Summary
Vi præsenterer en protokol til udvinding af murine cerebral pericytes. Baseret på en antibiotika-fri berigelse orienteret pericyte udvinding, denne protokol er et værdifuldt værktøj til in vitro-undersøgelser, der giver høj renhed og højt udbytte, og dermed reducere antallet af forsøgsdyr anvendes.
Abstract
I de seneste år, cerebral pericytes er blevet fokus for omfattende forskning i vaskulær biologi og patologi. Betydningen af pericytes i blod-hjerne barrieren dannelse og fysiologi er nu demonstreret, men dens molekylære grundlag er stadig stort set ukendt. Da den patofysiologiske rolle cerebral pericytes i neurologiske lidelser er spændende og af stor betydning, in vitro-modeller er ikke kun tilstrækkeligt passende, men også i stand til at indarbejde forskellige teknikker til disse undersøgelser. Flere metoder er blevet foreslået som in vitro-modeller til udvinding af cerebrale pericytes, selv om en antibiotikum-fri protokol med høj produktion er ønskelig. Vigtigst er det, en metode, der har øget output pr udvinding reducerer brugen af flere dyr.
Her foreslår vi en enkel og effektiv metode til udvinding af cerebrale pericytes med tilstrækkelig høj ydelse. Musens hjernevæv homogenatet blandes med en BSA-dextran opløsning til adskillelse af vævs rester og microvaskulær pellet. Vi foreslår en tretrins adskillelse efterfulgt af filtrering for at opnå en Micro Vessel rige filtrat. Med denne metode er mængden af microvaskulære fragmenter opnået fra 10 mus tilstrækkelig til at frø 9 brønde (9,6 cm2 hver) af en 6-brønd plade. Mest interessant med denne protokol, kan brugeren få 27 pericyte rige brønde (9,6 cm2 hver) i passage 2. Renheden af pericyte kulturer er bekræftet med udtrykket af klassiske pericyte markører: NG2, PDGFR-β og CD146. Denne metode viser et effektivt og gennemførligt in vitro-værktøj til fysiologiske og patofysiologiske undersøgelser på pericytes.
Introduction
Cerebral pericytes er en væsentlig bestanddel af den neurovaskulære enhed (NVU), som omfatter en funktionel enhed med de cerebrale endotelceller i blod-hjerne barrieren (BBB), gliale celler, ekstracellulære matrix og neuroner. Pericytes er en vital del i reguleret funktion af centralnervesystemet (CNS), da de tjener som en af grænsefladerne til udveksling af molekylære og cellulære oplysninger.
Cerebral pericytes er indlejret i den abluminale side af hjernens mikrofartøjer, og er afgørende for at etablere1 og vedligeholde2 BBB fysiologi. Flere nylige værker har også fremhævet rollen af cerebral pericytes i angiogenese3 og fartøj modning4, endotel morfogenesis5 og overlevelse6, og i at kontrollere hjernen kolesterol metabolisme7. Det er vigtigt, at dysreguleringen i nogen af disse processer er etiologiske kendetegn ved neurodegenerative sygdomme.
Faktisk, pericytes er en funktionel nødvendighed for normal BBB funktion og dens beskyttelse mod progression af flere neurologiske sygdomme. Degenererede fysiologi og tab af pericytes er fællesnævnere i progression af Alzheimers sygdom8, neuronal tab under hvidt stof dysfunktion9, multipel sklerose10, septisk encephalopati11, akut fase iskæmisk slagtilfælde12 og i andre neurologiske lidelser. Pericytes er også medvirkende til tumor metastaser13. Interessant, pericytes har også vist sig at udvise en redning rolle efter neurologiske traumer og lidelser: i remyelinering i hjernen1, iskæmisk slagtilfælde, rygmarvsskade14 og fremme angiogenese15. Følsomheden af pericytes at forstærke patofysiologiske manifestation af neurologiske traumer og lidelser gør dem en potentiel terapeutisk mål16.
