP-ALDH, quando comparadas aos controles, aumentaram significativamente a abundância de células foxp3+CCR9+ entre células CD3+ T (Figura 4B,C). Com base nesses resultados, concluímos que a administração celular DC-CYP-ALDH aumenta significativamente a indução de células foxp3+CCR9+ T em tecidos linfóides periféricos.
Figura 1: As células DC-CYP-ALDH expressaram um aumento significativo na quantidade de 1α-hidroxilase. (A)As células BMDC-CYP-ALDH foram geradas e analisadas pela FACS. Um gráfico facs representativo mostra a expressão de 1α-hidroxilase nos BMDCs parentais e nas células BMDC-CYP-ALDH (fechadas em células vivas). (B) substrato 1α-hidroxilase (ou seja, 25 (OH)D) foi adicionado às culturas DC. 24 h mais tarde, os supernatants foram coletados e 1.25 (OH)2D concentrações foram medidas. Os dados mostram concentrações de 1,25 (OH)2D nas culturas dos BMDCs parentais, das células BMDC-CYP, das células BMDC-ALDH e das células BMDC-CYP-ALDH. **p< 0,01. Teste ANOVA. n = 4. Este número é adaptado de Xu et al.6. Direitos autorais de 2019. A Associação Americana de Imunologista, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As células DC-CYP-ALDH expressaram um aumento significativo da quantidade de RALDH2. (A)As células BMDC-CYP-ALDH foram geradas e analisadas conforme descrito no protocolo. As parcelas facs sobrepostas representativas mostram a fluorescência de aminoatotototo nos BMDCs e nas células BMDC-CYP-ALDH na presença (+DEAB) ou ausência (-DEAB) do dietilolobenzaldeído inibidor ralhd2 (DEAB). (B) Intensidades médias de fluorescência (MFIs) de aminoatotos BODIPY nos BMDCs e nas células BMDC-CYP-ALDH na ausência de DEAB. *p< 0,05; t-teste; n = 4. Este número é adaptado de Xu et al.6. Direitos autorais de 2019. A Associação Americana de Imunologista, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: As células DC-CYP-ALDH aumentaram a indução de foxp3+CCR9+ células Treg de calagem intestinal in vitro. (A) As células T CD4+ ingênuas foram isoladas dos baços do rato C57BL/6. As células CD4+ T foram então ativadas em culturas por um mAb anti-CD3 (5 μg/mL) na presença das células DC2.4 parentais ou das células DC2.4-CYP-ALDH. Além disso, as culturas foram adicionadas com as concentrações indicadas de 25 (OH)D e retinol. Cinco dias depois, as células foram coletadas e analisadas pela FACS para as expressões de foxp3 e CCR9 na população de células CD3+CD4+ T. As parcelas representativas da FACS mostram as expressões de foxp3 e CCR9 nas populações de células CD3+CD4+ T. (B) Dados cumulativos de (A). *p< 0,05; Teste ANOVA; n = 4. Este número é adaptado de Xu et al.6. Direitos autorais de 2019. A Associação Americana de Imunologista, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: As células DC-CYP-ALDH aumentaram a indução de foxp3+CCR9+ células Treg de intestino-homing in vivo. (A) Os ratos Balb/c intraperitoneally (i.p.) receberam uma das seguintes transferências da C.C(Transferência): nenhuma transferência da CC (nenhuma transferência), pilhas parentais de DC2.4, pilhas de DC2.4-CYP, e PILHAS DC2.4-CYP-ALDH. Quatro dias depois, os gânglios linfáticos mesentéricos (MLNs) foram analisados pela FACS. (B) As parcelas representativas da FACS mostram as expressões de foxp3 e CCR9 na população de células CD3+ T. (C)Dados cumulativos de (B)mostram o percentual de foxp3+CCR9+ células na população de células CD3+ T. As células foram fechadas em células CD3+ T para todas as análises. Quando aplicável, os dados apresentados são significa ± SEM. *p < 0,05; Teste ANOVA; n = 4-6. Este número é adaptado de Xu et al.6. Direitos autorais de 2019. A Associação Americana de Imunologista, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo descrevemos o uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos. Nossos dados mostraram que as células DC-CYP-ALDH podem sintetizar concentrações localmente altas de novo de 1,25 (OH)2D e AR in vitro na presença de substratos correspondentes (ou seja, 25[OH]D e retinol, respectivamente). Porque concentrações sanguíneas suficientes de 25 (OH) D e retinol podem ser facilmente alcançadas através de suplementações de vitamina D e A, respectivamente, em pacientes que têm deficiências30,31, razão mosquedamos que as células DC-CYP-ALDH podem aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos quando concentrações normais de sangue de 25 (OH) D e retinol estão presentes. Para apoiar esse raciocínio, nossos dados demonstram que em animais saudáveis normais que não têm deficiências de vitamina D e vitamina A, as células DC-CYP-ALDH aumentam a indução de células Treg que expressam ambas as moléculas regulatórias (ou seja, foxp3 e IL-10) e um receptor de intestino-homing (ou seja, CCR9). Portanto, esta tecnologia pode ser usada para uma investigação mais aprofundada das células Treg gut-homing para o tratamento de DII.
