Summary
ここでは、1)連邦絶滅の危機に瀕しているマイアミ青い蝶(Cyclargus thomasi bethunebakeri)の実験室捕虜伝播のためのプロトコルを提示し、2)未熟な発達時間および幼虫染色体の数などの基本的な生命史情報を評価する。両方の方法は、他の元のsitu保全プログラムでの使用のために適応することができます。
Abstract
危険にさらされている蝶のためのex situベストプラクティスの知識を向上させることは、成功した保全と回復プログラムの結果を生み出す上で重要です。このような捕虜集団に関する研究は、標的分類の行動、生命史、生態学に関する重要な情報ギャップに対処するための貴重なデータを生み出すこともできます。我々は、他の危険にさらされている蝶の元現場プログラム、特にリカエニダ科のモデルとして使用することができる連邦絶滅の危機に瀕しているサイクラス・トマス・ベスネベーケリの捕虜伝播のためのプロトコルを記述する。さらに、他の鱗翅目の実験室研究に適応したex situの方法論を知らせるのに役立つ様々な生命履歴メトリックを記録するためのシンプルで簡単なプロトコルを提供します。
Introduction
研究の増加リストは、蝶の集団の広範かつ深刻な世界的な減少を示しています1,2,3,4,5.これには、危険にさらされている種の大半が含まれます。このような減少を緩和するために設計された保全プログラムは、多くの場合、人口監視、生息地管理と修復、科学的研究、捕虜の伝播、および生物移動6を含む戦略の組み合わせを採用しています。米国とその領土だけでも、合計30の蝶の分類が絶滅危惧種法(ESA)に基づいて絶滅危惧種法(ESA)に記載されており、そのうち21カ所が草案または最終回収計画を承認しています。このような分類では、識別されたリカバリ戦略の半分以上が、キャプティブ伝播またはキャプティブ伝播を評価する必要があることを推奨しています7.蝶のための元の環境保全活動の使用は、近年8、9でかなり成長しており、回復努力10を支援するための重要なツールとなる可能性を秘めています。現在、多くの機関、組織、機関が、少なくとも11のESA上場バタフライタキサ(すなわち、サイクラス・トマス・トマス・ベスヌケリ、ユーフィドリーアス・イーダ・キノ、ユーフィドリア・エディダ・テイラーリ) ヘラクリデス・アリストム、ヘスペリア・ダコタイ、リカイデス・メリッサ・サミュエリス、オアリスマ・ポウェシエク、ピルス・ルラリス・ラグネー 、スペリエリア・ゼレン・ヒッポリタなど、いくつかの危険なタカ(例えば、キャロフリーズ・アイルス、ユーフィマスドライ・ファトン、イデリア、アイダリア、アイドラ、イポリア、アイダリア、イポリア、イポリア、アイダリア、アセリス)、オアリスマ・ポウネク、スピリェアユーマエウス・アタルラ)11.堅牢で成功した努力の数にもかかわらず、プログラム間やアイデア、データ、効果的な方法論、および結果の交換を含む保全実践者間の定期的なコミュニケーションの欠如が残っています。このような知識の共有は、作業の重複を最小限に抑え、全体的なベストプラクティスを改善し、保全への影響を高める上で不可欠です。公開されたヘッドスタート、捕虜の飼育、繁殖、または畜産プロトコルは、危険にさらされている蝶のタキサのために容易に利用でき、しばしば十分な物語の詳細および/またはイラストを欠いているものはほとんどありません。多くの場合、これらの情報の概要は、手順と付随するイメージが限定的で、レプリケーションが困難な場合や、他の分類への適用が困難になり、12、13、14、15を評価するのが困難になります。利用可能なプロトコルの多くは、灰色の文献にのみ存在するか、詳細のレベル、出版年齢、シンポジウム手続き、代理店/資金提供者レポート、または社内マニュアル16、17、18、19、20、21、22、23、24のコンポーネント部分として存在します。
ほとんどの保全プログラムでは、キャプティブ伝播は主に、再導入、強化(拡張)、導入25、26を含む保全転座を支援するために行われる。このような活動は、リストされた種、亜種、または集団の絶滅を防ぐために、全体的な回復戦略の構成要素として戦略的に実施されることを意図している。しかし、これはそのような元のsituプログラムが果たすかもしれないいくつかの他の潜在的な役割の1つであることを注意してください。また、保険(すなわち、難民)集団の維持、一時的な生物救助、回復関連の研究および/または訓練の支援、保全関連の教育および啓発活動の促進を含む。ex situプログラムが単一の目標を持っているか、複数の組み合わせを持っているかに関係なく、保全実践者は、可能な限り重要な情報ギャップを埋めるために、データ収集の機会を最大化する必要があります。これは、危険なタカの大半が一般的に野生の人口減少の前に十分に研究されていないため、特に重要です。結果として得られる、焦点分類の様々な行動、生態学的、または生命史の側面に関する知識の強化は、効果的な種の保全と管理を進めるのに役立ちます29.
