Summary
Vi presenterar ett protokoll för utvinning av murina cerebrala pericyter. Baserat på ett antibiotikum-fri berikande pericytbiologi extraktion, detta protokoll är ett värdefullt verktyg för in vitro-studier som ger hög renhet och hög avkastning, vilket minskar antalet försöksdjur som används.
Abstract
Under de senaste åren, cerebrala pericyter har blivit fokus för omfattande forskning inom vaskulär biologi och patologi. Vikten av pericyter i blod-hjärnbarriären bildas och fysiologi är nu visat, men dess molekylära bas är fortfarande i stort sett okänd. Som den patofysiologiska roll cerebral pericyter i neurologiska sjukdomar är spännande och av stor betydelse, in vitro-modellerna är inte bara tillräckligt lämpligt men också kunna införliva olika tekniker för dessa studier. Flera metoder har föreslagits som in vitro-modeller för extraktion av cerebral pericyter, även om ett antibiotikum-fritt protokoll med hög effekt är önskvärt. Viktigast av allt, en metod som har ökat produktionen per extraktion minskar användningen av fler djur.
Här föreslår vi en enkel och effektiv metod för att utvinna cerebrala pericyter med tillräckligt hög effekt. Musen hjärnvävnad Homogenatet blandas med en BSA-dextran lösning för separation av vävnaden skräp och mikrovaskulär pellet. Vi föreslår en separation i tre steg följt av filtrering för att få ett mikrokärl rikt filtrat. Med denna metod är den mängd mikrovaskulära fragment som erhålls från 10 möss tillräcklig för att utsäde 9 brunnar (9,6 cm2 vardera) av en 6-brunn tallrik. Mest intressant med detta protokoll, kan användaren få 27 pericytbiologi rika brunnar (9,6 cm2 vardera) i passage 2. Renheten av pericytkulturerna bekräftas med uttrycket av klassiska pericytmarkörer: NG2, PDGFR-β och CD146. Denna metod visar ett effektivt och genomförbart in vitro-verktyg för fysiologiska och patofysiologiska studier på pericyter.
Introduction
Cerebral pericyter är en viktig del av neurovaskulär enhet (NVU), som omfattar en funktionell enhet med cerebrala endotelceller i blod-hjärnbarriären (BBB), gliaceller, extracellulär matris och nervceller. Pericyter är en viktig del i reglerad funktion i centralanervsystemet (CNS) som de fungerar som ett av gränssnitten för utbyte av molekylära och cellulära information.
Cerebral pericyter är inbäddade i abluminal sidan av hjärnans mikrokärl, och är viktiga för att fastställa1 och bibehålla2 BBB-fysiologi. Flera nya verk har också belyst rollen av cerebral pericyter i angiogenes3 och kärl mognad4, endotelceller morfogenes5 och överlevnad6, och för att kontrollera hjärnans kolesterol metabolism7. Viktigt är dysregleringen i någon av dessa processer etiologiska kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar.
I själva verket är pericyter en funktionell nödvändighet för normal BBB funktion och dess skydd mot utvecklingen av flera neurologiska sjukdomar. Degenerering fysiologi och förlust av pericyter är gemensamma nämnare i utvecklingen av Alzheimers sjukdom8, neuronala förlust under vit substans dysfunktion9, multipel skleros10, septisk encefalopati11, akut fas ischemisk stroke12 och i andra neurologiska sjukdomar. Pericyter är också avgörande i tumörmetastaser13. Intressant, pericyter har också visat sig uppvisa en undsättning roll efter neurologiska trauma och störningar: i remyelinisering i hjärnan1, ischemisk stroke, ryggmärgsskada14 och främja angiogenes15. Känsligheten hos pericyter för att förstärka den patofysiologiska manifestationen av neurologiska trauma och störningar gör dem till ett potentiellt terapeutiskt mål16.
