Summary
Præsenteret her er detaljerede metoder til dissektion og lipid dråbe farvning af oenocytter i Drosophila larver ved hjælp af bodipy 493/503, en lipid dråbe specifik fluorescerende farvestof.
Abstract
Lipider er afgørende for dyrenes udvikling og fysiologiske homøostase. Dysregulering af lipid metabolisme resulterer i forskellige udviklingsmæssige defekter og sygdomme, såsom fedme og fedt lever. Normalt er lipider lagret i lipid dråber, som er de multifunktionelle Lipid opbevaring organeller i celler. Lipid dråber varierer i størrelse og antal i forskellige væv og under forskellige forhold. Det er blevet rapporteret, at lipid dråber er stramt kontrolleret gennem regulering af dets Biogenese og nedbrydning. I Drosophila melanogaster, den oenocyte er en vigtig væv for lipid metabolisme og er for nylig blevet identificeret som en menneskelig lever analog vedrørende lipid mobilisering som reaktion på stress. Men de mekanismer, som er grundlaget for reguleringen af lipid dråbe metabolisme i oenocytter forbliver undvigende. For at løse dette problem, det er af yderste vigtighed at udvikle en pålidelig og følsom metode til direkte visualisere lipid dråbe dynamiske ændringer i oenocytter under udvikling og under stressende forhold. Drage fordel af den lipofile bodipy 493/503, en lipid dråbe-specifikke fluorescerende farvestof, beskrevet her er en detaljeret protokol for dissektion og efterfølgende lipid dråbe farvning i oenocytes af Drosophila larver som reaktion på sult. Dette giver mulighed for kvalitativ analyse af lipid dråbe dynamik under forskellige betingelser ved Konfokal mikroskopi. Desuden kan denne hurtige og meget reproducerbare metode også anvendes i genetiske skærme til at identificere nye genetiske faktorer, der involverer lipid dråbe metabolisme i oenocytter og andre væv.
Introduction
Lipider er afgørende for cellens overlevelse. Ud over deres traditionelle rolle som integrerede komponenter i cellulære membransystemer, også lipiderne spiller afgørende funktioner i energiforsyningen og signalering transduktion i hele livscyklussen for de enkelte dyr1. Således, lipid metabolisme skal overholde strenge regler for at opretholde fysiologiske hæmostase i celler. Det er kendt, at dysregulering af lipid metabolisme resulterer i forskellige sygdomme, såsom diabetes og fedt lever. På trods af den store betydning af lipid metabolisme i dyresundhed, de mekanismer underliggende lipid metabolisme regulering forbliver stort set ukendt.
Drosophila har været flittigt brugt i årevis siden professor Thomas H. Morgan begyndte at bruge dem i undersøgelser, der involverer genetik og andre grundlæggende biologiske spørgsmål2. I de sidste par årtier, nye beviser har vist, at Drosophila er en fremragende model organisme i studiet af mange lipid metabolisme-associerede sygdomme, såsom fedme1,3. Især, Drosophila deler stærkt bevaret metaboliske gener med mennesker og besidder lignende relevante væv/organer og celletyper for lipid metabolisme.
For eksempel, fedt kroppen af Drosophila, som er ansvarlig for triacylglycerid opbevaring, funktioner svarende til humant fedtvæv. For nylig, en klynge af specialiserede hepatocyte-lignende celler (dvs., oenocytter), som er blevet rapporteret til at være en funktionel analog til den menneskelige lever, har vist sig at være involveret i fedtsyre og kulbrinte metabolisme i frugt fluer4,5. Svarende til tilfældet i pattedyr lever, oenocytter reagere på sult ved at aktivere lipid dråbedannelse i både larve og voksne Drosophila, resulterer i lipid dråbe ophobning i oenocytter4,6,7,8. Anatomisk, oenocytter er tæt knyttet til basal indre overflade af laterale epidermis i klynger af ca seks celler pr abdominal hemisegment, hvilket gør det praktisk umuligt at isolere oenocyte klynger fra epidermis. Derfor skal oenocytter være fastgjort til epidermis under dissektion og farvning.