In vitro forskning modeller af pericytes i BBB er vigtige værktøjer til at gennemføre omfattende undersøgelser. Disse modeller giver en platform for mere udførlige undersøgelser ved at repræsentere arbejdsmodeller af BBB og mere. For eksempel kan disse modeller bruges til at forstå den cellulære fysiologi inden for pericytes og blandt andre celletyper af NVU. Også, in vitro-modeller er førstehånds undersøgelse værktøjer til afprøvning af den farmakologiske indflydelse af nye lægemidler og molekyler på pericytes. Disse modeller kan også bruges til at forstå pericytes patofysiologiske rolle i forhold til neurologiske lidelser. Ikke desto mindre kræver udviklingen af in vitro-modeller øget produktion for at muliggøre eksperimentel frihed. Disse modeller skal være nemme og hurtige og reducere antallet af forsøgsdyr, der anvendes. Desuden er evnen til at udvikle sådanne modeller i en dobbelt og tredobbelt cellekultur modeller ønskelig.
Der er mange protokoller, der er blevet udviklet. Protokollerne foreslået af Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20, og Crouch og doetsch21 er prisværdige tilgange, der tilfredsstiller de fleste fornødenheder. Alle disse metoder giver effektive resultater, men afhængigheden af et stort antal forsøgsdyr er fortsat en fællesnævner for disse protokoller. Derfor bliver det obligatorisk at udvikle en høj output metode, der kan isolere og rense pericytes med størst mulig effektivitet. I denne protokol er renheden af cellerne opnået efter en anden passage verificeret med flere pericytes markører. Vi kontrollerede for trombocytafledt vækstfaktor receptor-β (pdgfr-β), som anvendes som en klassisk markør for pericytes17, og for NG2 (neuron-glial antigen 2), som er en markør for pericyte medieret vaskulær morfogenesis22 og vaskularisering23. Vi kontrollerede også for klynge af differentiering 146 (CD 146), som er blevet rapporteret som en af de molekyler, der udtrykkes i pericytes17,18.
Her præsenterer vi en protokol til udvinding af primære pericytes fra mus (vildtype eller transgenics), der vil opfylde alle de førnævnte krav med høj produktion. Vi anvender en antibiotikum og immunopanning fri udvælgelse-baseret metode til spredning for den primære cerebral pericytes, som vil vise sig en effektiv model for gennemførelse in vitro-undersøgelser.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført efter instituttets retningslinjer for brug og håndtering af dyr. I overensstemmelse med den franske lovgivning er dyre faciliteten ved universitetet i Artois blevet godkendt af de lokale myndigheder (reference: B62-498-5). I overensstemmelse med EU-lovgivningen (direktiv 2010/63/EU) blev alle procedurer godkendt af Udvalget for lokal dyrepasning og-anvendelse (Comité d'Ethique en Expérimentation animale du Nord-Pas-de-Calais, reference: C2EA 75) og det franske forskningsministerium (reference: 2015090115412152).
1. forberedelse af løsninger
- Forbered 500 mL vaske buffer A (WBA): 10 mM HEPES-opløsning i Hank's afbalancerede salt opløsning (HBSS). Opbevares ved 4 °C.
- Forbered 500 mL vaske buffer B (WBB): 0,1% bovint serum albumin (BSA) med 10 mM HEPES-opløsning i HBSS. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered 300 mL af 30% dextran opløsning i WBA ved at blande opløsningen natten over ved stuetemperatur. Autoclave opløsningen ved 110 °C i 30 minutter før brug. Efter autoklaveringen skal opløsningen hvile ved stuetemperatur i 2-3 h. Opbevar opløsningen ved 4 °C.
- Forbered 100 mL 0,1% BSA opløsning i kold dextran opløsning. Rystes kraftigt i 3-4 min og opbevares ved 4 °C.
- Forbered komplette Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) kultur medier ved at opløse 20% lægserum, 2 mM glutamin, 50 μg/mL gentamycin, 1% vitaminer, 2% aminosyrer basal medium Eagle (BME) i basal DMEM medier og opbevares ved 4 °C. Tilsæt 1 ng/mL grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF) før brug.
- Forbered komplette pericyte medier ved at tilføje pericyte vækst kosttilskud (forsynet med pericyte Media) og 20% føtal kalve serum (FCS) i pericyte Culture basal Media og opbevares ved 4 °C.
2. hjerne væv opsving og fjernelse af meninges
- For konsistens, brug mus af samme alder og samme køn i hver batch af ekstraktion. Brug et patogen frit dyre beskyttelsesrum, og giv ad libitum adgang til vand. For at sikre effektivitet og minimal brug af dyr, undgå tab af vævs materiale.
