Summary
Her præsenterer vi protokoller for 1) laboratoriet fangenskab formering af føderalt truede Miami blå sommerfugl(Cyclargus thomasi bethunebakeri), og 2) vurdering grundlæggende livhistorie oplysninger såsom umodne udviklingstid og antallet af larve stadia. Begge metoder kan tilpasses til brug med andre ex situ bevaringsprogrammer.
Abstract
Forbedring af kendskabet til ex situ bedste praksis for udsatte sommerfugle er vigtigt for at generere en vellykket bevarelse og nyttiggørelse program resultater. Forskning i sådanne fangenskab befolkninger kan også give værdifulde data til at løse centrale oplysninger huller om adfærd, livshistorie, og økologi af målet taxa. Vi beskriver en protokol for fangenskab formering af føderalt truede Cyclargus thomasi bethunebakeri, der kan bruges som model for andre udsatte sommerfugl ex situ programmer, især dem i familien Lycaenidae. Vi giver endvidere en enkel og ligetil protokol til registrering af forskellige livshistoriske målinger, der kan være nyttige til at informere ex situ metoder samt tilpasset til laboratorieundersøgelser af andre lepidoptera.
Introduction
En voksende liste over undersøgelser viser udbredt og alvorlig global nedgang i sommerfuglepopulationer1,2,3,4,5. Dette omfatter langt størstedelen af udsatte arter. Bevarelse programmer designet til at afbøde sådanne fald ofte anvender en blanding af strategier, herunder befolkningsovervågning, habitat forvaltning og restaurering, videnskabelig forskning, fangenskab formering, og organisme omplantning6. Inden for USA og dets territorier alene, i alt 30 sommerfugl taxa er opført i henhold til Endangered Species Act (ESA) som enten truet eller truet, med 21 af disse har godkendt udkast eller endelige genopretningsplaner. For sådanne taxaer anbefaler mere end halvdelen af de identificerede genopretningsstrategier til bundet formering eller anfører, at udbredelsen i fangenskab bør vurderes7. Anvendelsen af ex situ-bevaringsindsatsen for sommerfugle er vokset betydeligt i de senere år8,9og har potentiale til at være et kritisk redskab til at støtte genopretningsindsatsen10. Talrige institutioner, organisationer og agenturer er i øjeblikket involveret i ex situ indsats for mindst 11 ESA-listede sommerfugl taxa (dvs. Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae, og Speryeria zerene hippolyta) og flere andre udsatte taxa (f.eks Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria idalia, og Eumaeus atala)11. På trods af antallet af robuste og vellykkede bestræbelser, er der stadig mangel på regelmæssig kommunikation på tværs af programmer og mellem bevarelse praktiserende læger involverer udveksling af ideer, data, effektive metoder, og resultater. En sådan videndeling er afgørende, da det hjælper med at minimere dobbeltarbejde, forbedrer den generelle bedste praksis og øger bevaringsvirkningen. Få offentliggjorthoved-start-, opdræts-, avls- eller opdrætsprotokoller er let tilgængelige for risiko-sommerfugletaxa, og dem, der ofte mangler tilstrækkelige fortællende detaljer og/eller illustrationer. Disse giver ofte for det meste sammenfattende oplysninger med begrænsede trinvise instruktioner og ledsagende billeder, hvilket gør replikation udfordrende eller anvendelse til andre taxa vanskeligt at vurdere12,13,14,15. Mange af de tilgængelige protokoller er begrænsede på en eller anden måde: de findes kun i den grå litteratur, eller i forskellige detaljer, alder af offentliggørelse, eller som en del af symposiet sagen, agentur / funder rapporter, eller in-house manualer16,17,18,19,21,21,22,23,24.
For de fleste bevarelse programmer, er fangenskab formering primært udføres for at støtte bevarelse omplantning, som omfatter genindførelse, forstærkning (dvs. augmentation), og indførelse25,26. Sådanne aktiviteter skal gennemføres strategisk som en del af den overordnede genopretningsstrategi for at bidrage til at forhindre udryddelse n af en liste over arter, underarter eller populationer. Det skal dog bemærkes, at dette er en af flere andre potentielle roller, at sådanne ex situ programmer kan tjene. Disse kan også omfatte opretholdelse af en forsikring (dvs. refugia) befolkning, midlertidig organisme redning, støtte opsving-relateret forskning og / eller uddannelse, og fremme bevarelse-relaterede uddannelse og bevidsthed indsats27,28. Uanset om ex situ-programmer har et enkelt defineret mål eller en blanding af flere, bør bevaringsudøvere maksimere mulighederne for dataindsamling for at udfylde de vigtigste informationshuller, når det er muligt. Dette er særlig vigtigt, fordi langt størstedelen af risikotaxaen generelt er blevet dårligt undersøgt, før der er faldet en betydelig vild befolkning. Den deraf følgende øget viden opnået på forskellige adfærdsmæssige, økologiske, eller livshistorie aspekter af brændkassen taksonen kan tjene til at fremme en effektiv art bevarelse og forvaltning29.
