Summary
ここで提示する、脂質液滴特異的蛍光色素であるBODIPY 493/503を用いたショウジョウバエ幼虫における卵細胞の解剖および脂質液滴染色に関する詳細な方法である。
Abstract
脂質は、動物の発達と生理学的恒常性に不可欠です。脂質代謝の調節不全は、肥満や脂肪肝などの様々な発達上の欠陥や疾患をもたらす。通常、脂質は細胞内の多機能脂質貯蔵オルガネラである脂質液滴に貯蔵される。脂質液滴は、異なる組織および異なる条件下でサイズと数が異なります。脂質液滴は、その生体発生および分解の調節を通じて厳密に制御することが報告されています。.ショウジョウバエメラノガスターでは、卵子細胞は脂質代謝の重要な組織であり、ストレスに応じて脂質動員に関するヒト肝臓類似体として最近同定されている。しかし、オエノサイトにおける脂質液滴代謝の調節の基礎となるメカニズムは、依然として不可解である。この問題を解決するためには、開発中およびストレスの多い条件下で、大脳細胞の脂質液滴動的変化を直接可視化する信頼性の高い、敏感な方法を開発することが最も重要です。親油性BODIPY493/503を利用して、脂質液滴特異的蛍光色素を、ここで説明する、飢餓に応答してショウジョウバエ幼虫の好色細胞における解剖およびその後の脂質液滴染色のための詳細なプロトコルである。これにより、共焦点顕微鏡による様々な条件下での脂質液滴ダイナミクスの定性的分析が可能となる。さらに、この迅速かつ高度に再現性の高い方法は、食素細胞および他の組織における脂質滴代謝を含む新しい遺伝的要因を同定するための遺伝的スクリーンでも使用することができる。
Introduction
脂質は細胞の生存に不可欠です。細胞膜系の不可欠な構成要素としての従来の役割に加えて、脂質はまた、個々の動物のライフサイクルを通じてエネルギー供給およびシグナル伝達において重要な機能を果たす1.したがって、脂質代謝は、細胞内の生理学的止血を維持するために厳格な規制に準拠する必要があります。脂質代謝の調節不全は、糖尿病や脂肪肝などの様々な疾患を引き起こすことが知られています。動物の健康における脂質代謝の重要性は非常に高いにもかかわらず、脂質代謝調節の根底にあるメカニズムはほとんど未知のままである。
ショウジョウバエは、トーマス・H・モーガン教授が遺伝学やその他の基本的な生物学的質問を含む研究でそれらを使用し始めて以来、長年にわたって広く使用されてきました2.過去数十年の間に、ショウジョウバエは肥満1、3のような多くの脂質代謝関連疾患の研究において優れたモデル生物であることを示している。特にショウジョウバヤは、高度に保存された代謝遺伝子をヒトと共有し、脂質代謝に関連する組織/器官および細胞型を有する。
例えば、トリアシルグリセリド貯蔵を担うショウジョウバアラの脂肪体は、ヒト脂肪組織に類似した機能を有する。近年、ヒト肝臓に対する機能的類似であることが報告されている特殊な肝細胞様細胞(すなわち、食素細胞)の群れが、果実ハエ4、5における脂肪酸および炭化水素代謝に関与していることが示されている。哺乳類の肝臓の場合と同様に、卵形細胞は、幼虫および成体ショウジョウバエの両方で脂質液滴形成を活性化することによって飢餓に反応し、その結果、オエノサイト4、6、7、8に脂質液滴蓄積をもたらす。解剖学的に、大外細胞は腹部半分当たり約6個の細胞のクラスターで横表皮の基底内部表面にしっかりと付着しており、表皮から大外細胞クラスターを分離することは不可能である。したがって、卵外細胞は、解剖および染色中に表皮に付着しなければならない。
脂質は、細胞9に単層膜を有するオルガネラである脂質液滴の形態で貯蔵される。脂質液滴は、異なる種10間でほぼすべての細胞型に存在する。脂質液滴ダイナミクスは、その大きさと数を含め、環境ストレッサーに応答して変化する。これは、加齢や飢餓7、8などのストレスに対する代謝状態の反映とみなされます。したがって、開発中およびストレスの多い条件下で、大エノサイトの脂質液滴ダイナミクスを定性的に決定する実現可能で信頼性の高い方法を開発することが非常に重要です。特に、第3のインスター幼虫において、食血球は、与えられた条件下で検出可能な脂質小滴をほとんどまたは全く含まないが、それらは栄養欠乏後に多数の大きな脂質液滴を含んでいる4である。この方法の有効性を検証するために、飢餓条件下で食細胞における脂質液滴染色を行うことが示唆される。
現在、非蛍光色素スーダンブラックおよびオイルレッドOおよび蛍光色素ナイルレッドおよびBODIPY 493/50311などの脂質液滴染色にはいくつかの親油性染料が利用可能である。スーダンブラックとオイルレッドOは、一般的に組織コレステリルエステルとトリアシルグリセロールのために使用され、光顕微鏡で簡単に検出することができます。しかしながら、比較的高い背景染色と比較的低い分解能は、脂質液滴ダイナミクスの定性的分析におけるその用途のための2つの制限因子である。非蛍光色素の限界を克服するために、ナイルレッドおよびBODIPY 493/503は脂質液滴染色の理想的な代替として利用される。ナイルレッドはまた、BODIPY 493/503を細胞脂質液滴のより特異的な色素にするいくつかの未エステルコレステロールを検出できることが報告されています, ある程度12,13,14.