Um passo crítico deste protocolo é a produção do vírus lenti-CYP-ALDH com alto arrisco. Os titers de vírus preferidos devem ser 108-109 TUs/mL. É necessário um alto díterdo do vírus lenti-CYP-ALDH para uma alta eficiência de transdução em DCs.
Outro passo crítico desse protocolo é a eficiência da transdução em DCs. Como as células DC-CYP-ALDH não são tolerizadas in vitro nesta tecnologia, é essencial que a taxa de transdução seja superior a 90% para garantir que as células DC-CYP-ALDH possam aumentar eficientemente a indução das células Treg de calagem in vivo. Além disso, as células DC-CYP-ALDH podem ser ainda mais purificadas pela FACS antes da administração in vivo32.
Uma vantagem única deste protocolo é que as células DC-CYP-ALDH não precisam ser tolerizadas in vitro antes da administração in vivo. Espera-se que as células DC-CYP-ALDH, como resultado das ações combinadas de 1,25 (OH)2D e RA, serão mantidas em um status tolerogênico in vivo porque ambos 1,25 (OH)2D e RA foram mostrados para tolerizar DCs33,34. Portanto, prevemos que as células DC-CYP-ALDH não terão preocupações de instabilidade em um ambiente próinflamatório in vivo.
Atualmente, só demonstramos que as células DC-CYP-ALDH podem aumentar a frequência (número) de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos e intestinos6. Consequentemente, a função regulatória nos intestinos como um todo é aumentada porque a porcentagem de células Treg nos intestinos é aumentada. A figura 4 mostra que, quando comparado s aqueles com tratamentos de controle, o tratamento intraperitoneal com células DC-CYP-ALDH aumentou significativamente a porcentagem de células CCR9+foxp3+ Treg nos gânglios linfáticos mesentéricos, o que significa que mais células Treg nos gânglios linfáticos mesentéricos são capazes de especificamente casa nos tecidos intestinais. A figura 4 mostra ainda que a maioria das células foxp3+ T nos gânglios linfáticos mesentéricos são negativas para CCR9 e, portanto, não têm capacidade de intestino-homing. No entanto, se as células DC-CYP-ALDH também podem melhorar a função regulatória de cada célula Treg em si (como níveis de expressão aprimorados de foxp3 e/ou IL-10) requer uma investigação mais aprofundada.
Os reagentes e materiais descritos aqui são apenas para estudos em animais. No entanto, o protocolo é aplicável para estudos em humanos usando reagentes e materiais humanos correspondentes, exceto que os DCs serão gerados a partir de monócitos de sangue periférico em seres humanos. O objetivo final deste protocolo é a geração de células clínicas DC-CYP-ALDH para o tratamento da DII.
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Disclosures
Os Drs. Xiaolei Tang e David J. Baylink são inventores de uma patente pendente relacionada a este estudo.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Escritório do Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde através do Peer Reviewed Medical Research Program no âmbito do Prêmio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este trabalho também foi parcialmente apoiado por Bolsas de Inovação em Pesquisa do Departamento de Medicina da Universidade de Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT], e 325491 [DJB]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
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