Summary
Presentamos un protocolo para la extracción de pericitas cerebrales murinas. Basado en una extracción de pericita orientada al enriquecimiento libre de antibióticos, este protocolo es una herramienta valiosa para estudios in vitro que proporcionan alta pureza y alto rendimiento, disminuyendo así el número de animales experimentales utilizados.
Abstract
En los últimos años, los pericitas cerebrales se han convertido en el foco de una extensa investigación en biología vascular y patología. La importancia de los pericitos en la formación y fisiología de la barrera hematoencefálica se demuestra ahora, pero su base molecular sigue siendo en gran medida desconocida. Como el papel fisiopatológico de los pericita doscerebrales cerebrales en los trastornos neurológicos es intrigante y de gran importancia, los modelos in vitro no sólo son lo suficientemente apropiados, sino también capaces de incorporar diferentes técnicas para estos estudios. Se han propuesto varios métodos como modelos in vitro para la extracción de pericitos cerebrales, aunque es deseable un protocolo libre de antibióticos con alta producción. Lo más importante es que un método que ha aumentado la producción por extracción reduce el uso de más animales.
Aquí, proponemos un método simple y eficiente para extraer pericitas cerebrales con una producción suficientemente alta. El homogeneizado del tejido cerebral del ratón se mezcla con una solución de BSA-dextran para la separación de los restos de tejido y el pellet microvascular. Proponemos una separación de tres pasos seguida de filtración para obtener un filtrado rico en microvas. Con este método, la cantidad de fragmentos microvasculares obtenidos a partir de 10 ratones es suficiente para la semilla de 9 pocillos (9,6 cm2 cada uno) de una placa de 6 pocillos. Lo más interesante con este protocolo, el usuario puede obtener 27 pozos ricos de pericyte (9,6 cm2 cada uno) en el pasaje 2. La pureza de los cultivos de pericita se confirma con la expresión de marcadores de pericita clásicos: NG2, PDGFR-o y CD146. Este método demuestra una herramienta in vitro eficiente y factible para estudios fisiológicos y fisiopatológicos sobre pericitos.
Introduction
Los pericitas cerebrales son un componente esencial de la unidad neurovascular (NVU), que comprende una unidad funcional con las células endoteliales cerebrales de la barrera hematoencefálica (BBB), células gliales, matriz extracelular y neuronas. Los pericitas son una parte vital en el funcionamiento regulado del sistema nervioso central (SNC) ya que sirven como una de las interfaces para el intercambio de información molecular y celular.
Los pericitas cerebrales están incrustados en el lado abluminal de los microvasos cerebrales, y son esenciales para establecer1 y mantener2 la fisiología BBB. Varios trabajos recientes también han destacado el papel de los pericitas cerebrales en la angiogénesis3 y la maduración del vaso4,la morfogénesis endotelial5 y la supervivencia6,y en el control del metabolismo del colesterol cerebral7. Es importante destacar que la desregulación en cualquiera de estos procesos son señas de identidad etiológicas de las enfermedades neurodegenerativas.
De hecho, los pericitas son una necesidad funcional para el funcionamiento normal de BBB y su protección contra la progresión de varias enfermedades neurológicas. La fisiología degenerativa y la pérdida de pericitas son denominadores comunes en la progresión de la enfermedad de Alzheimer8,pérdida neuronal durante la disfunción de la materia blanca9, esclerosis múltiple10,encefalopatía séptica11,accidente isquémico de fase aguda12 y en otros trastornos neurológicos. Los pericíticos también son instrumentales en la metástasis tumoral13. Curiosamente, pericitas también se ha demostrado que exhiben un papel de rescate después de trauma neurológico y trastornos: en la remielinización en el cerebro1, accidente cerebrovascular isquémico, lesión de la médula espinal14 y promover la angiogénesis15. La susceptibilidad de los perititos para reforzar la manifestación fisiopatológica de traumas y trastornos neurológicos los convierte en una posible diana terapéutica16.