Her beskriver vi i detaljer den fangenskab formering protokol, der blev udviklet til føderalt truede Miami blå sommerfugl (Cyclargus thomasi bethunebakeri)(Supplerende figur 1)som en del af en større bevarelse og nyttiggørelse program. I dette tilfælde tjener det bundne formeringsprogram tre specifikke identificerede roller: 1) en forsikringsbefolkning, hvis den eksisterende vilde befolkning går tabt, 2) en forskningsbefolkning, der er designet til at udfylde identificerede økologiske og livshistoriske videnshuller, der kan bidrage til at informere genopretning og/eller forvaltning, og 3) til at producere levedygtige organismer til bevarelse, der omgår til steder inden for skattevæsenets historiske område. Den resulterende protokol er blevet godt undersøgt og bevist, efter at være blevet udnyttet og forbedret i over et årti. Derfor mener vi, at de beskrevne teknikker og metoder udgør en levedygtig model, der kan anvendes på eller let tilpasses til andre ex situ at-risiko sommerfugl programmer, især dem, der involverer Lycaenidae eller relaterede taxa. Selv om vi ikke tyder på, at den beskrevne protokol er bedre end andre, mener vi, at der er muligheder for at anvende nogle af metoderne mere bredt for at bidrage til at øge produktiviteten, plejen eller effektiviteten. Dette gælder især, da en stor del af vores avl sker under indendørs laboratorieforhold med begrænset plads, svarende til de bevarelse programmer, der involverer Euphydryas editha taylori og Speryeria zerene hippolyta17,23. Talrige andre protokoller ofte udnytte potteplanter materiale til oviposition eller larve opdræt, som undertiden kan føre til øget kompleksitet i forbindelse med rovdyr kontrol, miljøkontrol (dvs. fugtighed, temperatur), husdyr overvågning, dataindsamling, planteskadedyr spørgsmål, og plads til at nævne nogle få21,22. Endelig skitserer den fremlagte protokol metoderne til opdræt i fangenskab. Mange andre udsatte sommerfugl bevarelse programmer indebærer hoved-start eller fangenskab opdræt med de repræsentative protokoller afspejler disse forskelle. Mens ofte mindre, vi føler, at dette hjælper med at udvide den eksisterende pulje af tilgængelige oplysninger for andre programmer til at gennemgå. Dette er kritisk, fordi de fleste ex situ programmer repræsenterer banebrydende bestræbelser på at bidrage til at lette inddrivelsen af sjældne og ofte dårligt studerede taxa. Tilgængelige protokoller kan tjene som et glimrende udgangspunkt for at hjælpe med at give værdifuld indsigt, reducere dobbeltarbejde og fremme innovation. På grund af "den omfattende interspecifikke mangfoldighed af sommerfugl adfærd, livshistorie træk, og økologiske krav kombineret med ofte markante forskelle i programfaciliteter, budgetter, praktiserende ekspertise" og andre iboende forskelle, afhængighed af en enkelt metode, selv for nært beslægtede taxa, er ofte begrænsende og uberettiget30. Fleksibilitet til at forfine eller udvikle nye protokoller, der er skræddersyet til behovene i specifikke taxa eller programmer, er afgørende for succes og bør derfor understreges. Vi beskriver desuden laboratorieteknikker til indsamling af målinger af organismeudvikling under fangenskab, herunder antallet af larveinstjerner, varigheden af de enkelte udviklingsstadier, den samlede udviklingstid og larve og pupallængde. Disse teknikker har bred anvendelighed for livshistorie undersøgelser af Lepidoptera, der kan bruges til at forfine ex situ protokoller eller informere feltdata.
Protocol
1. Sikring af vellykket voksen frieri og parring
- Efter vellykket eclosion, frigive levedygtige voksne sommerfugle i en sikker, walk-in, screenet flyvning bur placeret i en temperatur-kontrolleret drivhus (Supplerende figur 2).
BEMÆRK: Voksne kan mærkes på vingernes ventrale overflade med permanente blækmarkører, hvis der ønskes identifikation af bestemte personer til adskillelse af genetiske linjer, lageroprindelse eller til specifik dataindsamling i forbindelse med organismens levetid, adfærd, Osv.- Mens den nøjagtige bur dimensioner kan variere, sikre, at der er rigelig plads til at rumme passende nektar plantemateriale er nødvendige for at støtte tætheden af husede voksne sommerfugle og give plads til et menneske til frit at stå og dreje rundt.
- Ud over temperaturregulering, sikre, at drivhuset er sikkert, så det kan give et andet lag af indeslutning sammen med beskyttelse mod dårligt vejr (f.eks kraftig regn, vind).
- Løft potteplanter nektar plantemateriale, således at der ikke er mere end 30 cm plads fra den indvendige toppen af buret til de højeste blomstrende blomster (Supplerende figur 2). Dette giver optimal adgang til de tilgængelige nektarressourcer, tilbyder rigelig voksensidderum og minimerer uvedkommende flyaktivitet.
- Placer en potteplante i cockpittet. Dette sikrer, at selv hvis en parret par er savnet eventuelle resulterende æg lagt kan indsamles.
- Sørg for ensartet luftstrøm. Dette øger frieri aktivitet og parring succes. I en drivhusindstilling, blæsere og fast mount cirkulation fans er bedst bruges til at hjælpe med at forbedre ventilation og luftbevægelse. Mindre bærbar ventilation, såsom kasse- eller skrivebordsventilatorer, kan også bruges.
- Opretholde den indre drivhustemperatur mellem 27 °C og 32 °C for at fremme optimal voksen aktivitet og parring succes. Temperaturen inde i buret overvåges ved hjælp af et sporbart hukommelsesovervågningstermometer.
- Mist det screenede flight cage regelmæssigt (ca. en gang hver 2 time) med vand ved hjælp af en håndpumpe, plasttank sprøjte, eller haveslange.
- Saml forsigtigt individuelle parringspar fra det screenede cockpit ved hjælp af et 50 dram klart plastsnaphætteglas (materialetabel),placeret et til to par pr. hætteglas og transport til et indendørs opdrætsrum eller laboratorium (supplerende figur 3).
2. Maksimering af ægproduktionen
- Saml oviposition kammer.
- Tag en 12 ounce almindeligt hvidt papir kop og ved hjælp af en snap blade utility kniv, foretage to vandrette nedskæringer på hver side af koppen på tværs fra hinanden. Hvert snit skal være ca. 1 cm under fælgen.
- Skær en enkelt vatpind i halve og indsæt stangen den ende af hver i de to vandrette nedskæringer på hver side af papiret kop, således at vatpind del strækker sig ca 2 cm mod det indre af koppen.
- Ved hjælp af en snap blade utility kniv, lave to "X" nedskæringer i bunden af papiret kop. Hvert diagonalt snit skal være ca. 1 cm langt.
- Tag en 9 ounce plastik kop og fyld bunden med ca 2 cm vand fra hanen.
- Placer en frisk skæring, ca. 15 cm lang, af terminal larve vært plante vækst i papiret kop ved at indsætte stilken gennem en af de "X" nedskæringer i bunden. Skub stilken gennem snittet, så ca. 4-5 cm stikker bunden ud.
- Placer papirkoppen med værtsmateriale i plastikkoppen, så planten stilk er i vand.
- Fyld en 1 ml sub-Q sprøjte (0,45 mm x 16 mm) med en aromatiseret sportsdrik og mætte både vatpinde i papirkoppen. Disse fungerer som kunstige blomster.
BEMÆRK: Melon og frugt punch aromatiseret sportsdrik giver den bedste nektar alternativ. - Når hvert parringspar adskiller sig, skal du placere 2-3 gravide hunner i den samlede kopkonfiguration (dvs. ovipositionkammeret).
- Dæk koppen med et snitfirkantet fragment af sort tyl (ca. 15 cm x 15 cm) og fastgør den med en elastik rundt om låget (Supplerende figur 4). Sort tyl giver den bedste synlighed i koppen og nem identifikation af æg, der kan lejlighedsvis lægges på tyl.