- Euthanize C57BL/6J, 4-6 uger gammel, hanmus (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Frankrig).
- Hurtigt punktafgiftspligtige hjernevæv under sterile forhold, undgå beskadigelse af vævet. Anbring forsigtigt vævet i 40 mL kold fosfat bufferet saltvand (PBS).
- Overfør hjernevæv i kold PBS til en Petri skål (100 mm x 15 mm).
- Placer hjernevæv på en steril tør fnugfri serviet og med buede spids pincet, Fjern cerebellum, striatum og occipital nerver.
- Fjerne alle de synlige meninges med en vatpind. Placer hjernevæv på hovedet og Åbn lapper med en vatpind ved hjælp af udadvendte lysstrøg. Fjern alle de synlige blodkar.
- Placer meninges gratis hjernevæv i en Petri skål (100 mm x 15 mm) med 15 mL kold WBB.
3. homogenisering
- Overfør vævet til en Dounce vævs sliber mørtel rør og tilsæt 3-4 mL WBB med tang.
- Hakpe vævet med en ' løs ' Pestle 55 gange. Skyl den ' løse ' Pestle med WBB. Nu hakpe gylle med en "stram" Pestle 25 gange.
- Bland gylle ligeligt i 2 50 mL rør og tilsæt 1.5 x volumen af kold 30% BSA-dextran, kraftigt ryste rørene til at blande gylle.
4. isolering af den vaskulære fraktion
- Efter kraftig rystning af rørene centrifugeres rørene i 25 minutter ved 3.000 x g og 4 °c.
- Supernatanten overføres (sammen med det øverste myelin-lag) til 2 nye rør, og rørene centrifugeres i 25 minutter ved 3.000 x g og 4 °c. Pellets fra den første centrifugering bevares ved tilsætning af 3 mL kold WBB (hold pellet ved 4 °C).
- Gentag trin 4,2 og Bevar forsigtigt pillerne fra 2nd centrifugering.
- Dextran og myelin kasseres med vævs rester fra rørene fra trin 4,3. Bevar pellets i kold WBB.
- Indholdet af tube 1 og tube 2 fra trin 4,1 sammen gøres med den endelige volumen på 10 mL med kold WBB.
- Gentag dette trin for rør fra trin 4,2 og trin 4,3.
Bemærk: Endelig er der 3 rør fra 3 centrifugationer. - Aftag pellet med 6 op-og nedstrøg ved hjælp af en 10 mL pipette, indtil der ikke er nogen synlige klumper af pellets tilbage.
- Ved hjælp af en vakuum filtersamling og nylon mesh filter, filtrere celle suspensioner af hvert rør.
Bemærk: dette filtreringstrin er vigtigt for at fjerne længere/større fartøjer via mesh-filteret. - Genopret og resuspension kapillærer ved at skrabe filteret ved hjælp af en flad spids pincet eller en skraber i WBB ved stuetemperatur. Filtrer suspensionen med et frisk filter for at genvinde flere kapillærer
- Filtratet opdeles ligeligt i to rør og centrifugeres i 7 minutter ved 1.000 x g og rt.
Bemærk: Forbered den enzymatiske opløsning under dette Centrifugerings trin. Fastsæt mængden af WBB, der kræves i henhold til antallet af anvendte dyr (Se tabel over materialer). Tilsæt 1x af DNase 1 og 1x af Tosyl-L-lysyl-chlormethan (TLCK) (Se tabel over materialer) i wbb og præ-varm til 37 °c. - Saml pellets fra trin 4,10 i et rør med præ-varmet WBB med enzymer. Tilsæt pre-varmet 1x collagenase/dispase. Anbring røret i vandbadet med ryste bordet ved 37 °C for nøjagtigt 33 min.
- Stop enzymreaktionen ved at tilsætte 30 mL kold WBB. Centrifuger suspensionen i 7 minutter ved 1.000 x g og rt.
- Supernatanten kasseres forsigtigt og dissocierer pellet i WBB med 6 op-og nedstrøg ved hjælp af en 10 mL pipette. Dette skridt bør være mindre stringent og forholdsvis hurtigere.