ここでは、より大規模な保全と回復プログラムの一環として、連邦絶滅の危機に瀕しているマイアミブルーバタフライ(サイクラーグス・トマシ・ベスヌベーカリ)(補足図1)のために開発された捕虜伝播プロトコルについて詳しく説明します。この場合、捕虜伝播プログラムは、1)既存の野生の集団が失われた場合の保険人口、2)回復および/または管理を知らせる可能性のある特定された生態学的および生命史の知識ギャップを埋めるように設計された研究集団、および3)税の歴史的範囲内のサイトへの保全移転のための実行可能な生物を生成するという3つの特定の役割を果たす。結果として得られるプロトコルは、十年以上にわたって利用され、改善されてきた、よく検証され、証明されています。その結果、記述された技術と方法論は、他の元現場の危険な蝶プログラム、特にリカエニダまたは関連する分類に関わるものに適用または容易に適応できる実行可能なモデルを表していると感じています。我々は、記述されたプロトコルが他のプロトコルよりも優れているとは言いませんが、生産性、ケア、または効率を高めるために、いくつかの方法をより広く適用する機会があると感じています。これは、エウフィドリアス・エディダ・ポリエイリとスペリエリア・ゼレン・カバリタ17、23を含む保全プログラムと同様に、限られたスペースを持つ屋内実験室条件下で行われているので、これは特に当てはまります。多くの他のプロトコルは、しばしば卵胞または幼虫飼育のために鉢植え材料を利用し、捕食者制御、環境制御(湿度、温度)、家畜モニタリング、データ収集、植物害虫の問題、およびいくつかの21、22を挙げるスペースに関連する複雑さの増加につながる可能性があります。最後に、提示されたプロトコルは、捕虜の繁殖のための方法を概説します。他の多くの危険な蝶の保全プログラムは、これらの違いを反映した代表的なプロトコルで頭を始めたり捕らえられたりすることを含みます。多くの場合、マイナーですが、これは他のプログラムがレビューするために利用可能な情報の既存のプールを広めるのに役立つと感じています。ほとんどの元situプログラムは、まれでしばしば十分に研究されていない分類の回復を促進するための先駆的な努力を表しているので、これは重要です。利用可能なプロトコルは、貴重な洞察を提供し、努力の重複を減らし、イノベーションを促進するのに役立つ優れた出発点として役立ちます。「蝶の行動、生命史の特徴、生態学的要件の広範な異なる多様性と、プログラム施設、予算、実践者の専門知識の顕著な違い、およびその他の固有の違いのために、密接に関連する分類であっても、単一の方法論への依存はしばしば制限され、不当です30.特定の分類やプログラムのニーズに合わせた新しいプロトコルを改良または開発する柔軟性は、成功のために不可欠であり、したがって強調されるべきです。さらに、幼虫のインスターの数、個々の発達段階の持続時間、総発達時間、幼虫および膿疱の長さなど、捕虜条件下での生物発達に関する測定基準を収集するための実験室技術を説明する。これらの技術は、元の現場プロトコルを改良したり、フィールドデータを知らせるために使用することができるLepidopteraの生命史研究のための広範な適用性を有する。
Protocol
1. 成人の求愛と交配の成功の確保
- 正常なエプロスションに続いて、実行可能な成虫の蝶を、温度管理された温室にある安全なウォークイン、スクリーニングされたフライトケージに放出します(補足図2)。
注:特定の個人の識別が遺伝的線、ストック起源の分離、または生物の長寿、行動に関連する特定のデータ収集のために望まれている場合、大人は永久的なインクマーカーで翼の腹側表面にマークすることができますなど。- 正確なケージの寸法は異なる場合がありますが、収容された成虫の蝶の密度をサポートし、人間が自由に立ち回ってピボットする余地を提供するために必要な十分な蜜植物材料を収容するための十分なスペースがあることを確認してください。
- 温度調節を超えて、それは悪天候(例えば、大雨、風)からの保護と一緒に封じ込めの第二層を提供することができるように、温室が安全であることを確認してください。
- ケージの内側から最も高い花に30cm以上のスペースがないように、鉢植えの植物材料を高くします(補足図2)。これにより、利用可能な蜜資源への最適なアクセスが可能になり、十分な大人の止まり木が提供され、余分な飛行活動を最小限に抑えることができます。
- 1つの鉢植えのホストプラントをフライトケージに置きます。これにより、合致したペアが見逃された場合でも、生じた卵を収集することができます。
- 一貫した気流を提供します。これは、求愛活動と交配の成功を向上させます。温室の環境では、送風機と固定マウント循環ファンは、換気と空気の動きを高めるのに最適です。ボックスや机のファンなどの小型のポータブル換気も使用できます。
- 27 °Cから 32 °C の間の内部温室温度を維持し、最適な成人活動と交配の成功を促進します。ケージ内の温度は、トレース可能なメモリ監視温度計を使用して監視されます。
- ハンドポンプ、プラスチック製タンク噴霧器、またはガーデンホースを使用して、定期的に(約2時間に1回)スクリーンフライトケージを水で霧化します。
- 50ドラムクリアプラスチックスナップキャップバイアル(材料表)を使用して、スクリーニングされたフライトケージから個々の交配ペアを静かに収集し、バイアルあたり1〜2組を配置し、屋内の飼育室または実験室に輸送します(補足図3)。
2. 卵生産の最大化
- 排卵室を組み立てます。
- 12オンスのプレーンホワイトペーパーカップを取り、スナップブレードユーティリティナイフを使用して、互いに向かい合ってカップの両側に2つの水平カットを行います。各カットは、リムの約1cm下でなければなりません。
- 綿棒を半分に切り、各棒の端を紙コップの両側の2つの水平カットに挿入し、綿棒部分がカップの内部に向かって約2cm伸びるようにします。
- スナップブレードユーティリティナイフを使用して、紙コップの底に2つの「X」カットを作ります。各対角線の切り取りは約1cmの長さでなければなりません。
- 9オンスのプラスチックカップを取り、水道水の約2 cmで底部を埋めます。