とりわけ、食素細胞における脂質液滴の迅速かつ敏感な分析の必要性を満たすために、このプロトコルは、染色染料としてBODIPY 493/503を用いた固定性基脂質液滴特異的染色の実現可能かつ再現性の高い方法を提示する。本報告では、オエノサイトを解剖し、BODIPY 493/503をオエノサイトの脂質液滴染色に用い、共焦点顕微鏡で脂質液滴を検出する。このプロシージャの容易さおよび手頃な価格は変更および流れのサイトメトリーのような他の適用の更に使用にとって理想的である。
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Protocol
1. 卵の産み
- 産卵のための標準的なコーンミール食品を準備します。
注:ここで使用される標準的なコーンミール食品のレシピと調理手順については、以前に公開された詳細15を参照してください。 - 50 mL遠心管に4gの活性乾燥酵母に6mLの蒸留水を加えて新鮮な酵母ペーストを調製します。スパチュラを使用して混ぜてペーストを作ります。
- コーンミール食品をボトルに入れ、約1gの酵母ペーストをへらでコーンミール食品の表面に広げて、産卵ボトルを作ります。
- 卵を産むボトルに所望の遺伝子型のハエを入れ、一定温度25°C、湿度60%のインキュベーターに入れます。
注:理想的な十字架は、通常、150の処女ハエと少なくとも75人の男性で構成されています。産卵ボトルの上に防光ボックスを置いてハエを暗く保つことは、再生速度を高めるでしょう。 - 卵を収集する前に、ハエが女性の卵管に保存されているすべての古い卵を除去できるように1時間の卵を産ませてください。
- ハエは1時間の新しい産卵ボトルに卵を産み、ボトルから大人を取り除きます。
注:正確に制御された発達段階内で幼虫を得るために、産卵時間を制御して発達範囲を最小限に抑えます。 - 卵を12時間/12時間の光/暗いサイクルで25°Cのインキュベーターの第3のインキュベーターの第3のインスター幼虫に84時間発達させる。
2. 幼虫の飢餓治療
注:上述したように、第3のインスター幼虫では、正常な摂食条件下での食後球に検出可能な脂質液滴はほとんどまたは全く存在しないが、飢餓などのストレス条件下で多数の大きな脂質液滴が大きな脂質液滴を食い物に誘導することができる。この方法をさらに検証するには、これらの幼虫を引き起こして、卵鼻細胞における脂質液滴生新生を誘導する必要がある。ここでは、12時間、24時間、36時間の飢餓時間経過をパラダイムとして選んだ。特に、飢餓の短期間(例えば、3時間)は、オエノサイトにおいて検出可能な脂質液滴を誘導するのに十分である。飢餓期間は、特定の実験目標や設定によって異なる場合があります。
- 飢餓と制御治療のためのチャンバーを作ります。
- 飢餓処理室の場合:6cmのペトリ皿に適切なサイズの濾紙を置き、PBSのピペット1 mLを濾紙に入れます。
- コントロール治療室の場合:ペトリ皿にブルーミントン標準コーンミール食品の5 mLを置きます。
- スパチュラを使用して、まだ食べ物に埋もれている幼虫を含む食品の最上層を穏やかに掘り起こし、5 mLのPBSで満たされたペトリ皿に移します。PBSで幼虫をそっとかき混ぜて、幼虫からの食物汚染を取り除き、できるだけきれいにします。
- 小さなペイントブラシを使用して、同じおおよそのサイズの40の3番目のインスター幼虫を収集します。それぞれ20個の幼虫を持つ飢餓またはコントロールチャンバーにランダムに並べ替えます。
- 湿度60%の25°Cのインキュベーターにチャンバーを置き、12時間、24時間、36時間の処理を可能にします。
注:飢餓室の幼虫の場合は、幼虫の脱水を避けるために12時間ごとに1mLのPBSを加えます。
3. オエノサイトの解剖
- 小さなペイントブラシを使用して適切な年齢(12時間、24時間、または36時間)の幼虫を選び、5mLの氷冷PBSで満たされた新しいペトリ皿に移して洗浄します。
注:コントロールチャンバーで幼虫を扱う場合は、手順2.2を繰り返して食品汚染を除去します。 - 解剖プレートを氷冷PBSで満たし、鉗子を使用して幼虫を解剖板に穏やかに移します。解剖板をステレオ顕微鏡の下に置き、次の解剖工程を行います。