Los modelos de investigación in vitro de pericytes en el BBB son herramientas importantes para llevar a cabo estudios exhaustivos. Estos modelos proporcionan una plataforma para estudios más elaborados mediante la representación de los modelos de trabajo de la BBB y más. Por ejemplo, estos modelos se pueden utilizar para entender la fisiología celular dentro de los pericitas y entre otros tipos celulares de la NVU. Además, los modelos in vitro son herramientas de investigación de primera mano para probar la influencia farmacológica de nuevos fármacos y moléculas en los pericitas. Estos modelos también se pueden utilizar para entender el papel fisiopatológico de los pericitos en relación con los trastornos neurológicos. Sin embargo, el desarrollo de modelos in vitro requiere una mayor producción para permitir la libertad experimental. Estos modelos deben ser fáciles y rápidos, y reducir el número de animales experimentales utilizados. Además, la capacidad de desarrollar estos modelos en modelos de cultivo de células dobles y triples es deseable.
Hay muchos protocolos que se han desarrollado. Los protocolos propuestos por Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20, y Crouch y Doetsch21 son enfoques encomiables que satisfacen la mayoría de las necesidades. Todos estos métodos producen resultados efectivos, pero la dependencia de un gran número de animales experimentales sigue siendo un denominador común para estos protocolos. Por lo tanto, se hace obligatorio desarrollar un método de alta salida que pueda aislar y purificar los periitas con la máxima eficiencia posible. En este protocolo, la pureza de las células obtenidas después de un segundo pasaje se verifica con varios marcadores de pericytis. Comprobamos si hay un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-, que se utiliza como un marcador clásico de pericitas17,y ng2 (antígeno de la neurona-glial 2), que es un marcador de morfogénesis vascular mediada por pericita22 y vascularización23. También comprobamos el cúmulo de diferenciación 146 (CD 146), que ha sido reportado como una de las moléculas expresadas en los pericytes17,18.
Aquí, presentamos un protocolo para la extracción de pericidas primarios de ratones (tipo salvaje o transgénicos) que satisfará todos los requisitos antes mencionados con alta producción. Empleamos un método gratuito de proliferación basado en la selección de antibióticos e inmunoparantes para los pericitos cerebrales primarios, que será un modelo eficiente para la realización de estudios in vitro.
Protocol
Todos los experimentos se realizaron siguiendo las directrices del Instituto para el uso y manejo de animales. De conformidad con la legislación francesa, las instalaciones para animales de la Universidad de Artois han sido aprobadas por las autoridades locales (referencia: B62-498-5). En cumplimiento de la legislación de la Unión Europea (Directiva 2010/63/UE), todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales locales (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Nord-Pas-De-Calais, referencia: C2EA 75) y el Ministerio de Investigación francés (referencia: 2015090115412152).
1. Preparación de soluciones
- Preparar 500 mL de búfer de lavado A (WBA): Solución HEPES de 10 mM en la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank. Conservar a 4oC.
- Preparar 500 mL de Washing Buffer B (WBB): 0.1% Bovine Serum Albumin (BSA) con solución HEPES de 10 mM en HBSS. Conservar a 4oC.
- Prepare 300 ml de solución de 30% dextran en amblando mezclando la solución durante la noche a temperatura ambiente. Autoclave la solución a 110 oC durante 30 minutos antes de su uso. Después del autoclave, deje reposar la solución a temperatura ambiente durante 2-3 h. Almacene la solución a 4oC.
- Preparar 100 ml de solución BSA al 0,1% en solución de dextran en frío. Agitar vigorosamente durante 3-4 min y almacenar a 4oC.
- Preparar medios de cultivo completos del medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco disolviendo 20% suero de pantorrilla, 2 mM de glutamina, 50 g/ml de gentamicina, 1% de vitaminas, 2% aminoácidos Basal Eagle Medium (BME) en medios Basal DMEM y almacenar a 4 oC. Añadir 1 ng/ml Factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) antes de su uso.
- Preparar medios de pericito completos mediante la adición de suplementos de crecimiento de pericita (proporcionados con los medios de pericito) y 20% de suero de becerro fetal (FCS) en medios basales de cultivo de pericita y almacenar a 4 oC.
2. Recuperación del tejido cerebral y eliminación de meninges
- Para mantener la consistencia, utilice ratones de edad similar y el mismo sexo en cada lote de extracción. Utilice un refugio para animales libre de patógenos y proporcione acceso ad libitum al agua. Para garantizar la eficiencia y el uso mínimo de los animales, evite la pérdida de material tisular.