- Stimulere voksen sommerfugl aktivitet og oviposition.
- Placer hvert oviposition kammer på et laboratorium bænk eller bord ca 19 cm under en 8,5 tommer (21,59 cm) klemme lys med en aluminium reflektor huser en 40 W glødepære (Supplerende figur 5).
BEMÆRK: Glødelampe lys giver strålende varme er nødvendige for at stimulere voksne aktivitet og oviposition. - Placer et sporbart hukommelsesovervågningstermometer ved siden af lysene, og kør temperatursensoren, så det hviler oven på et ovipositionkammer, der er placeret direkte under et klemmelys.
BEMÆRK: Måltemperaturområdet er mellem 27,5 °C-29 °C. - Tilføj supplerende klemme lys efter behov afhængigt af det samlede antal ovipositional kamre indsat.
- Stik klemme lys i en programmerbar 15 Amp 24 h indendørs plug-in mekanisk timer med to forretninger (programmerbare i 30 min tidsindstillede intervaller).
- Indstil timer en til at tænde klemmelys i 30 min intervaller (dvs. en repeterbar cyklus på 30 min på, 30 min off).
BEMÆRK: Denne lyscyklus er med til at maksimere ægproduktionen ved at give repeterbare perioder med belysning for at stimulere voksensommerfugleaktivitet og oviposition efterfulgt af korte mørke hvileperioder. - Opdater vatpinde i hver kop med aromatiseret sportsdrik via sub-Q sprøjte og tåge regelmæssigt med vand ved hjælp af en plastik sprayflaske ca hver 2-3 h eller efter behov.
BEMÆRK: Dette giver tilstrækkelig kunstig nektar og fugt til at gøre det muligt for sommerfugle at fri-feed som ønsket. Det øger derved både voksnes levetid og oviposition produktivitet under laboratorieforhold, hvor levende, blomstrende plantemateriale ikke let kan udnyttes. - Monitor kopper regelmæssigt og erstatte værtsanlæg med friske stiklinger efter behov.
- Når æggene begynder at klækkes eller tætheden af æg bliver høj, flytte hunn (r) til en ny kop med frisk vært og begynde larver protokol med nyfødte.
- Placer hvert oviposition kammer på et laboratorium bænk eller bord ca 19 cm under en 8,5 tommer (21,59 cm) klemme lys med en aluminium reflektor huser en 40 W glødepære (Supplerende figur 5).
3. Larval pleje og vedligeholdelse
- Gentag trin 2.3-2.6 for at samle kopper til larver.
- Når æggene begynder at klækkes, flytte vært plantemateriale med æg og nyfødte larver i en nyligt samlet kop, placere stilken gennem den anden "X" i bunden sikre, at planten stilk er i vand og blade røre tilstødende frisk vært skæring.
- Når larver er unge (neonat-2 instar), kontrollere larve kopper dagligt for friskhed af værtsplante materiale og tilstedeværelsen af mug eller overdreven frass.
BEMÆRK: Daglig fjernelse af værtsmateriale anbefales ikke, når larver er unge, da dette kan resultere i skade på organisme på grund af håndtering og/eller unødvendigt spild af frisk værtsmateriale. - Hvis værtsmaterialet er visnet eller i dårlig stand, skal du sætte endnu en opskæring af frisk værtsmateriale i koppen, så det rører ved eksisterende blade og lader larver flytte til den nye vært på egen hånd.
- Når larver når den 3rd instar, erstatte papir kop og tilføje frisk vært materiale dagligt.
- Brug en lille kamel hår akvarel pensel til forsigtigt at flytte larver fra den gamle vært materiale eller kop overflade til frisk vært materiale i den nye kop.
- Placer det gamle værtsmateriale i en tom rektangulær plastmadopbevaringsbeholder.
- Gentag trin 3.5-3.7 dagligt, og indtil alle kopper med larver er blevet behandlet.
- Når det er færdigt, tilsættes en lille mængde frisk værtsmateriale oven på planteaffaldet i fødevareopbevaringsbeholderen og læg løst låg ovenpå.
BEMÆRK: Dette tjener som en sikkerhedsforanstaltning, hvis nogen larver overses under den daglige behandling, fordi de vil kravle ind på det nye værtsmateriale oven på anlæggets affald og kan fjernes næste dag. - Kæber under laboratorietemperatur mellem 25 °C-28 °C for optimal larveaktivitet og udvikling (supplerende figur 6).
BEMÆRK: For at nå optimale opdrættemperaturer under indendørs forhold er det ofte nødvendigt at placere kopper under klemmelys med aluminiumsreflektorer med 40 W glødepærer. Temperaturerne kan derefter overvåges aktivt ved hjælp af et sporbart hukommelsesovervågningstermometer og lyshøjden justeret for at nå optimale opdrætsforhold.
4. Konstruktion af hvalpekammeret
- Skær et enkelt ansigt bølgepap papir rulle i lige store 3,8 cm x 3,8 cm firkanter.
- Placer en firkant i en 2 ounce klar plast del kop.
- Placer koppen på en klar plastik kop bakke (Supplerende figur 7).
5. Forberedelse af larver til hvalpe
- Identificer modne larver klar til at puppe under daglig kolonibehandling.
BEMÆRK: Sådanne larver vil vende en ensartet kedelig grønbrun, mister deres chevrons, og ofte vandre væk fra værten. - Fjern forsigtigt hver moden larver med en lille kamel hårakvarel pensel eller pincet og placere en i hver pupation kammer.
- Fast snap den klare plast låg på pupation kammer.
- Trin 5.1-5.3 gentages, indtil alle larver, der er klar til at dæge, er blevet overført til hvalpekamre, der efter behov tilføjer nye plastbakker (supplerende figur 8).
6. Vedligeholdelse af pupper
- For hver bakke med hvalpekamre skal datoen for den første dåring og alle andre relevante oplysninger anføres (dvs. genetisk linje, forsøgsforsøg osv.).
- Tilknyt bakker efter dato og anbring sat på et sikkert sted i laboratoriet (supplerende figur 8).
- Overvåg bakker dagligt for voksen eclosion.
BEMÆRK: Laboratorieforhold såsom temperatur vil i høj grad påvirke udviklingstiden. - Før voksen eklosion (typisk inden for 10 dage efter den første pupation), skal du fjerne låget fra individuelle hvalpekamre og placere bakken i et 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm sammenklappeligt mesh pop-up opdrætsbur (supplerende figur 9).