Lipider er lagret i form af lipid dråber, som er organeller med enkeltlags membraner i cellerne9. Lipid dråber findes i næsten alle celletyper på tværs af forskellige arter10. Lipid dråbe dynamik, herunder dens størrelse og antal, ændring som reaktion på miljømæssige stressorer. Dette betragtes som en afspejling af metaboliske status som reaktion på stress, såsom aldring og hungersnød7,8. Derfor er det af stor betydning at udvikle en gennemførlig og pålidelig metode til kvalitativt bestemme lipid dråbe dynamik i oenocytter under udvikling og under stressende forhold. Især i den tredje INSTAR larver indeholder oenocytter få eller ingen påviselige lipid dråber under fodret betingelser, men de indeholder talrige store lipid dråber efter ernæring afsavn4. For at verificere effektiviteten af denne metode, foreslås det at udføre lipid dråbe farvning i oenocytes under sultede betingelser.
I øjeblikket er flere lipofile farvestoffer tilgængelige for lipid dråber farvning, såsom nonfluorescerende farvestoffer Sudan sort og olie rød O og fluorescerende farvestoffer Nile Red og BODIPY 493/50311. Sudan sort og olie rød O er almindeligt anvendt til vævs kolesterylestere estere og triacylglyceroler og kan let påvises ved lys mikroskopi. Men relativt høj baggrunds farvning og relativt lav opløsning er to begrænsende faktorer for dets anvendelser i kvalitativ analyse af lipid dråbe dynamik. For at overvinde begrænsningerne af nonfluorescerende farvestoffer, er Nilen rød og BODIPY 493/503 udnyttes som ideelle erstatninger for lipid dråbe farvning. Det er blevet rapporteret, at Nile Red også kan detektere nogle unesterificeret kolesterol, hvilket gør bodipy 493/503 et mere specifikt farvestof til cellulære lipid dråber, til en vis grad12,13,14.
Frem for alt, at opfylde et behov for hurtig og følsom analyse af lipid dråber i oenocytter, denne protokol præsenterer en gennemførlig og meget reproducerbar metode til fiktivt-baserede lipid dråbe-specifikke farvning ved hjælp af BODIPY 493/503 som plet farvestof. I denne rapport, er oenocytter dissekeret, og BODIPY 493/503 bruges til lipid dråbe farvning i oenocytes, hvor lipid dråber opdages ved Konfokal mikroskopi. Den lethed og overkommelige i denne procedure gør den ideel til modifikation og yderligere brug i andre applikationer, såsom flow cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. æglægning
- Forbered standard majsmel mad til æglægning.
Bemærk: For opskrift og madlavning procedure for standard majsmel mad, der anvendes her, se de tidligere offentliggjorte detaljer15. - Forbered frisk gær pasta ved at tilføje 6 mL destilleret vand til 4 g aktiv tørret gær i en 50 mL centrifugal tube. Brug en spatel til at blande og lave en pasta.
- Lav æglægnings flasker ved at fylde majsmel-maden i flaskerne og sprede ca. 1 g gær pasta på overfladen af majs måltidet mad med en spatel.
- Fluerne af de ønskede genotyper placeres i en æglægnings flaske og placeres i en inkubator med en konstant temperatur på 25 °C og en fugtighed på 60%.
Bemærk: Ideelle krydsninger består normalt af 150 jomfru fluer og mindst 75 mænd. Holde fluer i mørke ved at placere en lystæt boks over æglægnings flasker vil øge reproduktion sats. - Før ægsamlingen, lad fluer lægge æg i 1 time for at tillade fjernelse af alle gamle æg, der forbliver lagret i de kvindelige ovikanalerne.
- Lad fluer lægge æg i en ny æglægnings flaske i 1 time og fjerne de voksne fra flasken.
Bemærk: Kontroller æglægnings tiden for at minimere det udviklingsmæssige område for at opnå larver inden for en nøje kontrolleret udviklingsfase. - Lad æggene udvikle sig til 84 h i den tredje INSTAR larver i inkubator ved 25 ° c med en 12 h/12 h lys/mørk cyklus.