- 下部の「X」カットの1つを通して茎を挿入することによって、紙コップに長さ約15cmの新鮮な切口を置きます。約4〜5センチが底部から突き出るように、切り傷を通して茎を押し込みます。
- プラスチックカップにホスト材料を入れた紙コップを入れ、植物の茎が水に入っていることを確認します。
- 1mlのサブQシリンジ(0.45mm x 16mm)にフレーバースポーツドリンクを入れ、紙コップに綿棒の両方を飽和させます。これらは造花として作用する。
注:メロンとフルーツパンチ風味のスポーツドリンクは、最高の蜜の代替を提供します。 - 各交配ペアが分離したら、組み立てられたカップ構成(すなわち、卵子室)に2〜3人の女性を入れます。
- カップを黒いチュールのカットされた正方形の断片(約15cm x 15cm)で覆い、蓋の周りにゴムバンドで固定します(補足図4)。黒いチュールはカップに最高の可視性を提供し、時折チュールに産まれるかもしれないあらゆる卵の容易な識別を提供する。
- 大人の蝶の活動と卵子の動きを刺激します。
- 各卵化室を実験室のベンチまたはテーブルの8.5インチ(21.59 cm)クランプライトの下に約19cm置き、40 Wの白熱電球を収容するアルミニウム反射器を備えています(補足図5)。
注:白熱光は、大人の活動と排卵を刺激するために必要な放射熱を提供します。 - ライトに隣接するトレース可能なメモリ監視温度計を配置し、クランプライトの直下にある卵温室の上に置くように温度センサーを実行します。
注:目標温度範囲は27.5 °C-29 °Cの間です。 - 展開された卵位置チャンバーの総数に応じて、必要に応じて補足クランプライトを追加します。
- プラグクランプライトは、2つのコンセントを備えたプログラム可能な15 Amp 24 h屋内プラグイン機械タイマーに点灯します(30分の時間間隔でプログラム可能)。
- 30分間隔(30分、30分オフの繰り返しサイクル)クランプライトをオンに設定します。
注:この光周期は、大人の蝶の活動と排卵を刺激するために繰り返し可能な期間の照明を提供し、続いて短い暗い休息期間を提供することによって、卵の生産を最大化するのに役立ちます。 - 各カップの綿棒を、サブQシリンジを介してフレーバースポーツドリンクでリフレッシュし、約2〜3時間または必要に応じてプラスチックスプレーボトルを使用して定期的に水で霧を入れます。
注:これは、蝶が必要に応じて自由に供給できるように十分な人工蜜と水分を提供します。これにより、生活、咲植物材料が容易に利用できない実験室条件下での成人の長寿と卵座生産性の両方を高めます。 - 定期的にカップを監視し、必要に応じて新鮮な挿し木でホスト工場を交換します。
- 卵が孵化し始めたり、卵の密度が高くなったりすると、メスを新鮮な宿主と一緒に新しいカップに移し、新生児と幼虫のプロトコルを開始します。
- 各卵化室を実験室のベンチまたはテーブルの8.5インチ(21.59 cm)クランプライトの下に約19cm置き、40 Wの白熱電球を収容するアルミニウム反射器を備えています(補足図5)。
3. 幼虫のケアとメンテナンス
- 手順2.3-2.6を繰り返して、幼虫用のカップを組み立てます。
- 卵が孵化し始めると、卵と新生児の幼虫を含む宿主植物材料を新しく組み立てられたカップに移動し、下部の2番目の「X」を通して茎を置き、植物の茎が水に入り、隣接する新鮮な宿主切断に触れることを保証します。
- 幼虫が若い(ネオネート-2インスター)場合、幼虫のカップを毎日チェックして、宿主植物材料の新鮮さとカビや過剰なフラスの存在を確認してください。
注:幼虫が若いときには、処理や新鮮な宿主材料の不必要な無駄による生物傷害を引き起こす可能性があるため、宿主物質の毎日の除去はお勧めしません。 - ホスト材料がしおれたり、それ以外の場合は、新鮮なホスト材料の別の切断をカップに入れて、既存の葉に触れ、幼虫が自分で新しいホストに移動できるようにします。
- 幼虫が3番目の星に達したら、紙コップを交換し、毎日新鮮なホスト材料を追加します。
- 小さなラクダの髪の水彩画のペイントブラシを使用して、幼虫を古いホスト材料またはカップ表面から新しいカップの新鮮なホスト材料に静かに移動させます。
- 古いホスト材料を空の長方形のプラスチック製食品保管容器に入れます。
- 毎日3.5-3.7のステップを繰り返し、幼虫を含むすべてのカップが処理されるまで繰り返します。
- 完了したら、食品貯蔵容器に植物廃棄物の上に少量の新鮮なホスト材料を追加し、ゆるやかに蓋を上に置きます。
注:これは、幼虫が植物廃棄物の上に新しいホスト材料にクロールし、翌日に取り除くことができるので、毎日の処理中に見落とされる場合のセーフガードとして機能します。 - 最適な幼虫活性と開発のために25°C-28 °Cの間の実験室温度の下でコップを維持し、発達する(補足図6)。
注意:屋内条件下で最適な飼育温度に達するために、40 Wの白熱電球を収容するアルミニウムリフレクターを備えたクランプライトの下にカップを置くことが必要な場合があります。その後、トレース可能なメモリモニタリング温度計と最適な飼育条件に到達するように調整された光の高さを使用して、温度を積極的に監視することができます。
4. 子犬の部屋を構築する
- 1枚の顔の段ボール紙ロールを同じ大きさの3.8 cm x 3.8 cmの正方形にカットします。
- 1つの正方形を2オンスの透明なプラスチック部分カップに入れる。
- カップを透明なプラスチック製のカップトレイに置きます (補足図 7)。
5. 子犬のための幼虫の準備
- 毎日のコロニー処理中に子犬に準備ができている成熟した幼虫を特定します。
注:このような幼虫は、均一な鈍い緑がかった茶色に変わり、シェブロンを失い、しばしば宿主をさまよいます。 - 小さなラクダの髪の水彩塗料ブラシや鉗子でそれぞれの成熟した幼虫を静かに取り除き、各子犬室に1つずつ置きます。
- 子犬の部屋に透明なプラスチックのふたをしっかりとスナップします。
- 子犬を育てる準備ができているすべての幼虫が必要に応じて新しいプラスチックトレイを追加して子犬室に移されるまで、手順5.1-5.3を繰り返します(補足図8)。
6. 子犬の維持