BEMÆRK: Pupper sikkert fastgjort i rillerne på de bølgepap firkanter lette vellykket voksen eclosion (Supplerende figur 10). - Gentag hele protokollen fra trin 1.1 for den efterfølgende bundne generation.
7. Vurdering af udviklingstiden for umodne faser og antallet af stadionia
- Placer en enkelt larver under et dissekeret mikroskop. Brug en lille kamel hår akvarel pensel til omhyggeligt at flytte og isolere larver for at undgå skade på organismen.
- Dyp et enkelt hår af pensel i ugiftig lysende maling(Tabel over materialer),og forsigtigt sætte en lille dråbe maling på bagsiden (dorsum) af larver. Brug en malingfarve, der skiller sig ud fra larvernes baggrundsfarve og mønsterfarve (supplerende figur 11). Sørg for at undgå at placere maling på hovedet af larverne.
- Når malingen tørrer (ca. 30 s eller deromkring), placere hver enkelt larver i sin egen 2 ounce klar plast portion kop indeholder ca 1-3 små blade af frisk terminal vært materiale og skrive en unik identifikator på kop og låg (Supplerende figur 12).
- Kontroller omhyggeligt hver larver dagligt. Fjern blade og sæt dig ind på hvid overflade. Undersøg kop, klart låg, og undersøge blade under et dissecting mikroskop for tilstedeværelsen af larve exuviae (støbt skind) og / eller hoved kapsler.
- Hvis der findes en larveexuvia, skal du fjerne den fra koppen og placere den i et mikrocentrifugerør mærket med det tilsvarende kopnummer og datoen (se trin 8.1-8.6. nedenfor).
- Repaint larver efter hver smeltet og registrere smeltet datoer.
- Mål den samlede kropslængde (hoved til sidste abdominalsegment) af hver larver dagligt ved hjælp af digitale calipre. Tag tre målinger og registrere gennemsnittet af de tre, sammen med dato og klokkeslæt. For tidlige instar larver, bør et forstørrelsesglas eller dissekere anvendelsesområde anvendes ved måling for at sikre nøjagtige målinger.
- Returner larver til den tilsvarende plastikportionkop.
- Tilføj frisk vært materiale efter behov og fjerne alle frass og gamle vært vragrester. Hvis mug findes i koppen, bortskaffe og bruge en ny kop. Skriv det korrekte entydige identifikatornummer på den nye kop.
- Gentag trin 7.5-7.9, indtil alle larver når deres sidste instar og begynde prepupal fase. Når larver ophøre fodring, drej en ensartet kedelig grønlig-brun farve, mister deres chevrons, og ofte vandre væk fra værten, minimere forstyrre dem.
- Læg et lille stykke bølgepap i koppen (se trin 4.1).
- Når hver larver er fuldt pupated, måle sin samlede længde som i trin 7.8 ovenfor og registrere datoen for hvalpe. Dette vil være den sidste molt af hver enkelt.
- Check på pupper dagligt og registrere eclosion dato og køn af hver resulterende voksen sommerfugl.
- Mål vingeakkordlængden for hver sommerfugl ved hjælp af digitale calipre. Sommerfugle kan forsigtigt holdes med pincet til måling. Hvis sommerfuglen er for aktiv til nemt at måle, skal du midlertidigt placere den i køleskab i 30 s eller mindre og prøve igen.
8. Indsamling af larve exuviae
- Når der observeres en larveexuvia, fyldes et mikrocentrifugerør med 0,2 μl glycerin. Mærk toppen af låget og siden med larvernummer, dato for molt og hovedkapsel (H.C.).
BEMÆRK: Larverne af nogle lepidopteran larver regelmæssigt forbruge deres exuviae men hovedet kapsel bør forblive. - Placer larve exuvia og den tilhørende hoved kapsel i en klar plast del kop låg og sætte et par dråber ethanol i det.
- Undersøg larve exuvia under et dissekeret mikroskop ved at placere det i en klar plast portion kop låg og sætte et par dråber ethanol på den. Hvis larvehovedets kapsel allerede er adskilt fra exuvia, skal du placere en dråbe glycerin på spidsen af spidse entomologiske pincet og forsigtigt røre hovedkapslen til glycerin. Placer hovedkapslen i det tilhørende mikrocentrifugerør.
- Hvis hovedkapslen stadig er fastgjort til larve exuvia, skal du bruge spidse pinps og en insektstift til at adskille hovedkapslen fra larve exuvia.
- Når den er adskilt, skal du bruge glycerinteknikken til at opfange hovedkapslen. Hvis der er for meget ethanol, kan du bruge en lille køkkenrulle til at fjerne nogle, men pas på ikke at uheld fjerne hovedet kapsel.
- Placer hovedkapslen i et mærket glycerinfyldt hætteglas, og luk låget tæt.
Representative Results
I løbet af to separate bevaringsinitiativer rettet mod genopretning af Cyclargus thomasi bethunebakeri fra februar 2003 til december 2010 og fra november 2016 til i dag blev denne protokol brugt til med succes at producere et overskud på 51.052 levedygtige organismer. På grundlag af det etårige resumé af den samlede bundne befolkningsproduktivitet fra juni 2018 til juni 2019 blev der produceret i alt 10.166 levedygtige organismer, svarende til 782,00 ± 118,93 organismer pr. måned over 13 generationer. Tilsvarende var den gennemsnitlige samlede ægproduktion pr. kvinde under laboratorieforhold 114,00 ± 26,12 (n = 12)31. Den deraf følgende betydelige organisme produktivitet rangerer dette program blandt de største sådanne ex situ indsats i USA, sammen med dem af Euphydryas editha taylori, Speyeria zerene hippolyta, og Lycaeides melissa samuelis24. En del af denne produktivitet kan tilskrives det faktum, at sommerfuglen er kontinuerligt ruget, producerer en generation ca hver 4-6 uger i fangenskab. De fleste andre bevarelse avlsprogrammer indebærer taxa, der er univoltin eller bivoltin. Ikke desto mindre, selv for programmer, der involverer ekstremt fecund taxa såsom Speyeria spp., det samlede antal levedygtige organismer produceret til bevarelse omplantning på årsbasis sjældent overstiger et par tusinde32. Derfor har vores bundne befolkning gjort det muligt at lede forskning og omfattende dataindsamling om en lang række vigtige datahuller, der er vigtige for at forbedre den bedste laboratorieavls- og opdrætspraksis(figur 1)samt hjælpe med at informere genopretnings- og ledelsesbeslutninger.