2. sult behandling for larverne
Bemærk: Som nævnt ovenfor, i den tredje INSTAR larver, der er få eller ingen detekterbare lipid dråber i oenocytter under normale fodringsbetingelser, men talrige store lipid dråber kan induceres i oenocytes under stress betingelser, såsom sult. For yderligere at verificere denne metode, er det nødvendigt at forbehandle disse larver at fremkalde lipid dråbe Biogenese i oenocytter. Her blev et sulte tidsforløb på 12 timer, 24 timer og 36 timer valgt som paradigme. Især en kort periode med sult (f. eks 3 h) er tilstrækkelig til at fremkalde detekterbare lipid dråber i oenocytter. Sulte varigheden kan variere afhængigt af specifikke eksperimentelle mål og indstillinger.
- Lav kamre til hungersnød og kontrolbehandlinger.
- Til sulte behandling kamre: Anbring et filterpapir af passende størrelse i en 6 cm Petri skål, og afpipettér 1 mL PBS på filter papiret.
- Til kontrol behandling kamre: Placer 5 ml Bloomington standard majsmel mad i Petri skålen.
- Brug en spatel til forsigtigt at grave det øverste lag af fødevarer, der indeholder larver, som stadig er i fare, og overføre dem til en Petri skål fyldt med 5 mL PBS. Rør forsigtigt larverne i PBS for at fjerne eventuel fødevareforurening fra larverne og gøre den så ren som muligt.
- Brug en lille pensel til at indsamle 40 tredje INSTAR larver af samme omtrentlige størrelse. Sorter dem tilfældigt i en hungersnød eller kontrol kammer, med 20 larver hver.
- Placer kamrene i inkubator ved 25 °C med 60% fugtighed, og lad udviklingen være 12 timer, 24 timer og 36 h i behandling.
Bemærk: For larverne i sulte kammeret tilsættes 1 mL PBS hver 12 h for at undgå dehydrering af larverne.
3. dissektion af Oenocytter
- Brug en lille pensel til at plukke larver i den passende alder (12 timer, 24 timer eller 36 timer efter behandling), og overfør dem derefter til en ny Petri skål fyldt med 5 mL iskold PBS til vask.
Bemærk: Gentag trin 2,2, når du har at gøre med larver i et kontrol kammer, for at fjerne eventuel fødevareforurening. - Fyld en dissektions plade med iskold PBS og brug pincet til forsigtigt at overføre larverne til dissektions pladen. Sæt dissektions pladen under et stereomikroskop for følgende dissektions trin.
Bemærk: Den iskold temperatur vil hjælpe langsom bevægelser af larverne og lette dissektion. - Drej larver ventrale side op og Rygsiden ned og hold forsigtigt på plads ved hjælp af pincet. Fastgør larverne til dissektions pladen ved at placere en dissektions stift selv om svælget ved den forreste ende og en anden stift gennem spirernaklet ved den bageste ende.
Bemærk: Rygsiden er lettest identificeret ved tilstedeværelsen af dorsale kufferter af luftrøret. - Brug Vannas fjeder saks til at incise (længderetningen) gennem epidermis fra den forreste til den bageste ende.
- Fjern det indre væv i epidermis ved hjælp af pincet.
Bemærk: Der skal udvises forsigtighed ved fjernelse af trakeal grenene for at undgå beskadigelse af oenocytterne, som er lokaliseret i epidermis interne overflade. - Med tang, Hent dissektions stifter og Overfør epidermis til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas fyldt med PBS på is.
- Fortsæt med at dissekere andre larver efter den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.
4. lipid dråbe farvning
- Inkubér de dissekterede epidermis i fikserings bufferen i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) på en rotator.
Bemærk: Fikserings bufferen indeholder 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS. - Fjern fikserings bufferen efterfulgt af en hurtig vask. For at udføre en hurtig vask, tilsættes 1 mL PBS ved RT i røret efter fjernelse af PFA, forsigtigt resuspension væv, og kassere PBS.