- Euthanize C57BL/6J, 4-6 semanas de edad, ratones macho (laboratorios Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Francia).
- Rápidamente excise el tejido cerebral en condiciones estériles, evitar cualquier daño al tejido. Coloque cuidadosamente el tejido en 40 ml de solución salina tamponada con fosfato frío (PBS).
- Transfiera el tejido cerebral en PBS frío a una placa De Petri (100 mm x 15 mm).
- Coloque el tejido cerebral en una toallita estéril sin pelusas secas y con fórceps de punta curvada, retire el cerebelo, el estriado y los nervios occipitales.
- Retire todas las meninges visibles con un hisopo de algodón. Coloque el tejido cerebral boca abajo y abra los lóbulos con un hisopo de algodón usando golpes de luz hacia afuera. Retire todos los vasos sanguíneos visibles.
- Coloque las meninges libre de tejido cerebral en una placa Petri (100 mm x 15 mm) con 15 ml de WBB frío.
3. Homogeneización
- Transfiera el tejido a un tubo de mortero de la trituradora de tejido Dounce y agregue 3-4 ml de WBB con fórceps.
- Mince el tejido con un pestle 'flojo' 55 veces. Enjuague el pestillo 'flojo' con WBB. Ahora picar la suspensión con un pestillo "apretado" 25 veces.
- Divida la suspensión por igual en dos tubos de 50 ml y agregue 1,5x volumen de frío 30% BSA-dextran, agitando vigorosamente los tubos para mezclar la suspensión.
4. Aislamiento de la fracción vascular
- Después de agitar vigorosamente los tubos, centrifugar los tubos durante 25 minutos a 3.000 x g y 4 oC.
- Transfiera el sobrenadante (junto con la capa superior de mielina) a 2 tubos nuevos, y centrifugar los tubos durante 25 minutos a 3.000 x g y 4 oC. Conservar los pellets desde la primera centrifugación añadiendo 3 ml de WBB frío (mantener el pellet a 4oC).
- Repita el paso 4.2 y conserve cuidadosamente los pellets dela centrifugación 2.
- Deseche el deextran y la mielina con restos de tejido de los tubos del paso 4.3. Conservar los pellets en WBB frío.
- Auna el contenido del tubo 1 y del tubo 2 del paso 4.1 y haz hasta el volumen final de 10 mL con WBB frío.
- Repita este paso para los tubos del paso 4.2 y del paso 4.3.
NOTA: Por último, hay 3 tubos de 3 centrifugaciones. - Disociar el pellet con 6 golpes hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de 10 ml, hasta que no queden grumos visibles de los pellets.
- Con la ayuda de un conjunto de filtro de vacío y el filtro de malla de nylon, filtre las suspensiones celulares de cada tubo.
NOTA: Este paso de filtración es importante para eliminar recipientes más largos/más grandes a través del filtro de malla. - Recuperar y resuspender los capilares raspando el filtro con la ayuda de un fórceps de punta plana o un rascador en WBB a temperatura ambiente. Filtrar la suspensión con un filtro fresco para recuperar más capilares
- Divida el filtrado por igual en dos tubos y centrífuga durante 7 min a 1.000 x g y RT.
NOTA: Durante este paso de centrifugación, prepare la solución enzimática. Determinar el volumen de WBB requerido de acuerdo con el número de animales utilizados (ver Tabla de Materiales). Añadir 1x de DNase 1 y 1x de clorhidrato de Tosyl-L-lysyl-cloromethane (TLCK) (ver Tabla de Materiales)en WBB y precalentado a 37oC. - Recoger los pellets del paso 4.10 en un tubo con WBB precalentado con enzimas. Añadir precalentado 1x colagenasa/dispensa. Coloque el tubo en el baño de agua de la mesa de agitación a 37 oC durante exactamente 33 minutos.
- Detenga la reacción enzimática añadiendo 30 ml de WBB fría. Centrifugar la suspensión durante 7 min a 1.000 x g y RT.
- Deseche el sobrenadante cuidadosamente y disocia el pellet en WBB con 6 golpes hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de 10 ml. Este paso debe ser menos riguroso y comparativamente más rápido.
- Centrifugar la suspensión durante 7 min a 1.000 x g y RT.