In vitro-forskning modeller av pericyter i BBB är viktiga verktyg för att genomföra omfattande studier. Dessa modeller ger en plattform för mer avancerade studier genom att representera arbetsmodeller av BBB och mer. Till exempel kan dessa modeller användas för att förstå cellulär fysiologi inom pericyter och bland andra celltyper av NVU. Även in vitro-modeller är förstahands granskning verktyg för att testa den farmakologiska påverkan av nya läkemedel och molekyler på pericyter. Dessa modeller kan också användas för att förstå den patofysiologiska rollen av pericyter i relation till neurologiska sjukdomar. Utvecklingen av in vitro-modeller kräver dock ökad produktion för att möjliggöra experimentell frihet. Dessa modeller ska vara enkla och snabba, och minska antalet försöksdjur som används. Dessutom är förmågan att utveckla sådana modeller till en dubbel-och tredubbla cellkultur modeller önskvärt.
Det finns många protokoll som har utvecklats. De protokoll som föreslagits av Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20och Crouch och DOETSCH21 är lovvärda metoder som tillfredsställer de flesta nödvändigheter. Alla dessa metoder ger effektiva resultat, men beroendet av ett stort antal försöksdjur är fortfarande en gemensam nämnare för dessa protokoll. Därför blir det obligatoriskt att utveckla en hög produktionsmetod som kan isolera och rena pericyter med maximal möjlig verkningsgrad. I detta protokoll verifieras renheten hos de celler som erhålls efter en andra passage med flera pericytmarkörer. Vi kontrollerade för trombocyt-härledda tillväxtfaktor receptor-β (PDGFR-β), som används som en klassisk markör av pericyter17, och för NG2 (neuron-Glial antigen 2), som är en markör för pericytbiologi medierad vaskulär morfogenes22 och vaskularisering23. Vi kontrollerade också för kluster av differentiering 146 (CD 146), som har rapporterats som en av de molekyler som uttrycks i pericyter17,18.
Här presenterar vi ett protokoll för utvinning av primära pericyter från möss (vildtyp eller transgenik) som kommer att tillfredsställa alla ovan nämnda krav med hög effekt. Vi använder ett antibiotikum och immunopanning fri urvals-baserad metod för spridning för de primära hjärn pericyter, som kommer att visa sig vara en effektiv modell för att genomföra in vitro-studier.
Protocol
Alla experiment utfördes efter institutets riktlinjer för användning och hantering av djur. I enlighet med den franska lagstiftningen har djuranläggningen vid universitetet i Artois godkänts av de lokala myndigheterna (referens: B62-498-5). I enlighet med EU-lagstiftningen (direktiv 2010/63/EU) godkändes alla förfaranden av den lokala djur omsorgs-och användnings kommittén (Comité D' ethique en Expérimentation animale du Nord-Pas-de-Calais, referens: C2EA 75) och det franska forskningsministeriet (referens: 2015090115412152).
1. beredning av lösningar
- Bered 500 mL tvättbuffert A (WBA): 10 mM HEPES lösning i Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS). Förvaras vid 4 ° c.
- Bered 500 mL tvättbuffert B (WBB): 0,1% bovint serumalbumin (BSA) med 10 mM HEPES lösning i HBSS. Förvaras vid 4 ° c.
- Bered 300 mL 30% dextran-lösning i WBA genom att blanda lösningen över natten vid rumstemperatur. Autoklav lösningen vid 110 ° c i 30 min före användning. Efter autoklavering, låt lösningen vila i rumstemperatur för 2-3 h. Förvara lösningen vid 4 ° c.
- Förbered 100 mL av 0,1% BSA lösning i kallt dextran lösning. Skaka kraftigt i 3-4 min och förvara vid 4 ° c.
- Förbered komplett Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) kultur Media genom att lösa upp 20% kalv serum, 2 mM glutamin, 50 μg/mL gentamycin, 1% vitaminer, 2% aminosyror basal medium Eagle (BME) i basal DMEM media och förvara vid 4 ° c. Tillsätt 1 ng/mL grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) före användning.
- Förbered hela pericytbiologi Media genom att lägga till pericytbiologi tillväxt kosttillskott (försedd med pericytbiologi Media) och 20% fetalt kalv serum (FCS) i pericytbiologi kultur basal media och lagra vid 4 ° c.
2. hjärnvävnad återhämtning och avlägsnande av hjärnhinnorna
- För konsekvens, använda möss i samma ålder och samma kön i varje parti av extraktion. Använd ett patogen fritt djurskydd och ge AD libitum tillgång till vatten. För att säkerställa effektivitet och minimal användning av djur, undvika förlust av vävnadsmaterial.