Forsigtig: Fikserings bufferen indeholder PFA, som er skadelig for menneskers sundhed. Det er vigtigt, at fikserings bufferen bortskaffes som farligt affald. - Vask prøverne 3x for 5 min hver med PBS for at vaske alle mulige PFA rester.
- Inkubér epidermis med BODIPY 493/503 (1 μg/mL; Se tabel over materialer) i 30 min ved rt på en rotator.
Bemærk: Fra dette trin og fremefter, wrap mikrocentrifuge røret med et stykke aluminiumsfolie til at beskytte prøver fra lys og minimere den mulige foto-blegning. - Fjern BODIPY 493/503-Farvningsopløsningen og vask prøverne 3x i 10 minutter hver med PBS for helt at fjerne resterende farvestoffer.
5. montering og billeddannelse
- Placer 6 μL monterings medium på et rent mikroskop slide.
Bemærk: Monterings medium bruges til længere detektionstid baseret på dets antifade egenskaber. - Brug pincet til at afhente en epidermis og forsigtigt fjerne rest PBS med en serviet.
- Placer epidermis i monterings mediet, og Juster dens retning, så dens indvendige overflade, der indeholder oenocytterne, er på bunden, og dens udvendige overflade er på toppen.
- Anbring forsigtigt en dækseddel på epidermis.
Bemærk: Fjern eventuelt ekstra monterings medium, der lækker fra under dæksedlen, med en serviet, hvis det er nødvendigt. For at lette billeddannelse trykkes forsigtigt ned på dæksedlen med pincet, så når du observerer diaset gennem mikroskopet, kan økokyt klyngen let afbildes i et enkelt plan. Alternativt er det praktisk muligt at skære epidermis i to semi-epidermis gennem den midterste linje for at undgå oprulning af hele epidermis, når du monterer vævene. - Påfør klar neglelak rundt om kanterne af dæksedlen for at forsegle.
- Sæt diasene i en lyssikker prøve boks og lad neglelak tørre ved RT, hvilket kan tage 5-10 min.
- Fortsæt med mikroskopisk analyse. Tag billeder ved hjælp af et Konfokal mikroskop (forstørrelse på 63x med optimerede GFP-eller FITC-filterindstillinger, excitation = 488 nm, emission = 503 nm) for at erhverve rene og følsomme signaler med minimeret baggrund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket udførelse af denne procedure bør resultere i klare lipid dråber farvning, der afslører antallet og størrelsen af lipid dråber i oenocytes. Figur 1a, A ', a ' ' viser, at der er få detekterbare lipid dråber (grønne prikker) i oenocytes af normale fodring larver under forskellige udviklingsmæssige stadier. Figur 1b, B ', b ' ' viser forhøjede lipiddråber (grønne prikker) i oenocytterne som respons på 12 h (b), 24 t (b ') og 36 h (b ' ') perioder med sult. Det skal bemærkes, at efter 96 h, fed larver (A) syntes at vise nogle lipid dråbe ophobning i oenocytes, som kan have været på grund af deres hurtige vækstrater. Forskerne bør være mere opmærksomme, når de beskæftiger sig med larverne i denne fase.
Figur 1: repræsentative billeder af lipid dråbe farvning. Billeder vises over tidsforløbet af udvikling og sult i oenocytes af Drosophila larver ved hjælp af bodipy 493/503. (a, a ', a ' ') Lipid dråbe farvning (grønne prikker) af repræsentative billeder af oenocytter klynge i fed larver. (b, b ', b ' ') Lipid dråbe farvning (grønne prikker) i repræsentative billeder af oenocytter klynger efter 12 h (B), 24 h (B '), og 36 h (B ' ') perioder med sult, startende fra larver med en alder af 84 h. Alle billeder blev taget i samme forstørrelse. Skala bjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blandt de ovenfor beskrevne, er der flere kritiske trin i denne protokol, med æglægnings tiden periode er en af disse. Som et lipid-mobiliserende væv, er oenocyte meget følsom over for ernæringstilstand6,8. Forlængede æglægnings tider kan resultere i kronede larver og øget fødevare konkurrence, hvilket fører til unøjagtige resultater. Den 1 h æglægningsperiode, der anvendes i denne protokol, gør det muligt for larverne at udvikle sig uden ernærings konkurrence. Et meget større antal larver, der kan skyldes længere æglægnings tider kan også påvirke lipid dråbe mængder og mønstre (f. eks størrelse, antal, og morfologi) i oenocytter.