- 子犬の部屋の各トレイについて、最初の子犬の日付と必要な他の関連情報(すなわち、遺伝的ライン、実験試験など)を記録します。
- トレイを、実験室内の安全な場所に日付と場所で整理します(補足図8)。
- 大人の折り返しのために毎日トレイを監視します。
注:温度などの実験室の状態は、開発時間に大きな影響を与えます。 - 成人の性破(通常、最初の子犬の10日以内)の前に、個々の子犬室から蓋を取り外し、トレイを34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm折りたたみ可能なメッシュポップアップケージに入れます(補足図9)。
注:波状の紙の正方形の溝の中にしっかりと取り付けられたPupaeは、正常な大人の腐食を促進します(補足図10)。 - 後続のキャプティブ生成に対して、ステップ 1.1 からプロトコル全体を繰り返します。
7. 未熟ステージの開発時間とスタディア数の評価
- 単一の幼虫を解剖顕微鏡の下に置きます。小さなラクダの毛の水彩絵筆を使って、幼虫を慎重に動かして分離し、生物の損傷を避けます。
- 無毒な発光塗料(材料のテーブル)で絵筆の単一の髪を浸し、慎重に幼虫の背中(ドーサム)に塗料の1つの小さな滴を置きます。幼虫の背景色やパターン色から際立った塗色を使用します(補助図11)。幼虫の頭部にペンキを置かないようにしてください。
- 塗料が乾燥すると(約30s程度)、新鮮な末端のホスト材料の約1〜3枚の小さな葉を含む独自の2オンスクリアプラスチック部分カップに個々の幼虫を置き、カップと蓋に一意の識別子を書きます(補足図12)。
- 毎日各幼虫を注意深く調べてください。葉を取り除き、白い表面にセットします。カップ、透明蓋を検査し、幼虫の滲出物(鋳造皮)および/またはヘッドカプセルの存在について、解剖顕微鏡の下で葉を調べます。
- 幼虫の排泄物が見つかった場合は、カップから取り出し、対応するカップ番号と日付がラベル付けされたマイクロ遠心管に入れられます(下記のステップ8.1-8.6を参照)。
- 各モルトの後に幼虫を塗り替え、モルトの日付を記録します。
- デジタルキャリパーを使用して毎日各幼虫の総体長(頭から最後の腹部セグメント)を測定します。3 つの測定値を取り、日付と時刻と共に 3 つの平均を記録します。初期の星の幼虫の場合、正確な測定を確実にするために測定する際には、拡大鏡または解剖スコープを使用する必要があります。
- 対応するプラスチック部分のカップに幼虫を返します。
- 必要に応じて新鮮なホスト材料を追加し、すべてのフラスと古いホストの破片を取り除く。カップにカビが見つかったら、新しいカップを廃棄して使用してください。新しいカップに正しい一意の識別子番号を書きます。
- すべての幼虫が最終星に達し、プレパペステージを開始するまで、ステップ7.5〜7.9を繰り返します。幼虫が餌をやめたら、均一な鈍い緑がかった茶色の色を回し、シェブロンを失い、しばしば宿主をさまよい、邪魔を最小限に抑える。
- 小さな段ボール紙をカップに入れる(ステップ4.1参照)。
- 各幼虫が完全に子犬になったら、上記のステップ7.8のように全長を測定し、子犬の日付を記録します。これは、各個人の最終的なモルトになります。
- 毎日子犬をチェックし、各結果の大人の蝶の浸食日と性別を記録します。
- デジタルキャリパーを使用して、各蝶の翼弦長を測定します。蝶は測定のために鉗子と穏やかに保持することができる。蝶が簡単に測定するにはあまりにもアクティブな場合は、一時的に30s以下の冷蔵庫に置いて、もう一度やり直してください。
8. 幼虫の排泄物を収集する
- 幼虫の排泄物が観察されたら、マイクロ遠心管に0.2μlのグリセリンを充填する。蓋の上部と側面に幼虫の番号、モルトの日付、ヘッドカプセル(H.C.)のラベルを付けます。
注:いくつかの鱗翅目幼虫の幼虫は定期的に彼らの興奮を消費するが、ヘッドカプセルは残っているはずです。 - 幼虫の排泄物と関連するヘッドカプセルを透明なプラスチック部分のカップ蓋に入れ、その中にエタノールを数滴入れます。
- 幼虫の排泄物を透明なプラスチック部分のカップ蓋に入れ、その上に数滴のエタノールを置くことによって、解剖顕微鏡の下で調べる。幼虫ヘッドカプセルが既に興奮から分離されている場合は、尖ったエンモロジー鉗子の先端にグリセリンを1滴置き、ヘッドカプセルをグリセリンにそっと触れる。頭部カプセルを関連するマイクロ遠心チューブに入れる。
- ヘッドカプセルがまだ幼虫の排泄物に取り付けられている場合は、尖った鉗子と昆虫ピンを使用して、ヘッドカプセルを幼虫の排泄物から分離する。
- 分離したら、グリセリン技術を使用してヘッドカプセルをピックアップします。エタノールが多すぎると、小さなペーパータオルを使って一部を取り除くことができますが、ヘッドカプセルを誤って取り外してしまうのはご注意ください。
- ラベル付きのグリセリンで満たされたバイアルにヘッドカプセルを入れ、蓋をしっかりと閉じます。
Representative Results
2003年2月から2010年12月まで、そして2016年11月から現在までのCyclargus thomasi bethunebakeriの回復を目的とした2つの別々の保全イニシアチブの過程で、このプロトコルは51,052以上の生存可能な生物を生産するために使用されました。2018年6月から2019年6月までの全体の捕虜人口生産性の1年間の要約スナップショットに基づいて、13世代にわたって月782.00±118.93生物を表す合計10,166個の生存生物が生産されました。同様に、実験室条件下でのメス当たりの総卵生産量を平均し、114.00±26.12(n=12)31であった。結果として生じる実質的な生物生産性は、ユーフィドリアス・イーダ・ポリエリ、スペイリア・ゼレン・ヒッポリタ、リカイデス・メリッサ・サミュニス24のものと並んで、米国で最大の元の場所の取り組みの中でこのプログラムをランク付けする。この生産性の一部は、蝶が連続的にブロードされ、約4〜6週間ごとに1世代の捕虜を生み出しているという事実に起因する可能性があります。他の保全繁殖プログラムの大半は、ユニボルチンまたはビボルチンである分類を含みます.それにもかかわらず、Speyeria spp.のような非常にフェクンドなタカを含むプログラムの場合でも、年間ベースで保全転座のために生産される生存生物の総数は、数千32を超えることはめったにありません。したがって、私たちの捕虜集団は、最高の実験室の繁殖と畜産慣行(図1)を改善し、回復と管理の決定を知らせるのに役立つ重要な多数の重要なデータギャップに関する直接的な研究と広範なデータ収集を可能にしました。