注:氷冷温度は幼虫のゆっくりとした動きを助け、解剖を促進する。 - 幼虫の腹側を上に回し、背側を下にして鉗子を使用してゆっくりと所定の場所に保持します。幼虫を解剖板に固定し、前端の咽頭と後端の尖塔を通る別のピンを置いて解剖板に固定します。
注:後側は気管の後部幹の存在によって最も容易に識別される。 - バンナススプリングハサミを使用して、前部から後端までの表皮を通して(縦方向に)切開します。
- 鉗子を使用して表皮の内部組織を取り除きます。
注:気管の枝を取り除くときは、表皮の内面に局在する気球の損傷を避けるために注意が必要です。 - 鉗子を使用して、解剖ピンを取り出し、氷上のPBSで満たされた1.5 mLマイクロ遠心管に表皮を移します。
- 上記の手順に従って、他の幼虫を解剖し続けます。
4. 脂質液滴染色
- 回転子の室温(RT)で30分間、固定バッファーで解剖した表皮をインキュベートする。
注:固定バッファーには、PBS に 4% パラホルムアルデヒド (PFA) が含まれています。 - 固定バッファーを取り外し、その後にクイックウォッシュを行います。迅速な洗浄を行うには、PFAの除去後にRTで1mLのPBSをチューブに追加し、組織を穏やかに再懸濁し、PBSを廃棄します。
注意:固定バッファーには PFA が含まれており、これは人間の健康に有害です。固定バッファを有害廃棄物として適切に処分することが重要です。 - サンプルを3xずつPBSで5分間洗浄し、可能なすべてのPFA残基を洗い流します。
- BODIPY 493/503(1μg/mL;材料表参照)で表皮をローテーターのRTで30分間インキュベートします。
注:このステップ以降、マイクロ遠心管をアルミニウム箔で包み、サンプルを光から保護し、可能な光漂白を最小限に抑えます。 - BODIPY 493/503染色液を取り除き、サンプル3xをそれぞれ10分間PBSで洗浄し、残留染料を完全に除去します。
5. 取り付けとイメージング
- 6 μL の取り付け媒体をクリーンな顕微鏡スライドに置きます。
注:取り付け媒体は、そのアンチフェード特性に基づいて、より長い検出時間のために使用されます。 - 鉗子を使用して1つの表皮を拾い、拭き取りで残留PBSを穏やかに取り除きます。
- 表皮を取り付け媒体に入れ、その向きを調整して、オエノサイトを含む内部表面が底面にあり、その外部表面が上部になるようにします。
- 表皮にカバースリップをそっと置きます。
注:必要に応じて、カバースリップの下から漏れる余分な取り付け媒体を拭き取り外します。イメージングを容易にするために、顕微鏡を通してスライドを観察する際に、1つの平面で容易に画像化できるように、鉗子でカバースリップをゆっくりと押し下げます。あるいは、表皮を中央線を通って2本の半表皮に切断し、組織を取り付ける際に表皮全体のロールアップを避けることは可能である。 - カバースリップの縁の周りにクリアマニキュアを塗布してシールします。
- スライドを防光サンプルボックスに入れ、マニキュアをRTで乾燥させ、5~10分かかる場合があります。
- 顕微鏡分析を進めます。共焦点顕微鏡(最適化されたGFPまたはFITCフィルタ設定で63倍の倍率、励起=488 nm、発光=503 nm)を使用して画像を撮影し、背景を最小限に抑えたクリーンで敏感な信号を取得します。
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Representative Results
この手順の正常な実行は、卵細胞内の脂質液滴の数とサイズを明らかにする明確な脂質液滴染色をもたらすはずです。図1A,A',A'''は、異なる発達段階で幼虫に与える正常な食用の大食細胞に検出可能な脂質液滴(緑色の点)がほとんどないことを示している。図1B,B',B''は、12時間(B)、24時間(B')、および36時間(B'')の飢餓に応答して、大エノサイトにおける脂質液滴(緑色の点)量の増加を示す。96時間後、飼料幼虫(A)は、その速い成長速度に起因する可能性がある、食素細胞に脂質滴蓄積を示しているように見えた。研究者は、この段階で幼虫を扱う際に注意を払う必要があります。.