- Euthanize C57BL/6J, 4-6 veckor gammal, hanmöss (janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Frankrike).
- Snabbt punktskatter hjärnvävnaden i sterila förhållanden, undvika skador på vävnaden. Placera försiktigt vävnaden i 40 mL kallfosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Överför hjärnvävnaden i kallt PBS till en petriskål (100 mm x 15 mm).
- Placera hjärnvävnaden på en steril torr luddfri torka och med böjda spetstång, ta bort lillhjärnan, striatum och occipital nerver.
- Ta bort alla synliga hjärnhinnorna med en bomullspinne. Placera hjärnvävnaden upp och ner och öppna loberna med en bomullspinne med hjälp av utåtgående ljus slag. Ta bort alla synliga blodkärl.
- Placera hjärnhinnorna fria hjärnvävnad i en petriskål (100 mm x 15 mm) med 15 ml kallt WBB.
3. homogenisering
- Överför vävnaden till en Dounce Tissue Grinder murbruk röret och tillsätt 3-4 mL WBB med pincett.
- Finhacka vävnaden med en "Lös" mortelstöt 55 gånger. Skölj den "lösa" mortelstöt med WBB. Nu färs flytgödsel med en "tight" mortelstöt 25 gånger.
- Fördela flytgödsel lika i 2 50 mL rör och tillsätt 1,5 x volym av kallt 30% BSA-dextran, kraftigt skaka rören för att blanda flytgödsel.
4. isolering av den vaskulära fraktionen
- Efter kraftig skakning av rören, Centrifugera rören i 25 minuter vid 3 000 x g och 4 ° c.
- Överför supernatanten (tillsammans med det översta myelin-skiktet) till två nya tuber och centrifugera rören i 25 minuter vid 3 000 x g och 4 ° c. Bevara pellets från den första centrifugering genom att tillsätta 3 mL kallt WBB (behåll pelleten vid 4 ° c).
- Upprepa steg 4,2 och försiktigt bevara pellets från 2nd centrifugering.
- Kassera dextran och myelin med vävnads skräp från rören från steg 4,3. Bevara pellets i kallt WBB.
- Pool innehållet i röret 1 och röret 2 från steg 4,1 och göra upp till slutlig volym av 10 mL med kallt WBB.
- Upprepa detta steg för rör från steg 4,2 och steg 4,3.
Notera: Slutligen finns det 3 rör från 3 centrifugationer. - Separera pelleten med 6 upp-och nedslag med en 10 mL pipett, tills inga synliga klumpar av pelletar återstår.
- Med hjälp av en vakuum filter montering och nylon mesh filter, filtrera cellsuspensioner av varje rör.
Anmärkning: detta filtrerings steg är viktigt för att ta bort längre/större fartyg via nätfiltret. - Återhämta sig och Omsuspendera kapillärerna genom att skrapa filtret med hjälp av en platt spets pinps eller en skrapa i WBB vid rumstemperatur. Filtrera suspensionen med ett nytt filter för att återvinna fler kapillärer
- Fördela filtratet jämnt i två rör och Centrifugera i 7 min vid 1 000 x g och RT.
Anmärkning: Bered den enzymatiska lösningen under detta centrifugeringssteg. Bestäm vilken volym av WBB som krävs i enlighet med antalet djur som används (se tabell över material). Tillsätt 1x av DNase 1 och 1x av Tosyl-L-lysyl-klorometerhydroklorid (TLCK) (se tabell över material) i WBB och Förvärm till 37 ° c. - Samla pellets från steg 4,10 i ett rör med förvärmda WBB med enzymer. Lägg till förvärmda 1x kollagenas/dispase. Placera röret i skakbordet vattenbad vid 37 ° c för exakt 33 min.
- Stoppa enzym reaktionen genom att tillsätta 30 mL kallt WBB. Centrifugera fjädringen i 7 min vid 1 000 x g och RT.
- Kassera supernatanten noggrant och separera pelleten i WBB med 6 upp-och nedslag med en 10 mL pipett. Detta steg bör vara mindre rigorösa och jämförelsevis snabbare.
- Centrifugera fjädringen i 7 min vid 1 000 x g och RT.