新生児幼虫から成虫までの平均総発達時間は28.63日であった(表1)。幼虫の大部分は4つのモルト(図2、図3)を持っていましたが、2つは5つのモルトを持ち、1匹は6つのモルトを持っていました。全幼虫インスターの全平均長は5.97mmで、幼虫は第4および前頭前期のライフステージで最も大きかった(表1)。30個を超える観測値を持つ変数のみを含めると、最短時間は最初の星座とプレパペの段階で費やされ、最も長い時間はpupaeとして費やされました(表1、図2)。女性は通常、男性と比較してすべての未熟な段階でより速く発達したが、これは有意な効果ではなかった(p = 0.625)。統計分析は RStudio バージョン 1.1.463 (R コア チーム 2016)33を使用して行われました。平均成体の翼弦長は12.64mm(表2)で男女間に有意な差があった(p = 0.047)。両サイドt検定は、男女間の翼和音差を評価するために実行された。各ライフステージの平均長さにおける線形回帰モデルおよびステップワイズ回帰は、パパル長が成体翼弦長の最良の予測変数であることを示した(表3、表4)。現像時間の回帰モデルは、第2および第4のインスターで過ごした日数と総日数が成人の翼弦長にとって最良の予測変数であったが、第4のインスターの日数だけが有意であることを示した(表5、表6)。変数は連続性であるため、各ライフステージの現像時間と各ライフステージの長さについて、2つの線形回帰モデルを実行し、従属変数として成翼弦長を使用しました。ステップワイズ回帰は、両方の回帰モデルで実行され、成体翼弦の長さの最良の予測変数を決定しました。
補足図1:成人サイクラストマストキベスネトバレのピン留め標本。(A) 成人男性、後部(左)、腹側(右)。(B) 成人女性、後部(左)、腹側(右)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図2:温度管理された温室に収容されたスクリーニングされた飛行ケージ。(A) インテリアは、鉢植えの成虫の蜜植物と単一の鉢植えの幼虫宿植物を示しています。(B)金属棚は、最も高い咲く花にケージの内部の上からスペースの30cm以上がないように鉢植えの蜜植物を高めるのに役立ちます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図3:コピュラで成人ペアを収集するための手順。(A)スクリーニングされたフライトケージ内の成人サイクラス・トマシ・ベスネベーケリの交配ペア(女性、右、男性、左)。(B) フライトケージからスナップキャップバイアルで回収され、実験室に持ち込まれた交配ペア。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図4:排卵チャンバーを組み立てるための手順。(A) 端子ホスト材と綿棒を備えた2つのカップシステム。(B) A 1 ml サブ Q シリンジ (0.45 mm x 16 mm) と風味のあるスポーツドリンクを使用して、紙コップに綿棒を飽和させます。(C) カップハウジンググレービッド女性は黒チュールで固定。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図5:卵生産を最大化するための実験室のセットアップ。(A) 40 W の白熱電球を備えたクランプライトの下の実験室のベンチに置かれた Oviposition チャンバ。(B) トレース可能なメモリ監視温度計は、クランプライトの直下にある卵温室の上に温度センサーが置かれたライトに隣接して配置されます。(C)A1mlのサブQシリンジと小さなビーカー保持風味のスポーツドリンクは、1日を通して定期的に綿棒をリフレッシュするために、卵槽に隣接して配置される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 6: 幼虫のケアとメンテナンスのための実験室のセットアップ.(A)それぞれ新鮮な末端ホスト材料と幼虫を含む2つのカップシステム。(B) カップ内の温度は、最適な幼虫活動と40 Wの白熱電球を備えたオーバーヘッドクランプライトによる開発のために25 °C-28 °Cの間に維持されます。(C) 温度センサーをカップに直接入れたトレース可能なメモリ監視温度計を使用して、温度を監視します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図7:調製された子犬室。(A) 透明なプラスチック製のカップトレイに収納された個々のプラスチック部分カップ。(B) 各プラスチック部分カップに段ボール紙の正方形を入れる。(C)単一の成熟した幼虫は、子犬を作る各準備されたプラスチック部分のカップに置かれます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図8:子犬とパパルの維持のための幼虫の準備。(A)成熟した幼虫は波形の紙に子犬をする準備ができています。それは均一な鈍い緑がかった茶色で、シェブロンを失っています。(B) 授乳中の幼虫とカップに隣接して成熟した幼虫を受ける準備ができている子犬の部屋.子犬を準備している蓋の家の幼虫を持つすべての子犬の部屋。(C) 子犬と子犬の部屋.(D) 子犬と子犬の部屋の銀行は、日付によって整理され、実験室の条件下で維持されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図9:実験室出現ケージ。(A)占領された子犬室を収容する折りたたみ可能なメッシュポップアップ飼育ケージ。(B) すべての子犬室のふたは、正常な成人の排疹を促進するために取り除かれる。