NOTA: Durante este paso, deseche el recubrimiento de los platos de cultivo y enjuáguelos una vez con DMEM a temperatura ambiente. Recubrir platos de cultivo celular durante al menos 1 h en RT. - Deseche el sobrenadante del tubo obtenido en el paso 4.14, y disociaele el pellet en nuevos medios DMEM completos, placa las células (Día 0, P0) en 9 pocillos de placas de 6 pocillos (1 pozo de 9,6 cm2 cada una).
5. Proliferación de pericitos cerebrales
- Mantener los cultivos celulares a 37oC y 5% deCO2 en una incubadora estéril. Reemplace el medio de cultivo después de 24 h (día 1) de chapar las celdas retirando cuidadosamente los residuos. Después del día 1, cambie los medios de cultivo cada 48 h.
- Observe el cultivo celular durante al menos 7-8 días. En este momento, los crecimientos celulares en la parte superior de unilayer endotelial deben ser observables.
- Pasar las células en el día 8-10 (dependiendo de la confluencia) en el medio de cultivo pericita al paso 1 (P1) en placas de cultivo recubiertas de gelatina. Cambie los medios de cultivo cada 2 días. Observe las células durante 6-7 días. Las células se dividen consecutivamente de nuevo en el pasaje 2 (P2) del día 17 [y el pasaje 3 (P3) del día 24 sólo si es necesario], cultivado en medio de pericita en placas recubiertas de gelatina.
NOTA: Las células estarán listas para experimentos/observación con una confluencia de casi 80-90%.
Representative Results
Este protocolo(Figura 1) produce eficientemente 9 pocillos (de placas de 6 pocillos) en el momento de la sembración en P0(Figura 2A (P0: Día 1)).
De P0 a P2, hay características morfológicas específicas por las cuales se pueden observar células endoteliales (indicadas por flechas blancas) y el aumento gradual de los peritos (indicados por flechas negras). En P0, las células endoteliales alargadas que se desarrollan a partir de microvasculares están en abundancia(Figura 2A,P0: Día 3), mientras que la abundancia de estas células alargadas se reduce en P1 y está ausente en P2. Por el contrario, los pericitos aparecen como células cuadriláteras que son abundantes en P2(Figura 2A,P2: Día 18).
Para confirmar la pureza del cultivo de pericita en P2, comprobamos la expresión de NG2, CD146 y PDGFR-beta como marcadores de pericita utilizando PCR cuantitativo(Figura 2B),inmunocitoquímica(Figura 2C)y western blot(Figura 3). Los pericitas en P2 expresan niveles más altos de CD146, NG2 y PDGFR-o en comparación con la expresión en el extracto total del cerebro del ratón (Ms Br). Como control, también se observaron expresión de marcadores endoteliales Occludin y CD31, marcador de astrocitos Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) y marcador de microglia CD11b ausente en P2.
Figura 1: Resumen del protocolo. Este esquema representa pasos críticos para la extracción de pericita que comienza con la desintegración del tejido con la amoladora de plagas de vidrio seguida de la separación de 3 pasos en el deextran y la filtración. Este protocolo emplea un paso de digestión enzimática de 33 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología de las células y expresión de marcadores. (A) Imágenes de contraste de fase de pericitas en etapas de proliferación P0, P1 y P2. Abundantes células endoteliales en P0 están indicadas por flechas blancas. Su número disminuyó en P1 y han desaparecido en P2. Los pericíticos están indicados por flechas negras. (B) Análisis de la expresión CD146, NG2 y PDGFR-o por PCR en pericitos en P2 con pericitos en muestras de P1 y cerebro de ratón (Ms Br). (C) Imágenes representativas de pericitos en P2 que presentan inmunomanchado positivo de CD146, PDGFR- y, NG2. Barra de escala: 50 m (aumento de 20x) y 20 m (aumento de 40x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pureza representativa de los cultivos celulares. Análisis de la expresión CD146, PDGFR, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b y Tubulina por hincha occidental en pericitas en muestras de P2 y cerebro de ratón (Ms Br). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación representativa de diferentes métodos de desintegración tisular, purificación, enriquecimiento y digestión enzimática. Cada protocolo publicado se resume con indicaciones sobre el número de animales utilizados para cada protocolo. Las salidas también se indican con respecto al número de pozos obtenidos al sembrar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los pericitas cerebrales son una parte integral de la NVU y desempeñan un papel activo en la inducción y el mantenimiento del BBB24. Del mismo modo, el papel de estas células en los diferentes trastornos neurodegenerativos y patologías vasculares es intrigante. Por lo tanto, un modelo eficiente de células de pericito primario de alta producción proporcionará una plataforma eficiente para estudios in vitro.