Notera: under detta steg, kassera beläggningen från kultur rätterna och skölj dem en gång med DMEM vid rumstemperatur. Coat cellkultur rätter för minst 1 h vid RT. - Kassera supernatanten från röret som erhållits i steg 4,14, och separera pelleten i nya kompletta DMEM-medier, platta cellerna (dag 0, P0) i 9 brunnar med 6-borrplattor (1 brunn på 9,6 cm2 vardera).
5. spridning av cerebrala pericyter
- Bibehålla cellkulturerna vid 37 ° c och 5% CO2 i en steril inkubator. Ersätt kulturen media efter 24 h (dag 1) av plätering cellerna genom att försiktigt ta bort skräp. Efter dag 1, ändra kulturen media i varje 48 h.
- Observera cellkulturen i minst 7-8 dagar. Vid denna tid, cellulära utväxter på toppen av endotelceller unilayer bör vara observerbara.
- Passage cellerna på dag 8-10 (beroende på confluency) i pericytbiologi kultur medium till passage 1 (P1) på gelatin belagda kultur plattor. Ändra kulturen media i varje 2 dagar. Observera cellerna för 6-7 dagar. Celler i följd delas igen till passage 2 (P2) på dag 17 [och passage 3 (P3) på dag 24 endast om så krävs], odlas i pericytbiologi medium i gelatin belagda plattor.
Anmärkning: cellerna skall vara redo för experiment/observation vid nästan 80-90% sammanlänkning.
Representative Results
Detta protokoll (figur 1) ger effektivt 9 brunnar (av 6-borrplattor) vid tidpunkten för sådd vid P0 (figur 2a (P0: dag 1)).
Från P0 till P2, det finns specifika morfologiska egenskaper genom vilka endotelceller (indikeras med vita pilar) och s gradvis ökning av pericyter (indikeras med svarta pilar) kan observeras. I P0, de långsträckta endotelceller som utvecklas från mikrofartyg är i överflöd (figur 2A, P0: dag 3), medan överflödet av sådana avlånga celler reduceras i P1 och frånvarande i P2. Tvärtom uppträder pericyterna som fyrsidiga celler som är rikligt förekommande i P2 (figur 2A, P2: dag 18).
För att bekräfta renhet av pericytbiologi kulturen i P2, kontrollerade vi uttrycket av NG2, CD146 och PDGFR-beta som pericytbiologi markörer med hjälp av kvantitativ PCR (figur 2B), vävnad (figur 2C), och västra blot (figur 3). Pericyter i P2 uttrycker högre halter av CD146, NG2 och PDGFR-β jämfört med uttrycket i total mushjärna (MS br) extrakt. Som en kontroll, uttryck av endotelceller markörer occludin och CD31, astrocyter markör Glial fibrillary sura protein (gfap) och mikroglia markör CD11b observerades också frånvarande i P2.
Figur 1: Sammanfattning av protokollet. Denna kontur representerar kritiska steg för pericytbiologi utvinning som börjar med vävnad sönderfall med glas mortelslipmaskin följt av 3-stegs separation i dextran och filtrering. Detta protokoll sysselsätter en 33 min enzym digestionssteg. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: cellernas morfologi och markörer uttryck. A) faskontrast bilder av pericyter i P0-, P1-och P2-stadier av proliferation. Rikliga endotelceller i P0 indikeras med vita pilar. Deras antal minskade i P1 och de har försvunnit i P2. Pericyter indikeras med svarta pilar. B) analys av CD146-, NG2-och PDGFR-β-uttrycket med PCR i pericyter i P2 med pericyter i P1-och mushjärna (MS br)-prover. C) representativa bilder av pericyter i P2 som uppvisar positiv IMMUNFÄRGNING av CD146, PDGFR-β och, NG2. Skalbar: 50 μm (20x förstoring) och 20 μm (40x förstoring). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: cell kulturernas representativa renhet. Analys av CD146, PDGFR-β, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b och tubulin uttryck av Western blotting i pericyter i P2 och mushjärna (MS br) prover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativ jämförelse av olika metoder för vävnadens sönderfall, rening, berikning och enzymatisk nedbrytning. Varje publicerat protokoll sammanfattas med indikationer på antalet djur som används för varje protokoll. Utgångar indikeras också med avseende på antalet brunnar som erhålls vid sådd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Cerebral pericyter är en integrerad del av NVU och spela en aktiv roll i induktion och underhåll av BBB24. Likaså, den roll som dessa celler i olika neurodegenerativa sjukdomar och vaskulära patologier är spännande. Därför, en effektiv hög effekt primära pericytbiologi cell modellen kommer att ge en effektiv plattform för in vitro-studier.