(C) 生じるすべての実行可能な成虫蝶は、成功した交尾を確保するためにスクリーニングされたフライトケージに放出されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図10:成虫の雄蝶が、波状の紙の正方形に子犬から正常にエクロージング。(A) 大人が子犬から目を閉じる。(B) 大人は、完全にパパルケーシングから取り除かれました。(C) 大人が翼を広げる位置に置かれる。(D) 大人が羽を広げる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図11:無毒な発光塗料でマークされた第5のインスター幼虫。(A)対照的な赤、無毒な発光塗料の小さな滴は、正常に幼虫をマークするためにペイントブラシを使用してドーサムに置かれます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 12: 生活史研究のための飼育のセットアップ.(A)一意にラベル付け2オンス透明プラスチック部分カップ。(B) 1個の幼虫を各カップに隔離する。(C) すべての幼虫は、新生児から成虫の蝶まで、全ての発達段階を通して個別に追跡される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図1:温度調節された温室に収容されたウォークイン、スクリーニングされたフライトケージ内の温度(°C)に基づいてコプラに記録されたペアの数。温度は、成功したペアリングイベントの最初の2分(n = 411)以内に記録されました。結果として得られたデータは、嵌合成功を最大化し、最終的には全体的な捕虜伝搬生産性を最大化するために、制御された環境条件を改善するのに役立ちます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:各未熟なライフステージの平均開発時間(日数)。(A) バーは各グループの平均を示し、誤差範囲は各グループの標準偏差の上下の値を表します。(B) 濃い青色のバーはメスを表し、水色は男性を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生命履歴プロトコルを用いて個々の#25から採取したヘッドカプセル。ヘッドカプセルは、オートモンタージュシステムを使用してジョナサン・ブレマーによって撮影されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ライフステージ | 平均体長 (mm) | Std. エラー (長さ) | 平均開発時間 (日数) | Std. エラー (開発時間) |
| インスターI | 1.69478261 (n=23) | 0.02152643 | 2.90625 (n=32) | 0.08229783 |
| インスターII | 2.77248958 (n=32) | 0.04302826 | 3.375 (n=32) | 0.16649857 |
| インスターIII | 5.45751042 (n=32) | 0.12120829 | 3.5 (n=32) | 0.20080483 |
| インスターIV | 10.2369688 (n=32) | 0.23653991 | 3.875 (n=32) | 0.18917265 |
| インスターV | 8.7625 (n=2) | 2.6125 | 1.5 (n=2) | 0.5 |
| インスターVI | 10.2666667 (n=1) | Na | 3 (n=1) | Na |
| プレプパ | 11.0858333 (n=24) | 0.23948251 | 2.9375 (n=32) | 0.21504641 |
| 蛹 | 9.0316129 (n=31) | 0.12106792 | 11.6578947 (n=38) | 0.3272288 |
表1:各ライフステージの平均長さと開発時間。各変数に含まれる標準エラーと、括弧内のサンプルサイズ。
| ライフステージ | 平均翼弦長 (mm) | Std. エラー |
| 大人 | 12.63895 (n=38) | 0.1365516 |
| 女性 | 12.960 (n=13) | 0.1465588 |
| 男性 | 12.472 (n=25) | 0.1863205 |
表2:大人の蝶のための平均翼弦長。女性、男性、およびすべての大人のための手段が含まれています(男女を合わせたもの)。
| LM モデル 1 | 推定誤差 | t 値 | p値 |
| インターセプト | 1.9179 | 3.128 | 0.0046 ** |
| 平均長さ第2の星 | 0.6822 | -1.11 | 0.278 |
| 平均長さ 3 番目の星 | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| 平均長さ第4の星 | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| 平均長さの子犬 | 0.246 | 3.957 | 0.0005 *** |
| p < 0.001;** p < 0.01;* p < 0.05. | |||
表 3: 線形回帰モデルの係数表 (LM モデル 1) 各ライフステージの平均長さ (分析に含まれる n > 30) と、成形翼弦長の関係を評価します。従属変数:大人の翼の和音の長さ(mm)。
| 係数 | 推定誤差 | t 値 | Pr (>|t|) |
| インターセプト | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| 平均長さの子犬 | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
表 4: ステップワイズ回帰 (ステップワイズ 1)従属変数:大人の翼の和音の長さ(mm)。
| LMモデル2 | 推定誤差 | t 値 | p値 |
| インターセプト | 1.1888 | 12.643 | 4.21e-12 *** |