図1:脂質液滴染色の代表的な画像。画像は、BODIPY 493/503を用いたショウジョウバエ幼虫の好中球における発達および飢餓の経過程で示されている。(A,A',A'')飼料幼虫における大食細胞クラスターの代表的な画像の脂質液滴染色(緑色の点)。(B,B',B'')12時間(B)、24時間(B')、および36時間(B')の飢餓の後の卵ノサイトクラスターの代表的な画像における脂質液滴染色(緑色の点)は、84時間齢の幼虫から始まる。すべての画像は同じ倍率で撮影されました。スケール バー = 20 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
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Discussion
上記で概説したものの中で、このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあり、卵の産卵期間はこれらの1つです。脂質動員組織として、大エノサイトは栄養状態6、8に対して高感度である。長期間の産卵期間は、群れた幼虫と食物競争の増加をもたらし、不正確な結果をもたらす可能性があります。このプロトコルで使用される1時間の産卵期間は、幼虫が栄養競争なしで発達することを可能にする。より長い産卵期間から生じる幼虫の数がはるかに多いと、卵形細胞の脂質液滴の量とパターン(例えば、サイズ、数、形態など)にも影響を与える可能性があります。
さらに、長期間の産卵期間は、発達段階の広い変動を伴う幼虫集団にも生じる。この文脈では、脂質滴パターンへの影響は発達欠陥の二次的影響の影響を受ける可能性があるため、胚性または幼虫の発達に影響を与える変異体を使用する際には注意が必要である。タイムコース手順は、脂質液滴が初期の第3のインスター幼虫(84時間)から後期第3のインスター幼虫(120時間)までの発達中に、供給状態の食赤細胞でほとんど検出されないことを示唆している。また、成人におけるオエノサイトのアンバー色素沈着とは異なり、幼虫の大血球は無色5である。したがって、特に周囲の組織(すなわち、気管枝)を除去する場合、オエノサイトへの潜在的な損傷を避けるために、大血球解離時に注意を払う必要があります。さらに、脂質液滴は、トリトンX-1009などの洗剤に敏感である単層膜オルガネラである。したがって、このプロトコルで使用されるバッファに洗剤が含まれていないことを確認することが重要です。
上述したように、ショウジョウバエおよび他の種における脂質液滴量およびパターン変化を決定するために使用されるいくつかの染料がある。これらの中でも、BODIPY 493/503は、他の蛍光(例えば、ナイルレッド)または非蛍光色素(例えば、オイルレッドO)と比較して脂質液滴特異的染色に最も適している可能性があります。しかし、より新しい、高度な染料が開発されています。例えば、LipidSpot 488およびその誘導体は、細胞膜および他のオルガネラの背景染色を最小限に抑えた一連の新開発蛍光色素である。それらは16、17を必要とする洗浄ステップなしで、生きている細胞および固定細胞の両方の脂質液滴の急速な染色を可能にする。この脂質液滴染色プロトコルの制限は、脂質滴の大きさ、数、形態の定性的評価に適しているにもかかわらず、細胞内の脂肪蓄積を定量的に測定するのに最適ではないということです。
耳鼻細胞における脂質液滴染色に加えて、この方法は、組織解離および切除7の間にわずかな修飾を伴う幼虫の他の組織(すなわち、筋肉、脂肪体、および腸組織)にも適用され得る。さらに、この方法はまた、成人組織7の脂質液滴染色のためにもうまく機能する。この方法の改変版は、抗体による免疫ヒストケミストリー染色と組み合わせて、より広範な用途に拡張され得る。この場合、固定組織は、抗体をインキュベートする前に従来の洗剤の代わりにサポニン(RTで30分間0.1%)で透過する必要があり、これは、血漿膜間での抗体の交差および脂質液滴膜完全性の維持を容易にする8。
要約すると、このプロトコルは、特定の遺伝的または環境的操作が脂質滴の量およびパターン(すなわち、サイズ、数、形態)の質的変化を引き起こすかどうかを研究者が調査するための実行可能な方法を提供する。困難な操作と高価な機器や材料。
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Disclosures
著者たちは開示する利害の対立を持っていない。
Acknowledgments
この作品は、中国国立自然科学財団(31671422、31529004、31601112)、111プロジェクト(D18010)、広東ペルリバータレントプログラム(2017BT01S155)の地域革新的研究チームプロジェクト、および31601112からの助成金によって支えられました。中国博士科学財団 (2018M640767).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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