- Centrifuger suspensionen i 7 minutter ved 1.000 x g og rt.
Bemærk: i dette trin kasseres belægningen fra kultur retterne og skyl dem én gang med DMEM ved stuetemperatur. Coat cellekultur retter i mindst 1 h på RT. - Supernatanten kasseres fra røret, som er opnået i trin 4,14, og dissocierer pellet i nye komplette DMEM-medier, plade cellerne (dag p0) i 9 brønde med 6-brønds plader (1 brønd 9,6 cm2 hver).
5. spredning af cerebrale pericytes
- Opretholde cellekulturer ved 37 °C og 5% CO2 i en steril inkubator. Udskift kulturmediet efter 24 timer (dag 1) for at montere cellerne ved forsigtigt at fjerne resterne. Efter dag 1, ændre kultur medierne i hver 48 h.
- Overhold cellekulturen i mindst 7-8 dage. På dette tidspunkt, cellulære vækster på toppen af endotel unilayer bør observerbare.
- Passage cellerne på dag 8-10 (afhængigt af konfluency) i pericyte kulturmedium til passage 1 (P1) på gelatine belagte kultur plader. Ændre kultur medierne i hver 2 dage. Overhold cellerne i 6-7 dage. Cellerne opdeles fortløbende igen til passage 2 (P2) på dag 17 [og passage 3 (P3) på dag 24, kun hvis det kræves], dyrket i pericyte medium i gelatine belagte plader.
Bemærk: cellerne skal være klar til eksperimenter/observation ved næsten 80-90% konfluency.
Representative Results
Denne protokol (figur 1) giver effektivt 9 brønde (af 6-brønd plader) på tidspunktet for såning på p0 (figur 2A (p0: dag 1)).
Fra p0 til P2 er der specifikke morfologiske karakteristika, som endotelceller (indikeret med hvide pile) og s gradvise stigning i pericytes (indikeret med sorte pile) kan observeres. I p0 er de aflange endotelceller, der udvikler sig fra mikrobeholdere, i overflod (figur 2A, p0: dag 3), mens den overflod af sådanne aflange celler reduceres i P1 og fraværende i P2. Tværtimod optræder pericytes som quadrilaterale celler, der er rigelige i P2 (figur 2A, P2: dag 18).
For at bekræfte renheden af pericyte kulturen i P2 kontrollerede vi ekspression af NG2, CD146 og pdgfr-beta som pericyte markører ved hjælp af kvantitativ PCR (figur 2B), immuncytokemi (figur 2C) og Western blot (figur 3). Pericytes i P2 udtrykker højere niveauer af CD146, NG2 og PDGFR-β sammenlignet med udtrykket i total Mouse Brain (MS br) ekstrakt. Som en kontrol, udtryk for endotelmarkører Occludin og CD31, astrocytter markør glial Fibrillary Acidic protein (GFAP) og microglia markør CD11b blev også observeret fraværende i P2.
Figur 1: Resumé af protokollen. Dette oplæg repræsenterer kritiske trin for pericyte ekstraktion, som begynder med vævs opløsning med glas Pestle Grinder efterfulgt af 3-trins separation i dextran og filtrering. Denne protokol beskæftiger en 33 min enzym fordøjelse trin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: cellernes morfologi og markører udtryk. (A) fasekontrast billeder af pericytes i p0, P1 og P2 stadier af spredning. Rigelige endotelceller i p0 er indikeret med hvide pile. Deres antal faldt i P1, og de er forsvundet i P2. Pericytes er indikeret med sorte pile. B) analyse af CD146-, NG2-og PDGFR-β-ekspression ved PCR i Pericytes i P2 med Pericytes i P1-og Mouse Brain-prøver (MS br). C) repræsentative billeder af pericytes i P2, som udviser positiv immun farvning af CD146, PDGFR-β og NG2. Skala bjælke: 50 μm (20x forstørrelse) og 20 μm (40x forstørrelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentativ renhed af cellekulturer. Analyse af CD146, PDGFR-β, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b og Tubulin udtryk ved Western blotting i pericytes i P2 og mus hjernen (MS br) prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentativ sammenligning af forskellige metoder til vævs nedbrydning, rensning, berigelse og enzymatisk fordøjelse. Hver offentliggjort protokol sammenfattes med angivelse af antallet af dyr, der er anvendt til hver protokol. Output er også angivet med hensyn til antallet af brønde opnået ved såning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Cerebral pericytes er en integreret del af NVU og spiller en aktiv rolle i induktion og vedligeholdelse af BBB24. På samme måde er rollen af disse celler i de forskellige neurodegenerative lidelser og vaskulære patologier spændende. Derfor vil en effektiv høj output primær pericyte celle model give en effektiv platform for in vitro-undersøgelser.