Det finns olika protokoll som har föreslagits för isolering av primära pericyter (figur 4). Tigges et al.17 föreslog en metod inklusive kortikal vävnad med hjärnhinnorna. Detta tillvägagångssätt är tenderization av vävnad från 6 möss (en 37 ° c, 70 min matsmältning med papain/DNase enzymer) följt av ett sönderfall steg via 21 G och 18 G nålar. Detta protokoll föreslår en enstegs separation (centrifugering i 22% BSA/PBS-lösning) som ger minst 2 kollagen I belagda brunnar av en 6-brunn tallrik. Cellerna bibehålls i endotelceller celltillväxt medium (ecgm) tills passage 3 och senare i pericytbiologi Growth medium (PGM) för passaging celler att främja pericytbiologi proliferation. I ett annat liknande tillvägagångssätt föreslog Chen et al.18 vävnads dissociation genom att tärning vävnaden med ett steriliserat rakblad och vävnadsnedbrytning med kollagenas/DNase för 90 min vid 37 ° c. Efter en-stegs separation (centrifugering i 22% BSA) av cellerna avlägsnas myelin-skiktet och pelleten tvättas två gånger i ECGM. Mikrokärlen är klädd i 3 brunnar av ett kollagen I belagda 6-well tallrikar. Efter att ha nått Confluence, cellerna är blint två gånger och senare upprätthålls i PGM. I slutändan, om celler överförs i förhållande till 3, kan vi få 27 brunnar av 6-bra tallrikar endast vid användning av 10 möss i början av protokollet.
I Thomsen et al., författarna föreslår isolering av cerebral pericyter via en två-stegs enzym nedbrytning19. Hjärnhinnorna och den vita materian avlägsnas, och hjärnproverna skärs i små bitar. Vävnads bitarna genomgår den första enzym reaktionen i kollagenas/DNase I för 75 min vid 37 ° c, efter ett steg av separationen i 20% BSA. Pelleten samlas in och smälts vidare i kollagenas/dispase/DNase i för 50 min vid 37 ° c. Detta steg följs av mikrokärl separation i en 33% percoll lutning och ytterligare tvättas en gång. Mikrokärlen är seedade på kollagen IV/fibronectin belagda 35 mm rätter. Spridningen av pericyter gynnas av 10% FCS och gentamicinsulfat i DMEM i 10 dagar. I en annan två-stegs enzym uppslutning tillvägagångssätt, Yamazaki et al. föreslå malning av den exciderade vävnaden i kallt DMEM20. I den första enzym reaktionen behandlas proverna med kollagenas/DNase I för 75 min vid 37 ° c. Efter en stegcentrifugering tvättas pelleten igen en gång och en andra enzym reaktion initieras i kollagenas/dispase för 60 min vid 37 ° c. Efter en separering i ett steg återsuspenderas pelleten och centrifugeras i 22% BSA-lösning. Slutligen, den mikrovaskulära pelleten är återsuspenderade och pläterade i en 6-brunn tallrik. För 5 mus hjärnor, 1 brunn av en 6-bra tallrik kan pläteras. För att få pericyter, endotelceller kulturer är blint tre gånger bibehålls i mus hjärnan endotelceller cell (mbec) medium II. Crouch och DOETSCH20 föreslå pericytbiologi reningsmetod av FACS. Vävnadsprover från cortex och ventrikulär – subventrikulär zon av mushjärna är mikro-dissekeras och malet grundligt med en skalpell. Efter kollagenase/dispase enzym inkubation i 30 min vid 37 ° c separeras smält vävnaden från myelin och skräp centrifugeras i en 22% v/v Percoll lösning. Cellsuspensionen inkuberas sedan i fluorescerande konjugerade antikroppar för FACS-analys och sortering. De sorterade cellerna är pläterade i kollagen belagda brunnar av 24 väl tallrik. Det föreslås att en cortex ger tillräckligt med celler för en plätering i 1 väl av 24-brunn tallrik.