Hay varios protocolos que se han propuesto para el aislamiento de los pericytes primarios(Figura 4). 17 sugirieron un método que incluye tejido cortical con meninges. Este enfoque es la tiernación de tejido de 6 ratones (una digestión de 37 oC, 70 minutos con enzimas papaína/DNase) seguida de un paso de desintegración a través de agujas de 21 G y 18 G. Este protocolo sugiere una separación de un solo paso (centrifugación en 22% de solución BSA/PBS) que produce al menos 2 pozos recubiertos de colágeno I de una placa de 6 pocillos. Las células se mantienen en medio de crecimiento de células endoteliales (ECGM) hasta el paso 3 y más tarde en el medio de crecimiento pericita (PGM) para las células de paso para promover la proliferación de pericitas. 18 propusieron la disociación del tejido mediante la dicing el tejido con una cuchilla de afeitar esterilizada y la digestión del tejido con colagenas/DNase durante 90 min a 37 oC. Después de la separación de un paso (centrifugación en 22% BSA) de las células, la capa de mielina se elimina y el pellet se lava dos veces en ECGM. Los microvasos están chapados en 3 pocillos de un colágeno que recubrió placas de 6 pocillos. Después de alcanzar la confluencia, las células se pasajean dos veces y más tarde se mantienen en PGM. Al final, si las células se pasan en proporción de 3, podemos obtener 27 pozos de placas de 6 pocillos sólo en el uso de 10 ratones al principio del protocolo.
En Thomsen et al., los autores sugieren el aislamiento de los pericitas cerebrales a través de una digestión enzimática de dos pasos19. Se eliminan las meninges y la materia blanca, y las muestras cerebrales se cortan en trozos pequeños. Las piezas de tejido sufren la primera reacción enzimática en colagenasa/DNase I durante 75 min a 37 oC, siguiendo un paso de separación en 20% de BSA. El pellet se recoge y se digiere en colagenasa/dispensa/DNase I durante 50 min a 37 oC. Este paso es seguido por la separación de microvasos en un degradado percoll del 33% y lavado aún más una vez. Los microvasculares se sembran en platos recubiertos de colágeno IV/fibronectina de 35 mm. La proliferación de pericitas es favorecida por un 10% de FCS y sulfato de gentamicina en DMEM durante 10 días. En otro enfoque de digestión enzimática de dos pasos, Yamazaki y otros sugieren la picadura del tejido extirpado en DMEM20en frío. En la primera reacción enzimática, las muestras se tratan con colagenasa/DNase I durante 75 min a 37 oC. Después de una centrifugación de un paso, el pellet se lava de nuevo una vez y se inicia una segunda reacción enzimática en colágeno/dispensa durante 60 min a 37 oC. Después de una separación de un solo paso, el pellet se resuspende y centrifuga en una solución de 22% De BSA. Finalmente, el pellet microvascular se resuspende y se platea en una placa de 6 pocillos. Para 5 cerebros de ratón, 1 pozo de una placa de 6 pocillos se puede chapar. Para obtener los pericitas, los cultivos endoteliales se repercuten tres veces mientras se mantienen en la célula endotelial del cerebro del ratón (mBEC) medio II. Crouch y Doetsch20 sugieren el método de purificación de pericitas por FACS. Las muestras de tejido de la corteza y la zona ventricular-subventricular del cerebro del ratón se microdiseccionan y pican a fondo con un bisturí. Después de la incubación de la enzima colagenasa/dispensación durante 30 min a 37 oC, el tejido digerido se separa de la mielina y los desechos centrifugados en una solución de Percoll del 22% v/v. La suspensión celular se incuba en anticuerpos fluorescentes para el análisis y clasificación de FACS. Las células clasificadas están chapadas en pozos recubiertos de colágeno de 24 placas de pozos. Se sugiere que una corteza produce suficientes células para un revestimiento en 1 pozo de placa de 24 pocillos.