Gennemsnitlig samlet udviklingstid fra nyfødte larver til voksen var 28,63 dage(tabel 1). Størstedelen af larverne havde fire molts (figur 2, figur 3), selv om to havde fem molts, og den ene havde seks molts. Den samlede gennemsnitlige længde af alle larve instars var 5,97 mm, og larver var størst på den fjerde og prepupal liv faser(tabel 1). Når kun medregnet variabler med mere end 30 observationer, den korteste tid blev brugt i de første instar og prepupal faser, og den længste blev brugt som pupper (tabel 1, Figur 2). Hunnerne udviklede sig typisk hurtigere i alle umodne stadier sammenlignet med mænd, selv om dette ikke var en signifikant effekt (p = 0,625). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af RStudio Version 1.1.463 (R Core Team 2016)33. Den gennemsnitlige voksen vingeakkord længde var 12,64 mm(Tabel 2),og der var en betydelig forskel mellem kønnene (p = 0,047). Den tosidede t-test blev kørt for at evaluere vingeakkordforskellen mellem kønnene. Lineær regressionsmodel og trinvis regression for gennemsnitlig længde af hvert livsstadie viste, at pupallængde var den bedste prædiktor for voksenvingeakkordlængde(tabel 3, tabel 4). Regressionsmodeller for udviklingstid viste, at antallet af dage brugt i den anden og fjerde instars og det samlede antal dage var de bedste prædiktorer for voksen vingeakkordlængde, men kun antallet af dage i fjerde stjerne var betydeligt (tabel 5, tabel 6). Da variablerne var kontinuerlige, blev der kørt to lineære regressionsmodeller til udviklingstiden for hvert livsstadie samt længden af hvert livsstadie med voksenvingeakkordlængde som den afhængige variabel. Trinvisregressioner blev kørt på begge regressionsmodeller for at bestemme de bedste prædiktorer for voksenvingeakkordlængde.
Supplerende figur 1: Fastgjorte prøver af voksne Cyclargus thomasi bethunebackeri. (A)Voksne han, dorsal (venstre), ventrale (højre). (B)Voksen hun, ryg (venstre), ventral (til højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 2: Screenet flight cage til huse i temperaturstyret drivhus. (A) Interiør viser potteplanter voksne nektar planter og en enkelt potteplanter larve vært plante. (B) Metal reoler hjælper med at ophøje potteplanter nektar planter, således at der ikke er mere end 30 cm plads fra den indvendige toppen af buret til de højeste blomstrende blomster. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 3: Procedure for indsamling af voksne par i copula. (A) Parring par voksne Cyclargus thomasi bethunebakeri inde i screenet flight cage (kvindelige, højre og mandlige, venstre). (B) Parringspar, der er indsamlet fra flyveburet i snapcap-hætteglas og bragt ind i laboratoriet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 4: Procedure for samling af ovipositionkammer. (A) To kop system med terminal vært materiale og vatpinde. B) En 1 ml sub-Q sprøjte (0,45 mm x 16 mm) med aromatiseret sportsdrik, der mætter vatpinde i papirkoppen. (C) Kopper boliger gravid hunner sikret med sort tyl. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 5: Laboratorieopsætning til maksimering af ægproduktionen. (A) Oviposition kamre placeret på et laboratorium bænk under en klemme lys med en 40 W glødepære. (B) Der anbringes et sporbart hukommelsesovervågningstermometer ved siden af lysene, hvor temperaturføleren hviler oven på et ovipositionkammer, der er placeret direkte under et klemmelys. (C)En 1 ml sub-Q sprøjte og lille bægerglas bedrift aromatiseret sportsdrik placeret ved siden af oviposition kamre for at lette forfriskende vatpinde regelmæssigt hele dagen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 6: Laboratorieopsætning for kærvarepleje og vedligeholdelse. (A) To kop system med hver indeholdende frisk terminal vært materiale og larver. B) Temperaturen i kopperne holdes mellem 25 °C-28 °C for optimal larveaktivitet og udvikling ved luftklemmelys med 40 W glødepærer. C) Et sporbart hukommelsesovervågningstermometer med temperaturføleren placeret direkte i en kop bruges til at overvåge temperaturen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 7: Tilberedte hvalpekamre. (A) Individuelle plast portion kopper til huse på den klare plast kop bakker. (B) Der anbringes en bølgepapfirkant i hver plastikportionkop. (C)En enkelt moden larver vil blive placeret i hver tilberedt plast portion kop at pupate. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 8: Forberedelse af larver til pupmer og pupal vedligeholdelse. (A) Modne larver klar til at pupate på bølgepap. Det er en ensartet kedelig grønlig-brun og har mistet nogen chevrons. (B) Hvalpekamre klar til at modtage modne larver støder op til kopper med fodring larver. Alle hvalpekamre med låg hus larver, der forbereder sig på at pupate. (C) Hvalpekamre med pupper. D) Banker af hvalpekamre med pupper, der er organiseret efter dato og vedligeholdes under laboratorieforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 9: Laboratoriedukkebur. (A) Et sammenklappeligt mesh-pop-up-opdrætsbur, der huser de besatte hvalpekamre. (B) Låget af alle hvalpekamrene fjernes for at lette en vellykket vokseneklosion. (C) Alle deraf følgende levedygtige voksne sommerfugle vil blive frigivet i den screenede flight cage for at sikre en vellykket samleje. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 10: Voksen mandlig sommerfugl held afskærme fra pupper på en bølgepap papir firkant. (A) Voksen afskærme fra pupper. (B)Voksen helt fjernet fra hvalpehuset. (C) Voksen placeret til at udvide sine vinger. (D) Voksen udvide sine vinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 11: Femte instar larver markeret med ugiftig lysende maling. (A) En lille dråbe kontrasterende rød, ugiftig lysende maling er placeret på dorsum ved hjælp af en pensel til at kunne markere larver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 12: Opdræt sat op til livshistorie undersøgelse. (A) Entydigt mærket 2 ounce klar plast portion kopper. (B) En enkelt larver er afsat i hver kop. (C) Alle larver spores individuelt gennem alle udviklingsstadier fra nyfødte til voksne sommerfugl. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 1: Antal registrerede par i copula baseret på temperatur (°C) inden for et walk-in, screenet flyvebur til huse i et temperaturstyret drivhus. Temperaturen blev registreret inden for de første 2 minutter af en vellykket parringbegivenhed (n = 411). De resulterende data blev brugt til at hjælpe med at forfine de kontrollerede miljøforhold for at maksimere parringssuccesen og i sidste ende den samlede bundne formeringsproduktivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gennemsnitlig udviklingstid (antal dage) i hver umoden livsfase. (A) Søjler viser gennemsnitfor hver gruppe, og fejllinjer repræsenterer de øvre og nedre standardafvigelsesværdier for hver gruppe. (B) Mørkeblå stænger repræsenterer hunner, og lyseblå repræsenterer hanner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Hovedkapsler indsamlet fra individuelle #25 ved hjælp af livsforsikringsprotokol. Hovedkapsler blev fotograferet af Johnathan Bremer ved hjælp af et automontagesystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Livsfase | Gennemsnitlig kropslængde (mm) | Std. Fejl (længde) | Gennemsnitlig udviklingstid (num. dage) | Std. Fejl (f.eks. tid) |
