التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا
Summary
وترد هنا طرق مفصله لتشريح وتلطيخ الدهون قطره من البويضات في اليرقات دروفيه باستخدام BODIPY 493/503 ، صبغه فلورية الدهون الخاصة الحبريه.
Abstract
الدهون ضرورية للتنمية الحيوانية والتوازن الفسيولوجي. خلل التمثيل الغذائي للدهون النتائج في مختلف العيوب التنموية والامراض ، مثل السمنة والكبد الدهني. عاده ، يتم تخزين الدهون في قطرات الدهون ، والتي هي متعددة الوظائف الدهنية تخزين الدهون في الخلايا. قطرات الدهون تختلف في الحجم والعدد في الانسجه المختلفة وتحت ظروف مختلفه. وقد أفادت التقارير بان قطرات الدهون يتم التحكم فيها باحكام من خلال تنظيم تكوينها الإحيائي وتدهورها. في دروفوسيلا، البويضة هي نسيج مهم لاستقلاب الدهون وتم التعرف عليها مؤخرا كالتناظرية الكبد البشرية فيما يتعلق بتعبئة الدهون استجابه للإجهاد. ومع ذلك ، فان أليات التي تقوم علي تنظيم الأيض قطره الدهون في البويضات لا تزال بعيده المنال. لحل هذه المشكلة ، فمن المهم للغاية لتطوير طريقه موثوقه وحساسة لتصور مباشره التغيرات الحيوية قطره الدهون في البويضات اثناء التنمية وتحت ظروف عصيبة. الاستفادة من 493/503 bodipy محبه للدهون ، صبغه فلورية قطره الدهون المحددة ، الموصوفة هنا هو بروتوكول مفصل لتشريح والدهون اللاحقة قطره الدهن في البويضات من اليرقات دروفيسيلا ردا علي المجاعة. وهذا يسمح للتحليل النوعي لديناميات القطيرات الدهنية في ظل ظروف مختلفه عن طريق المجهر البؤري. وعلاوة علي ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة السريعة والقابلة للتكرار للغاية في الشاشات الجينية للعوامل الوراثية الجديدة التي تنطوي علي استقلاب قطره الدهن في البويضات والانسجه الأخرى.
Introduction
الدهون ضرورية لبقاء الخلية. بالاضافه إلى دورها التقليدي كمكونات لا تتجزا من أنظمه الغشاء الخلوي ، تلعب الدهون أيضا وظائف حاسمه في إمدادات الطاقة والإشارات المحولة طوال دوره حياه الإنسان الفردية1. وهكذا, استقلاب الدهون يجب ان تتوافق مع اللوائح الصارمة للحفاظ علي الأرقاء الفسيولوجية في الخلايا. ومن المعروف ان تقلبات نتائج استقلاب الدهون في مختلف الامراض ، مثل مرض السكري والكبد الدهني. علي الرغم من الاهميه الكبيرة لاستقلاب الدهون في صحة الحيوانية ، تبقي أليات الاساسيه لتنظيم استقلاب الدهون غير معروفه إلى حد كبير.
وقد استخدمت دروفيا علي نطاق واسع لسنوات منذ بدا البروفيسور توماس h. مورغان استخدامها في الدراسات التي تنطوي علي علم الوراثة وغيرها من المسائل البيولوجية الاساسيه2. في العقود القليلة الماضية ، أظهرت الادله الناشئة ان دروفيسيلا هو كائن نموذجي ممتاز في دراسة العديد من الامراض المرتبطة باستقلاب الدهون ، مثل السمنة1،3. وعلي وجه الخصوص ، تشارك دروفويلا الجينات الايضيه المحفوظة بشكل كبير مع البشر وتمتلك الانسجه/الأعضاء ذات الصلة المتشابهة وأنواع الخلايا لاستقلاب الدهون.
علي سبيل المثال ، فان الجسم الدهون من دروفيسيلا، والتي هي المسؤولة عن التخزين triacylglyceride ، وظائف مماثله للانسجه الدهنية البشرية. في الاونه الاخيره ، وقد تبين ان مجموعه من خلايا الكبد مثل المتخصصة (اي البويضات) ، والتي تم الإبلاغ عن ان تكون تناظريه وظيفية للكبد البشري ، ان تشارك في الأحماض الدهنية والأيض الهيدروكربون في الذباب الفاكهة4،5. وعلي غرار الحالة في كبد الثدييات ، تستجيب البويضات للجوع عن طريق تنشيط تشكيل القطيرات الدهنية في كل من اليرقات والبالغين ، مما يؤدي إلى تراكم الدهونفي الكريات4و6و7و8. وبشكل تشريحي ، يتم ربط البويضات باحكام بالسطح الداخلي القاعدي للبشرة الجانبية في مجموعات من ست خلايا تقريبا لكل هيميسيجمينت بطني ، مما يجعل من المتعذر عزل مجموعات البويضات من البشرة. التالي ، يجب ان تكون مرتبطة البويضات إلى البشرة اثناء تشريح وتلطيخ.