| 最初の星の日数 | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| 数字 2 番目のインスター | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| 数字第3の星 | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| 数字 4日目のインスター | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| 数プレプパエ | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| 数字の子犬 | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| 合計日数 | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| p < 0.001;** p < 0.01;* p < 0.05. | |||
表 5: 線形回帰モデルの係数表 (LM モデル 2) 開発時間と成形翼弦の長さの関係を評価します。従属変数:大人の翼の和音の長さ(mm)。
| 係数 | 推定誤差 | t 値 | p値 |
| インターセプト | 0.89304 | 16.314 | 7.86e-16 *** |
| 数字 2 番目のインスター | 0.17974 | -1.809 | 0.0811 • |
| 数字 4日目のインスター | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| 合計日数 | 0.04184 | -1.787 | 0.0848 • |
| p < 0.001;** p < 0.01;* p < 0.05;• p < 0.1 | |||
表 6: 開発時間のステップワイズ回帰 (ステップワイズ 2)従属変数:大人の翼の和音の長さ(mm)。
Discussion
ここでは、危険な蝶の大量生産のためのこの実証済みの元現場保全繁殖プロトコルの有効性と、主要な行動、生命史、または生態学的データギャップに対処するための科学的研究にどのように適応できるかを説明します。平均総開発時間(卵から成虫)の理解の増加、各ライフステージの平均持続時間、および交配に最適な温度は、例えば、プロトコルを改良し、プログラム全体の成功を高めるのに役立った。既存のプロトコルの大半は、生物の畜の方法のみを詳述し、データ収集、科学的研究、またはex situメソッドを知らせ、潜在的に適応させるためにそのような結果の使用について議論していません。
このプロトコルは、毎日の生物の夫を必要とします。生物の健康と生産性は、清潔な飼育条件、生物の過密状態の欠如、高品質の幼虫宿植物材料の入手可能性によって最大化されます。ほとんどの場合、使い捨て用の飼育用品や容器(例えば、紙やプラスチック製のカップ)を利用し、通常は定期的に、しばしば毎日それらを交換し、材料を再利用することはありません。これは費用効果が大きく、材料のより労働集約的な衛生のための必要性を最小にする。しかし、一般的に使用されるツールは、エントモロジー鉗子、水彩画ペイントブラシ、小さなポップアップフライトケージ、卓上や実験室のベンチトップなどのすべての飼育面は、5%の漂白剤溶液を使用して定期的に消毒されます。衛生の正確なスケジュールは、使用頻度、生物のフェノロジー、および他の変数に大きく依存し、各ex situプログラムの特定のニーズに合わせて調整する必要があります。さらに、白い肉屋の紙はすべての飼育面をカバーするのに役立つことがわかります。それは安価で、容易に展開可能なきれいな基質を提供し、白い背景色はあらゆる迷子の生物の目撃を促進する。毎日の畜産のために、すべての実験室の人員は汚染を最小にし、植物または生物の取扱いから生じる潜在的な皮膚の刺激から人員を保護するために使い捨て実験室の試験の手袋を常に身に着けるべきである。これは、実験室の職員が局所ノミの治療を必要とする家庭用ペットを持っている場合に特に重要です。少量の活性成分残渣でさえ、捕虜の家畜に危険を及ぼす可能性があります。
さらに、生物の過密状態を最小限に抑えるため、注意が必要です。幼虫の過密は、特定の分類、特にリカエニダエの生物の健康の低下、さらにはカニバリズムにつながる可能性があります。幼虫を定期的に分離して飼育容器内の数を減らしたり、プロトコルの生命履歴部分に記載されているように個々の幼虫を単離することも必要である。コンテナあたりの理想的な数値は、利用可能な予算、実験室施設、および畜産員の総数など、特定の分類および様々なex situプログラムの制約に基づいてかなり異なる場合があります。同様に、容器間の生物の動きの可能性を最小限に抑えるために、カップハウジング幼虫の間に十分なスペースを残すことをお勧めします。最後に、より大きな捕虜集団のために、1つ以上の実験室施設間で在庫を分離することを強く推奨する。この保護戦略は、病気やその他の予期せぬ影響による人口全体の壊滅的な損失を最小限に抑えるのに役立ちます。
幼虫のホスト植物の品質と可用性は、家畜の生産を促進し、幼虫の発達率と全体的な人口の健康の両方に強く影響を与えます。それにもかかわらず、公開されたレポートや研究のほとんどは、この舞台裏の要件を強調したり、最良の保育園の慣行について議論したりしていません。成功した前のシステムプログラム計画は、適切なプラント数量、生産、および保全を考慮する必要があります。多くの幼虫はまた、特定の植物部分(例えば、末端の新しい成長、花芽および花の芽、果物、等)を必要とするか、または好むので、適切な植物フェノロジーを確実にするために効果的なステージングが必要である。
その他の考慮事項には、適切な人口統計学的および遺伝的管理、および捕虜の潜在的な悪影響の最小化が含まれる。遺伝管理計画の開発をお勧めします。これには、定期的に新しい遺伝物質の注入を含め、多様性を最大化し、近親交配を防ぎ、定期的に主要な生物のフィットネス変数を評価し、あるレベルで遺伝学を監視して、現存集団との比較を可能にし、捕虜の在庫の健康状態をチェックする戦略が含まれる可能性があります。捕虜の個人の特徴を建国集団の個人に対する周期的な比較も34、35である。