| Instar I | 1.69478261 (n=23) | 0.02152643 | 2.90625 (n=32) | 0.08229783 |
| Instar II | 2.77248958 (n=32) | 0.04302826 | 3.375 (n=32) | 0.16649857 |
| Instar III | 5.45751042 (n=32) | 0.12120829 | 3.5 (n=32) | 0.20080483 |
| Instar IV | 10.2369688 (n=32) | 0.23653991 | 3.875 (n=32) | 0.18917265 |
| Instar V | 8.7625 (n=2) | 2.6125 | 1.5 (n=2) | 0.5 |
| Instar VI | 10.2666667 (n=1) | Na | 3 (n=1) | Na |
| Pre-puppe | 11.0858333 (n=24) | 0.23948251 | 2.9375 (n=32) | 0.21504641 |
| Puppe | 9.0316129 (n=31) | 0.12106792 | 11.6578947 (n=38) | 0.3272288 |
Tabel 1: Gennemsnitlig længde og udviklingstid for hver livsfase. Standardfejl inkluderet for hver variabel og eksempelstørrelse i parenteser.
| Livsfase | Gennemsnitlig vingeakkordlængde (mm) | Std. Fejl |
| Voksen | 12.63895 (n=38) | 0.1365516 |
| Kvindelige | 12.960 (n=13) | 0.1465588 |
| Mandlige | 12.472 (n=25) | 0.1863205 |
Tabel 2: Gennemsnitlig forvingevingeakkordlængde for voksne sommerfugle. Omfatter midler til kvinder, mænd og alle voksne (begge køn kombineret).
| LM Model 1 | Std. Fejl i skøn | t værdi | p-værdi |
| Opfange | 1.9179 | 3.128 | 0.0046 ** |
| Gennemsnitlig længde anden instar | 0.6822 | -1.11 | 0.278 |
| Gennemsnitlig længde tredje instar | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| Gennemsnitlig længde fjerde instar | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| Gennemsnitlig længde pupper | 0.246 | 3.957 | 0.0005 *** |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. | |||
Tabel 3: Koefficienttabel for lineær regressionsmodel (LM Model 1) til at evaluere forholdet mellem den gennemsnitlige længde af hvert livsstadie (n > 30 inkluderet i analysen) og voksenvingeakkordlængde. Afhængig variabel: voksen vingeakkordlængde (mm).
| Koefficienter | Std. Fejl i skøn | t værdi | Pr (>|t|) |
| Opfange | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| Gennemsnitlig længde pupper | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
Tabel 4: Trinvis regression (trinvis 1). Afhængig variabel: voksen vingeakkordlængde (mm).
| LM Model 2 | Std. Fejl i skøn | t værdi | p-værdi |
| Opfange | 1.1888 | 12.643 | 4.21e-12 *** |
| Num. dage første instar | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| Num. dage anden instar | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| Num. dage tredje instar | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| Num. dage fjerde instar | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| Num. dage før puppe | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| Num. dage puppe | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| Samlet antal dage | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. | |||
Tabel 5: Koefficienttabellen for lineær regressionsmodel (LM Model 2) for at evaluere forholdet mellem udviklingstid og voksenvingeakkordlængde. Afhængig variabel: voksen vingeakkordlængde (mm).
| Koefficienter | Std. Fejl i skøn | t værdi | p-værdi |
| Opfange | 0.89304 | 16.314 | 7.86e-16 *** |
| Num. dage anden instar | 0.17974 | -1.809 | 0.0811 • |
| Num. dage fjerde instar | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| Samlet antal dage | 0.04184 | -1.787 | 0.0848 • |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05; • p < 0,1 | |||
Tabel 6: Trinvis regression (trinvis 2) for udviklingstid. Afhængig variabel: voksen vingeakkordlængde (mm).
Discussion
Her illustrerer vi effektiviteten af denne dokumenterede ex situ bevarelse avl protokol for masseproduktion af udsatte sommerfugle, og hvordan det kan tilpasses til videnskabelig forskning for at hjælpe med at løse centrale adfærdsmæssige, livshistorie, eller økologiske data huller. Øget forståelse af gennemsnitlig samlet udviklingstid (æg til voksen), gennemsnitlig varighed i hvert liv fase, og optimal temperatur for parring, for eksempel, blev brugt til at hjælpe med at forfine protokollen og forbedre den samlede program succes. Langt størstedelen af de eksisterende protokoller beskriver kun organismeopdrætsmetoder og diskuterer ikke dataindsamling, videnskabelig forskning eller anvendelse af sådanne resultater for at hjælpe med at informere og potentielt tilpasse ex situ-metoder.
Denne protokol kræver daglig organismeopdræt. Organisme sundhed og produktivitet er maksimeret ved rene opdræt betingelser, en mangel på organisme overbelægning, og tilgængeligheden af høj kvalitet larve vært plantemateriale. For det meste, vi udnytter engangsopdræt forsyninger og beholdere (f.eks papir og plast kopper), og typisk erstatte dem regelmæssigt, ofte dagligt, og aldrig genbruge materialet. Dette er både omkostningseffektivt og minimerer behovet for mere arbejdskrævende sanitet af materialer. Almindeligt anvendte værktøjer, dog, såsom entomologiske pincet, akvarel penselbørster, og små pop-up flight bure, samt alle opdræt overflader såsom bordplader og laboratorium bænk toppe er regelmæssigt desinficeret ved hjælp af en 5% blegemiddel løsning. Den nøjagtige tidsplan for sanitet er meget afhængig af hyppigheden af brug, organisme fenologi, og andre variabler, og bør være skræddersyet til de specifikke behov i hver ex situ program. Vi finder desuden, at hvidt slagterpapir er nyttigt til at dække alle opdrætsflader. Det giver en billig, let deployerbare rene substrat, og den hvide baggrundsfarve letter observation af eventuelle omstrejfende organismer. For daglig etage bør alt laboratoriepersonale altid bære engangslaboratoriehandsker for at minimere kontaminering og beskytte personalet mod enhver potentiel hudirritation som følge af plante- eller organismehåndtering. Dette er især kritisk, hvis nogen laboratorium personale har husdyr, der kræver aktuelle loppe behandlinger. Selv en lille mængde af aktive ingrediens rester kan være farligt for dyr i fangenskab.