يتم تخزين الدهون في شكل قطرات الدهون ، والتي هي العضيات مع اغشيه طبقه واحده في الخلايا9. توجد قطرات الدهون في جميع أنواع الخلايا تقريبا عبر الأنواع المختلفة10. وتتغير ديناميات القطيرات الدهنية ، بما في ذلك حجمها وعددها ، استجابه للضغوط البيئية. ويعتبر هذا انعكاسا للوضع الأيضي في الاستجابة للإجهاد, مثل الشيخوخة والمجاعة7,8. ولذلك ، فانه من الاهميه بمكان تطوير طريقه ممكنة وموثوقه لتحديد نوعيا ديناميات قطره الدهون في البويضات اثناء التنمية وتحت ظروف عصيبة. علي وجه الخصوص ، في اليرقات instar الثالثة ، البويضات تحتوي علي عدد قليل أو لا توجد قطرات الدهون للكشف تحت ظروف التغذية ، لكنها تحتوي علي العديد من قطرات الدهون الكبيرة بعد الحرمان من التغذية4. للتحقق من فعاليه هذه الطريقة ، فمن المقترح لتنفيذ تلطيخ قطره الدهون في البويضات تحت ظروف الجوع.
حاليا ، تتوفر العديد من الاصباغ الدهنية لتلطيخ قطرات الدهون ، مثل الاصباغ غير الفلورية السودان الأسود والنفط الأحمر O والاصباغ الفلورية النيل الأحمر و BODIPY 493/50311. السودان الأسود والنفط الأحمر O تستخدم عاده لاسترات الانسجه الكولسترول و triacylغليجليولس ويمكن الكشف عنها بسهوله عن طريق المجهر الضوئي. ومع ذلك ، فان الخلفية العالية نسبيا والدقة المنخفضة نسبيا هما العاملان المقيدين لتطبيقاتها في التحليل النوعي لديناميكيات القطيرات الدهنية. للتغلب علي القيود المفروضة علي الاصباغ غير الفلورية ، يتم استخدام النيل الأحمر و BODIPY 493/503 كبدائل مثاليه لتلطيخ الدهون قطره. وقد أفيد ان النيل الأحمر يمكن أيضا الكشف عن بعض الكوليسترول غير القابل للاستيفيد ، مما يجعل bodipy 493/503 صبغه أكثر تحديدا لقطرات الدهون الخلوية ، إلى حد ما12،13،14.
قبل كل شيء ، لتلبيه الحاجة إلى تحليل سريع وحساس لقطرات الدهون في البويضات ، وهذا البروتوكول يقدم وسيله ممكنة وقابله للتكرار للغاية من تلطيخ الدهون القائم علي التثبيت باستخدام BODIPY 493/503 كصبغه وصمه عار. في هذا التقرير ، يتم تشريح البويضات ، ويستخدم BODIPY 493/503 لتلطيخ قطره الدهون في البويضات ، والتي يتم الكشف عن قطرات الدهون عن طريق المجهر البؤري. سهوله والقدرة علي التحمل من هذا الاجراء يجعلها مثاليه للتعديل ومزيد من الاستخدام في التطبيقات الأخرى ، مثل تدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن بين الخطوات المذكورة أعلاه ، هناك عده خطوات حاسمه في هذا البروتوكول ، حيث ان فتره وضع البيضة هي واحده من هذه. كنسيج تعبئة الدهون ، والبويضة حساسة للغاية لحاله التغذية6،8. قد تؤدي الفترات الزمنيه المطولة لوضع البيض إلى يرقات اليد وزيادة المنافسة الغذائية …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671422 ، 31529004 ، 31601112) ، ومشروع 111 (D18010) ، ومشروع الفرق المحلية الابتكارية والبحثية لبرنامج مواهب نهر بيرل في قوانغدونغ (2017BT01S155) ، مؤسسه الصين لدكتوراه العلمية (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