Även om produktiva, dessa metoder kommer med flera begränsningar, från användning av stort antal djur för enstaka parti isolering till en mycket begränsad mängd produktion.
Under utvecklingen av detta föreslagna protokoll, var vi framgångsrika i att få hög effekt: 9 brunnar av en 6-brunn tallrik från så få som 10 möss. För detta ändamål, avlägsnande av hjärnhinnorna säkerställer ett steg avlägsnande av stora fartyg från vävnaden. Den Dounce Tissue Grinder är lämpligare för mjuk vävnad såsom hjärnan. Det ger också prov reduktion med den lösa mortelstöt, homogenisering med den snäva mortelstöt, och förhindrar onödiga cellulära skador. Ett av de viktigaste målen i primär cellkultur protokoll är det minimala avfallet av vävnad och utökad hämtning av cerebral vasculature. I det presenterade protokollet uppnås detta genom upprepad centrifugering av det dextran-BSA-infunderade vävnads Homogenatet. En trestegs centrifugering metod hjälper till att återvinna stora mängder av kärl från vävnaden homogenate. Detta ger en 3x förbättrad återhämtning av mikrofartyg. Efter separation, filtrering är nästa viktiga steg, som gynnar uteslutning av glatta muskelceller associerade stora fartyg. Som nämnts innan en kombination av olika enzymer har föreslagits för enzymatisk matsmältning. Medan DNase och kollagenase/dispase används för att minska klumpar av celler och isolera enskilda celler respektive, det är mycket viktigt att förhindra celldöd i en sådan invasiv miljö och detta förhindras av TLCK, som därmed ökar den slutliga avkastningen. Inledningsvis är den första passagen får växa en endotelial monolayer, som senare stöder tillväxten av bifogade pericyter på unilayer. Eftersom överlevnaden av primära endotelceller reduceras vid passaging, det ökar sannolikheten för pericytbiologi återhämtning. Dessutom använder detta protokoll en annan passaging som säkerställer undvikande av endotelcell förorening. Det bör noteras att med ett högre antal celler från P2 reduceras beroendet av ytterligare passaging av cellerna. Dessutom, det minskar risken för att pericytbiologi tillväxt övertas av släta muskelceller, som förökar sig på mycket högre takt.
För att uppnå en högre effekt, det finns flera steg som är kritiska och bör utföras korrekt med avseende på temperatur och tid. Blandningen av vävnads homogena i BSA-dextran bör vara snabb. Pelletdissociationen efter centrifugeringsstegen ska vara snabb för att förhindra celldöd. Dessutom, 33 min av enzymatisk matsmältning bör göras med precision och omsorg. En av begränsningarna för detta protokoll är den 7-8 dagars varaktighet som endotelceller unilayer tillåts växa och ytterligare underlätta tillväxten av pericyter. Uppenbarligen är isoleringen av mikrofartyg btter, tillväxten av unilayer är snabbare, och därmed finns det ett ökat antal pericyter. Det rekommenderas att inte använda mindre än 10 möss i varje extraktion för att säkerställa ett tillräckligt antal mikrovaskulära fraktioner för att stödja tillväxten av pericytbiologi ytterligare. Om de ovan nämnda punkterna följs noggrant, kan den önskade CELLTÄTHETEN för cerebral pericytbiologi kultur lätt uppnås.
In vitro-modeller ger en genomförbar plattform för utveckling av derivat modeller för att få mer information om den patofysiologiska relevansen och kommunikationen mellan de andra cellerna i NVU under neurologiska störningar. Isolerade pericyter kan införlivas i en bi-cellulär kultur (med endoteliala eller gliaceller) och Tri-cellulära kulturen (endotelceller och gliala celler) modeller. Utvecklingen av dessa modeller har inte diskuterats här. Sammanfattningsvis, detta protokoll ger en metod för isolering av primära celler med högre produktion och en bättre plattform för in vitro-forskning i samband med cerebral pericytbiologi biologi.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
LT och FG beviljades av Agence nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) inom ramen för EU: s gemensamma program – neurodegenerativ sjukdoms forskning (JPND) för projektet SNOWBALL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
- Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
- Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106 (2017).
- Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
- Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
- Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
- Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932 (2013).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
- Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
- Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
- Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385 (2016).
- Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
- Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
- Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
- Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
- Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
- Armulik, A., et al.