Derudover bør der udvises forsigtighed for at minimere overbelægning af organisme. Overbelægning af larver kan hurtigt føre til nedsat organisme sundhed og endda kannibalisme i visse taxa, især Lycaenidae. Det kan være nødvendigt regelmæssigt at adskille larver for at reducere antallet i opdrætsbeholdere og/eller endog isolere individuelle larver som beskrevet i protokollens historiedel. De ideelle tal pr. container kan variere betydeligt baseret på den særlige taksoning og forskellige ex situ-programbegrænsninger såsom tilgængeligt budget, laboratoriefaciliteter og det samlede antal mandpersonale. Vi anbefaler ligeledes at efterlade tilstrækkelig plads mellem kopper huslarver for at minimere potentialet i organisme bevægelse mellem beholdere. Endelig anbefales det for større bundpopulationer at adskille lagermellem et eller flere laboratoriefaciliteter. Denne beskyttelsesstrategi kan hjælpe med at minimere katastrofale tab af hele befolkningen på grund af sygdom eller andre uforudsete virkninger.
Larval vært plante kvalitet og tilgængelighed drev husdyrproduktion og stærkt påvirker både larve udviklingsrater og generelle befolkning sundhed. Ikke desto mindre fremhæver kun få offentliggjorte rapporter eller undersøgelser dette backstage-krav eller diskuterer bedste planteskolepraksis. Vellykket ex situ program planlægning skal tegne sig for tilstrækkelige anlæg mængder, produktion og vedligeholdelse. Da mange larver også kræver eller foretrækker visse plantedele (f.eks. terminal ny vækst, blomsterknopper og blomsterstande, frugt osv.), effektiv iscenesættelse for at sikre passende plantefenologi er påkrævet.
Yderligere overvejelser omfatter passende demografisk og genetisk forvaltning, og minimering af eventuelle negative virkninger af fangenskab. Vi anbefaler, at der udvikles en plan for genforvaltning. Dette kan omfatte strategier til at omfatte infusion af nyt genetisk materiale på regelmæssig basis, maksimere mangfoldighed og forhindre tæt indavl, regelmæssigt evaluere centrale organisme fitness variabler, og overvåge genetik på et vist niveau for at muliggøre sammenligning med eksisterende populationer og kontrollere fangenskab bestand sundhed. Periodisk sammenligning af de personer, der er bundet til personer fra de stiftende befolkninger , er også berettiget til34,35.
Disse protokoller repræsenterer dokumenteret bedste praksis. De bør være til gavn for en række forskere og bevarelse praktiserende læger, der direkte kan anvende eller tilpasse vores metoder til deres egne undersøgelser og ex situ udsatte sommerfugl eller insekt bevarelse og nyttiggørelse programmer. Den specifikke skitserede fangenskab avl protokol er sandsynligvis mest anvendelig for programmer fokuseret på andre Lycaenidae, relaterede taxa, eller mindre størrelse taxa. Ikke desto mindre, mange komponenter såsom dem, der involverer sikring af vellykket frieri og samleje, voksen vedligeholdelse med kunstig nektar, maksimere oviposition, og generel larve pleje kunne velsagtens være mere bredt anvendt eller tilpasset til en bredere vifte af taxa. Som tidligere nævnt, mens protokol fleksibilitet bør understreges, adgang til andre etablerede metoder kan bidrage til at give værdifuld indsigt og et levedygtigt udgangspunkt for tilpasning og innovation. De metoder, der præsenteres for vurdering af forskellige livshistoriske karakteristika såsom larve udviklingstid og antallet af larve stadia velsagtens har bred anvendelighed til andre bevarelse avlsprogrammer og udsatte taxa. Vi opfordrer andre til at hjælpe med at afhjælpe vigtige huller i økologiske data, når det er muligt, og til at offentliggøre kontrollerede protokoller og programresultater.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den amerikanske Fish and Wildlife Service's Conservation Recovery Initiative (F17AP00467) og Disney Conservation Fund. Yderligere støtte blev ydet af Florida Museum of Natural History og Institut for Entomologi og Nematologi ved University of Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 oz plain white paper cups (Karat) | Lollicup | C-KC16 | |
| 15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer | Lowes | UTTNI2423 | |
| 1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm) | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 oz clear plastic portion cup lids | Party City | #791091 | |
| 2 oz Clear Plastic Portion Cups | Party City | #791088 | |
| 34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage | Bioquip | 1466BV | |
| 8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light | Lowes | PTC301L | |
| Adoric Electronic Digital Caliper | Amazon.com | B07QX2SK2F | |
| Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes | Walmart | #10965135 | |
| Clear Plastic Cup Tray | Frontier Scientific Services | AG_9040 | |
| Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer | Fisher Scientific | 15-077-8D | |
| Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless | BioQuip | 4531 | |
| Humco Glycerin 6 oz | Walmart | #303951037966 | |
| Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram | Bioquip | 1166A | |
| Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink | Walmart | #568456137 | |
| Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer | Amazon.com | NTK026 | |
| Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile | Amazon.com | 24-272C | |
| Plastic Tank Sprayer | Lowes | #5318 | |
| Q-tips Cotton swabs | Walmart | #551398298 | |
| Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid) | Walmart | #554320171 | |
| Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip | Amazon.com | #787793151378 | |
| Single face corrugated paper roll | Amazon.com | BXSF12 | |
| Snap blade utility knife | OLFA | #5023 | |
| Solo 9 oz plastic cups | Solo | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.) | Thorton Plastics | #50 | |
| Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black | Jo Ann Fabrics | #16029696 | |
| Zep 32 oz Plastic Spray Bottle | Lowes | HDPRO36 |
References
- Thomas, J. A.
- Swengel, S. R., Schlicht, D., Olsen, F., Swengel, A. B. Declines of prairie butterflies in the Midwestern USA. Journal of Insect Conservation. 15 (1-2), 327-339 (2011).