Desuden, forlængede æglægnings tider perioder også resulterer i en larve population med en bred variation af udviklingsmæssige stadier. I denne sammenhæng bør forskerne være forsigtige, når du bruger mutanter, der påvirker embryonale eller larve udvikling, da deres indflydelse på lipid dråbe mønstre kan være påvirket af sekundære virkninger af udviklingsmæssige defekter. Den tid kursus procedure tyder på, at lipid dråber er sjældent detekterbare i fed tilstand oenocytter under udvikling fra tidlig tredje INSTAR larver (84 h) til sent tredje INSTAR larver (120 h). Hertil kommer, i modsætning til den gule pigmentering af oenocytter hos voksne, larve oenocytter er farveløs5. Der bør derfor være øget opmærksomhed under oenocyte dissektion for at undgå potentiel skade på oenocytter, især når de omgivende væv fjernes (dvs. trakeal grene). Desuden er lipid dråber enkeltlags membran organeller, som er følsomme over for vaske-og rengøringsmidler som Triton X-1009. Det er derfor vigtigt at sikre, at buffere, der anvendes i denne protokol, ikke indeholder vaskemidler.
Som nævnt ovenfor, der er flere farvestoffer anvendes til at bestemme lipid dråbe beløb og mønster ændringer i Drosophila og andre arter. Blandt disse, BODIPY 493/503 kan være mest egnet til lipid dråbe-specifik farvning i forhold til andre fluorescerende (f. eks, Nile Red) eller nonfluorescerende farvestoffer (f. eks olie rød O); selv om, flere nye og avancerede farvestoffer er ved at blive udviklet. For eksempel er LipidSpot 488 og dets derivater en serie af nyudviklede fluorescerende farvestoffer med minimal baggrunds farvning af cellemembraner og andre organeller. De giver mulighed for hurtig farvning af lipid dråber i både levende og faste celler, uden vaske trin kræves16,17. En begrænsning af denne lipid dråbe farvning protokol er, at det ikke er optimalt for kvantitativt måling fedt reserver i celler, selv om det fungerer godt for kvalitativ vurdering af lipid Dråbestørrelse, antal, og morfologi.
Ud over den lipid dråbe farvning i oenocytter, denne metode kan også anvendes til andre væv i larver (dvs., muskel, fedt legeme, og tarm væv) med mindre ændringer under væv dissektion og skæring7. Desuden, denne metode fungerer også godt for lipid dråbe farvning af voksne væv7. En modificeret version af denne metode kan udvides til bredere anvendelsesformål i kombination med immun Histokemisk farvning med antistoffer. I dette tilfælde bør fast væv gennem syes med saponin (0,1% for 30 min ved RT) i stedet for traditionelle vaskemidler, før inkuberet med antistoffer, som letter passage af antistoffer på tværs af plasma membraner og vedligeholdelse af lipid dråbe membran integritet8.
Sammenfattende giver denne protokol en gennemførlig metode for forskerne til at undersøge, om visse genetiske eller miljømæssige manipulationer forårsager kvalitative ændringer i lipid dråbe mængder og mønstre (dvs. størrelse, antal og morfologi) uden behov for vanskelige operationer og dyrt udstyr og materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (31671422, 31529004 og 31601112), 111-projektet (D18010), det lokale innovative og forsker teams projekt af Guangdong Perl River Talents program (2017BT01S155), og China postdoc Science Foundation (2018M640767).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell? Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