Incluso si son productivos, estos métodos vienen con varias limitaciones, desde el uso de un gran número de animales para el aislamiento de un solo lote hasta una cantidad muy limitada de producción.
Durante el desarrollo de este protocolo propuesto, logramos obtener alta producción: 9 pozos de una placa de 6 pocillos de tan solo 10 ratones. Con este fin, la eliminación de meninges asegura la extracción de un paso de vasos grandes del tejido. La trituradora de tejido Dounce es más apropiada para tejidos blandos como el cerebro. También asegura la reducción de la muestra con el pestillo suelto, homogeneización con el pestillo apretado, y evita daños celulares innecesarios. Uno de los principales objetivos en los protocolos de cultivo celular primario es el mínimo desperdicio de tejido y la recuperación prolongada de la vasculatura cerebral. En el protocolo presentado, esto se logra mediante la centrifugación repetitiva del homogeneizado de tejido infundido dextran-BSA. Un enfoque de centrifugación de tres pasos ayuda a recuperar grandes cantidades de vasculatura del tejido homogeneato. Esto proporciona una recuperación 3 veces mejor de los microvasos. Después de la separación, la filtración es el siguiente paso esencial, que favorece la exclusión de los vasos grandes asociados a células musculares lisas. Como se mencionó antes se ha propuesto una combinación de diferentes enzimas para la digestión enzimática. Mientras que DNase y la colagenasa/dispensa se utilizan para reducir los grupos de células y aislar células individuales respectivamente, es muy importante prevenir la muerte celular en un entorno tan invasivo y esto es evitado por TLCK, lo que aumenta el rendimiento final. Inicialmente, el primer pasaje se permite cultivar una monocapa endotelial, que más tarde apoya el crecimiento de pericitas adjuntas en el unilayer. Dado que la supervivencia de las células endoteliales primarias se reduce al pasar, aumenta la probabilidad de recuperación de pericita. Además, este protocolo emplea otro passaging que garantiza la evitación de la contaminación de las células endoteliales. Cabe señalar que con un mayor número de células de P2, la dependencia en el paso adicional de las células se reduce. Además, reduce la posibilidad de crecimiento de pericito siendo superado por las células musculares lisas, que proliferan a una tasa mucho más alta.
Con el fin de lograr una salida más alta, hay varios pasos que son críticos y deben realizarse con precisión con respecto a la temperatura y el tiempo. La mezcla de tejido homogeneado en BSA-dextran debe ser rápida. La disociación del pellet después de las etapas de centrifugación debe ser rápida para prevenir la muerte celular. Además, 33 min de digestión enzimática deben hacerse con precisión y cuidado. Una de las limitaciones para este protocolo es la duración de 7-8 días que se permite que el unilayer endotelial crezca y facilite aún más el crecimiento de los pericitos. Evidentemente, el aislamiento de los microvasculares es más suave, el crecimiento de unilayer es más rápido, y por lo tanto hay un mayor número de pericitos. Se recomienda no utilizar menos de 10 ratones en cada extracción para garantizar un número adecuado de fracciones microvasculares para apoyar aún más el crecimiento de los pericitas. Si los puntos antes mencionados se siguen cuidadosamente, la densidad celular deseada para el cultivo de pericita cerebral se puede lograr fácilmente.
Los modelos in vitro proporcionan una plataforma factible para el desarrollo de modelos derivados para obtener más información sobre la relevancia fisiopatológica y la comunicación entre las otras células de la NVU durante los trastornos neurológicos. Los pericitos aislados se pueden incorporar en un cultivo bicelular (con células endoteliales o gliales) y en modelos de cultivo tricelular (células endoteliales y gliales). El desarrollo de estos modelos no se ha discutido aquí. Para concluir, este protocolo proporciona un enfoque para el aislamiento de células primarias con mayor producción y una mejor plataforma para la investigación in vitro relacionada con la biología del pericito cerebral.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
LT y FG fueron otorgados por Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) en el marco del Programa Conjunto de la UE – Investigación de Enfermedades Neurodegenerativas (JPND) para el proyecto SNOWBALL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
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