- Habel, J. C., et al. Butterfly community shifts over two centuries. Conservation Biology. 30 (4), 754-762 (2016).
- Gilburn, A. S., et al. Are neonicotinoid insecticides driving declines of widespread butterflies? Peer J. 3, e1402 (2015).
- Sánchez-Bayo, F., Wyckhuys, K. A. G. Worldwide decline of the entomofauna: A review of its drivers. Biological Conservation. 232, 8-27 (2019).
- Daniels, J. C., Magdich, M., Tolson, P. Butterfly recovery planning: Determining how to contribute. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 1-21 (2015).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Environmental Conservation Online System. Listed Animals. , https://ecos.fws.gov/ecp (2019).
- Schultz, C. B., Russell, C., Wynn, L. Restoration, reintroduction and captive propagation efforts for at-risk butterflies: a review. Israel Journal of Ecology and Evolution. 54, 41-61 (2008).
- Grow, S., Allard, R., Luke, D. The role of AZA-accredited zoos and aquariums in butterfly conservation. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 23-34 (2015).
- Crone, E. E., Pickering, D., Schultz, C. B. Can captive rearing promote recovery of endangered butterflies? An assessment in the face of uncertainty. Biological Conservation. 139, 103-112 (2007).
- Sanchez, S. J., Daniels, J. C. The butterfly conservation initiative: Developing a new conservation vision through compound eyes. News of the Lepidopterists' Society. 49 (3), 75-77 (2007).
- Wardlaw, J. C., Elmes, G. W., Thomas, J. A. Techniques for studying Maculinea butterflies: I. Rearing Maculinea caterpillars with Myrmica ants in the laboratory. Journal of Insect Conservation. 2 (1), 79-84 (1998).
- Mattooni, R., Longcore, T., Krenova, Z., Lipman, A. Mass rearing the endangered Palos Verdes blue butterfly (Glaucopsyche lygdamus palosverdesensis:Lycaenidae). Journal of Research on the Lepidoptera. 37, 55-67 (1998).
- Pearce-Kelly, P., et al. The captive rearing of threatened Orthoptera: a comparison of the conservation potential and practical considerations of two species' breeding programmes at the Zoological Society of London. Journal of Insect Conservation. 2 (3-4), 201-210 (1998).
- Wells, C. N., Edwards, L., Hawkins, R., Smith, L., Tonkyn, D. A rearing method for Agrynnis (Speyeria) diana (Lepidoptera: Nymphalidae) that avoids diapause. Psyche. , 1-6 (2011).
- Grosboll, D. N. Captive Rearing the Endangered Mardon Skipper (Polites mardon) and Taylor's Checkerspot (Euphydryas editha taylori) Butterflies: Initial Results (Lepidoptera, Nymphalidae). Proceedings of the species at risk, pathways to recovery conference. , Species at Risk Pathways to Recovery Conference Organizing Committee. Victoria. 1-6 (2004).
- Barclay, E., Arnold, M., Andersen, M., Shepherdson, D. Husbandry manual: Taylor's checkerspot (Euphydryas editha taylori). , 1st edition, Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2009).
- Johnson, J., et al. Captive Rearing of the Laguna Mountains Skipper (Pyrgus ruralis laguanae): Final Report. , (2010).
- Linders, M. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot in South Puget Sound: 2011-2012. 2012 Annual Progress Report to the ACUB Technical Review Committee. , (2012).
- Linders, M., Lewis, K. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot butterfly (Euphydryas editha taylori.): South Puget Sound, Washington, 2012–2013. 2013 Annual Report to the US Fish and Wildlife Service (Cooperative Agreement F12ACI00835), Joint Base Lewis-McChord Fish and Wildlife Program and JBLM-ACUB Technical Review Committee. , (2013).
- Department of Conservation and Research, Toledo Zoo. Propagation Handbook for the Karner Blue Butterfly Lycaeides melissa samuelis. , Fourth edition, (2006).
- Johnson, J. J., et al. Captive Rearing of Lange's Metalmark Butterfly, 2011-2015. United States Fish and Wildlife Service, CVPIA Habitat Restoration Program (F11AP00168). , (2016).
- Andersen, M. J., et al. Oregon Silverspot Butterfly Husbandry Manual. , Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2010).
- Washington Department of Fish and Wildlife. Threatened and Endangered Wildlife in Washington: 2012 Annual Report. Listing and Recovery Section, Wildlife Program, Washington Department of Fish and Wildlife. , Olympia. (2013).
- McGowan, P. J. K., Traylor-Holzer, K., Leus, K. IUCN guidelines for determining how ex situ management should be used in species conservation. Conservation Letters. 10 (3), 361-366 (2017).
- Pearce-Kelly, P., et al. The conservation value of insect breeding programmes: Rationale, evaluation tools and example programme case studies. Insect Conservation Biology: Proceedings of the Royal Entomological Society's 23nd Symposium. Stuart, A. J. A., New, T. R., Lewis, O. T., et al. , 57-75 (2007).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Policy Regarding Controlled Propagation of Species Listed Under the Endangered Species Act. United States Federal Register. 65 (183), 56916-56922 (2000).
- IUCN/SSC. Guidelines on the use of ex situ management for species conservation. Version 2.0. IUCN Species Survival Commission. , Gland, Switzerland. (2014).
- Sutherland, W. J., Pullin, A. S., Dolman, P. M., Knight, T. M. The need for evidence-based conservation. Trends in Ecology & Evolution. 19 (6), 305-308 (2004).
- Daniels, J. C., Nordmeyer, C., Runquist, E. Improving standards for at-risk butterfly translocations. Diversity. 10, 67 (2018).
- Saarinen, E. V. Population genetics of the endangered Miami blue butterfly Cyclargus thomasi bethunebakeri.: implications for conservation. , University of Florida. Gainesville. (2009).
- Becker, T. Propagation and repatriation of the regal fritillary butterfly. , http://titag.org/2016/2016papers/beckerregal.pdf (2019).
- R Core Team. R A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2016).
- Schultz, C. B., Dzurisin, J. D., Russell, C. Captive rearing of Puget blue butterflies (Icaricia icarioides blackmorei) and implications for conservation. Journal of Insect Conservation. 13 (3), 309-313 (2009).
- Frankham, R., Loebel, D. A. Modeling problems in conservation genetics using captive Drosophila populations: Rapid genetic adaptation to captivity. Zoo Biology. 11 (5), 333-342 (1992).