これらのプロトコルは、実証済みのベスト プラクティスを表します。彼らは、直接適用したり、自分の研究に私たちの方法を適応させることができ、直接、危険な蝶や昆虫の保全と回復プログラムを元に、研究者や保全の実践者の様々なに有益であるべきです.特定の概説された捕虜の繁殖プロトコルは、他のリカエニダ、関連する分類、またはより小さなサイズの分類に焦点を当てたプログラムに最も適している可能性が高い。それにもかかわらず、成功した求愛と交尾の確保、人工蜜による成人のメンテナンス、排卵の最大化、一般的な幼虫ケアなど、多くのコンポーネントは、間違いなくより広く適用またはより広いアレイに適応される可能性がありますタキサの。前述のように、プロトコルの柔軟性を強調する必要がありますが、他の確立された方法論へのアクセスは、貴重な洞察と適応と革新のための実行可能な出発点を提供するのに役立ちます。幼虫の発達時間や幼虫の小児の数など、さまざまな生命履歴の特徴を評価するために提示された方法は、間違いなく他の保全繁殖プログラムおよび危険な分類に広範な適用性を有する。可能な限り主要な生態学的データギャップに対処し、精査されたプロトコルとプログラムの成果を公表することを他の人に奨励します。
Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作業は、米国魚類野生生物局の保全回復イニシアチブ(F17AP00467)とディズニー保全基金からの助成金によって支えられました。フロリダ大学のフロリダ自然史博物館と昆虫学・ネマトロジー学科から追加の支援が行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 oz plain white paper cups (Karat) | Lollicup | C-KC16 | |
| 15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer | Lowes | UTTNI2423 | |
| 1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm) | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 oz clear plastic portion cup lids | Party City | #791091 | |
| 2 oz Clear Plastic Portion Cups | Party City | #791088 | |
| 34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage | Bioquip | 1466BV | |
| 8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light | Lowes | PTC301L | |
| Adoric Electronic Digital Caliper | Amazon.com | B07QX2SK2F | |
| Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes | Walmart | #10965135 | |
| Clear Plastic Cup Tray | Frontier Scientific Services | AG_9040 | |
| Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer | Fisher Scientific | 15-077-8D | |
| Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless | BioQuip | 4531 | |
| Humco Glycerin 6 oz | Walmart | #303951037966 | |
| Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram | Bioquip | 1166A | |
| Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink | Walmart | #568456137 | |
| Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer | Amazon.com | NTK026 | |
| Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile | Amazon.com | 24-272C | |
| Plastic Tank Sprayer | Lowes | #5318 | |
| Q-tips Cotton swabs | Walmart | #551398298 | |
| Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid) | Walmart | #554320171 | |
| Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip | Amazon.com | #787793151378 | |
| Single face corrugated paper roll | Amazon.com | BXSF12 | |
| Snap blade utility knife | OLFA | #5023 | |
| Solo 9 oz plastic cups | Solo | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.) | Thorton Plastics | #50 | |
| Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black | Jo Ann Fabrics | #16029696 | |
| Zep 32 oz Plastic Spray Bottle | Lowes | HDPRO36 |
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