Der er forskellige protokoller, der er blevet foreslået for isolering af primære pericytes (figur 4). Tigges et al.17 foreslog en metode, herunder kortikale væv med meninges. Denne fremgangsmåde er ømhed af væv fra 6 mus (en 37 °c, 70 min fordøjelse med papain/DNase enzymer) efterfulgt af en opløsning trin via 21 g og 18 g nåle. Denne protokol foreslår en enkelt-trins adskillelse (centrifugering i 22% BSA/PBS opløsning), der giver mindst 2 kollagen i belagt brønde af en 6-brønd plade. Cellerne vedligeholdes i endotel cellevækst medium (ECGM) indtil passage 3 og senere i pericyte Growth medium (PGM) for passaging celler til at fremme pericyte proliferation. I en anden lignende fremgangsmåde foreslog Chen et al.18 vævs dissociation ved at diktere vævet med et steriliseret barberblad og vævs nedbrydning med collagenase/DNase i 90 min ved 37 °c. Efter et-trins separation (centrifugering i 22% BSA) af cellerne fjernes myelin-laget, og pellet vaskes to gange i ECGM. Mikroskibene er belagt i 3 brønde af en kollagen I belagt 6-brønd plader. Efter at have nået sammenløbet, er cellerne urerne to gange og senere vedligeholdt i PGM. I sidste ende, hvis cellerne er bestået i forhold til 3, kan vi få 27 brønde af 6-brønd plader kun ved brug af 10 mus i begyndelsen af protokollen.
I Thomsen et al., forfatterne foreslår isolering af cerebrale pericytes via en to-trins enzym fordøjelse19. Meninges og hvide substans fjernes, og hjerne prøver skæres i små stykker. Vævs stykkerne gennemgår den første enzym reaktion i collagenase/DNase I i 75 min ved 37 °C efter et trin i separationen i 20% BSA. Pellet opsamles og yderligere fordøjes i collagenase/dispase/DNase I for 50 min ved 37 °C. Dette trin efterfølges af Micro Vessel separation i en 33% Percoll gradient og yderligere vasket én gang. Mikroskibene seedede på kollagen IV/fibronectin belagt 35 mm retter. Udbredelsen af pericytes er begunstiget af 10% FCS og gentamicinsulfat i DMEM i 10 dage. I en anden to-trins enzym fordøjelse tilgang, Yamazaki et al. foreslå hakning af det exciserede væv i kold DMEM20. I den første enzym reaktion behandles prøverne med collagenase/DNase I i 75 min ved 37 °C. Efter et trin centrifugering, er pellet igen vaskes én gang og en anden enzym reaktion initieres i collagenase/dispase for 60 min ved 37 °C. Efter en et-trins adskillelse, er pellet resuspenderet og centrifugeret i 22% BSA opløsning. Endelig er den mikrovaskulære pellet resuspenderet og belagt i en 6-brønd plade. For 5 mus hjerner, 1 brønd af en 6-brønd plade kan være belagt. For at opnå pericytes, endotelkult urer er urerne tre gange mens opretholdes i mus hjernen endotel celle (mbec) medium II. Crouch og Doetsch20 foreslår pericyte oprensnings metode af FACS. Vævsprøver fra cortex og ventrikel – subventrikulær zone af muse hjernen er mikro-dissekeret og hakket grundigt med en skalpel. Efter collagenase/dispase enzym inkubation i 30 min ved 37 °C adskilles det Ford øjede væv fra myelin og snavs, der centrifugeres i en 22% v/v Percoll-opløsning. Cellesuspensionen inkuberet derefter i fluorescently konjugerede antistoffer for FACS analyse og sortering. De sorteres celler er belagt i kollagen belagt brønde af 24 brønd plade. Det foreslås, at en cortex giver nok celler til en plating i 1 brønd af 24-brønd plade.
Selv om produktive, disse metoder kommer med flere begrænsninger, fra brugen af store antal dyr til enkelt batch isolation til en meget begrænset mængde af produktionen.
Under udviklingen af denne foreslåede protokol, vi havde succes med at opnå høj produktion: 9 brønde af en 6-brønd plade fra så få som 10 mus. Til dette formål, fjernelse af meninges sikrer et skridt fjernelse af store fartøjer fra vævet. Dounce vævs kværn er mere passende for bløde væv såsom hjernen. Det sikrer også prøve reduktion med den løse Pestle, homogenisering med den stramme Pestle, og forhindrer unødvendige cellulære skader. Et af de vigtigste mål i primær cellekultur protokoller er den minimale affald af væv og udvidet hentning af cerebral vasculature. I den fremlagte protokol opnås dette ved gentagen centrifugering af det inanvendte væv i dextran-BSA. En tretrins Centrifugerings metode hjælper med at inddrive store mængder vaskulatur fra vævs homogenatet. Dette giver en 3x forbedret genopretning af mikrofartøjer. Efter adskillelse, filtrering er det næste væsentlige skridt, som favoriserer udelukkelse af glatte muskelceller associerede store fartøjer. Som nævnt før en kombination af forskellige enzymer er blevet foreslået for enzymatisk fordøjelse. Mens DNase og collagenase/dispase bruges til at reducere klumper af celler og isolere enkelte celler henholdsvis, er det meget vigtigt at forhindre celledød i et sådant invasivt miljø, og dette er forhindret af TLCK, som derved øger det endelige udbytte. Oprindeligt, den første passage er tilladt at dyrke en endotel monolayer, som senere understøtter væksten af vedhæftede pericytes på unilayer. Da overlevelsen af primære endotelceller reduceres ved passaging, det øger sandsynligheden for pericyte hentning. Desuden, denne protokol beskæftiger en anden passaging, der sikrer undgåelse af endotelcelle kontaminering. Det skal bemærkes, at med et højere antal celler fra P2, er afhængigheden af yderligere passaging af cellerne reduceret. Desuden reducerer det muligheden for pericyte vækst bliver overhalet af glatte muskelceller, der formere sig på meget højere sats.
For at opnå en højere ydelse, er der flere trin, der er kritiske og bør udføres nøjagtigt med hensyn til temperatur og tid. Blandingen af væv homogenierer til BSA-dextran bør være hurtig. Pellet dissociationen efter Centrifugerings trinene skal være hurtig for at forhindre celledød. Desuden, 33 min af enzymatisk fordøjelse bør ske med præcision og omhu. En af begrænsningerne for denne protokol er den 7-8 dag varighed, endotel unilayer får lov til at vokse og yderligere lette væksten af pericytes. Åbenbart, isolering af mikrofartøjer er btter, væksten af unilayer er hurtigere, og derfor er der et øget antal pericytes. Det anbefales ikke at bruge mindre end 10 mus i hver ekstraktion for at sikre et tilstrækkeligt antal microvaskulære fraktioner til at støtte pericyte vækst yderligere. Hvis de førnævnte punkter følges nøje, den ønskede celletæthed for cerebral pericyte kultur kan nemt opnås.
In vitro-modeller giver en realistisk platform for udvikling af afledte modeller for at få mere information om den patofysiologiske relevans og kommunikation mellem de andre celler i NVU under neurologiske lidelser. Isolerede pericytes kan inkorporeres i en BI-cellulære kultur (med endoteleller gliaceller celler) og Tri-cellulære kultur (endotel og gliaceller celler) modeller. Udviklingen af disse modeller er ikke blevet drøftet her. Afslutningsvis, denne protokol giver en tilgang til isolering af primære celler med højere output og en bedre platform for in vitro-forskning relateret til cerebral pericyte biologi.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
LT og FG blev bevilget af Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) inden for rammerne af EU'S fælles program-forskning i neurodegenerative sygdomme (JPND) for projekt SNEBOLD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
- Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
- Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106 (2017).
- Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
- Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
- Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
- Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932 (2013).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
- Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
- Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
- Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385 (2016).
- Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
- Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
- Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
- Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
- Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
