Summary
Presentati qui sono i metodi dettagliati per la dissezione e la colorazione delle goccioline lipidiche degli ovociti nelle larve di Drosophila utilizzando BODIPY 493/503, un colorante fluorescente specifico per gocciolaiole lipidiche.
Abstract
I lipidi sono essenziali per lo sviluppo animale e l'omeostasi fisiologica. Disregolazione del metabolismo dei lipidi si traduce in vari difetti dello sviluppo e malattie, come l'obesità e fegato grasso. Di solito, i lipidi sono memorizzati in goccioline lipidiche, che sono gli organelli di conservazione lipidica multifunzionale nelle cellule. Le goccioline di lipidi variano per dimensioni e numero in tessuti diversi e in condizioni diverse. È stato riferito che le goccioline di lipidi sono strettamente controllate attraverso la regolazione della sua biogenesi e degradazione. In Drosophila melanogaster, l'enocito è un tessuto importante per il metabolismo dei lipidi ed è stato recentemente identificato come un analogo del fegato umano per quanto riguarda la mobilitazione dei lipidi in risposta allo stress. Tuttavia, i meccanismi alla base della regolazione del metabolismo delle goccioline lipidi che si sono mantilati rimangono sfuggente. Per risolvere questo problema, è della massima importanza sviluppare un metodo affidabile e sensibile per visualizzare direttamente i cambiamenti dinamici delle goccioline di lipidi negli enociti durante lo sviluppo e in condizioni stressanti. Approfittando del LIPophilic BODIPY 493/503, un colorante fluorescente specifico per le gocciolaiate di lipidi, descritto qui, è un protocollo dettagliato per la dissezione e la successiva macchiatura di idropidi nei lipidi delle larve di Drosophila in risposta alla fame. Ciò consente un'analisi qualitativa della dinamica delle gocciolamenti lipidiche in varie condizioni mediante microscopia confocale. Inoltre, questo metodo rapido e altamente riproducibile può essere utilizzato anche negli schermi genetici per identificare nuovi fattori genetici che coinvolgono il metabolismo delle goccioline lipidi che coinvolgono il metabolismo delle goccioline lipidi che coinvolgono gli enociti e altri tessuti.
Introduction
I lipidi sono essenziali per la sopravvivenza delle cellule. Oltre al loro ruolo tradizionale come componenti integrali dei sistemi di membrana cellulare, i lipidi svolgono anche funzioni cruciali nell'approvvigionamento energetico e nella trasduzione della segnalazione durante i cicli di vita dei singoli animali1. Pertanto, il metabolismo dei lipidi deve conformarsi a rigide normative per mantenere l'emostasi fisiologica nelle cellule. È noto che la disregolazione del metabolismo dei lipidi si traduce in varie malattie, come il diabete e fegato grasso. Nonostante la grande importanza del metabolismo dei lipidi nella salute degli animali, i meccanismi alla base della regolazione del metabolismo dei lipidi rimangono in gran parte sconosciuti.
La Drosophila è stata ampiamente utilizzata per anni da quando il professor Thomas H. Morgan ha iniziato a usarli in studi che coinvolgono la genetica e altre domande biologiche di base2. Negli ultimi decenni, prove emergenti hanno dimostrato che la Drosophila è un organismo modello eccellente nello studio di molte malattie legate al metabolismo dei lipidi, come l'obesità1,3. In particolare, la Drosophila condivide geni metabolici altamente conservati con gli esseri umani e possiede tessuti/organi e tipi di cellule rilevanti simili per il metabolismo dei lipidi.
Ad esempio, il corpo grasso della Drosophila, che è responsabile dell'immagazzinamento del triacylgliceride, funzioni analoghe al tessuto adiposo umano. Recentemente, un gruppo di cellule specializzate epatociti -come (cioè, ovociti), che sono stati segnalati per essere un analogo funzionale al fegato umano, hanno dimostrato di essere coinvolti nel metabolismo dell'acido grasso e degli idrocarburi nei moscerini della frutta4,5. Simile al caso nei fegati di mammiferi, gli enociti rispondono alla fame attivando la formazione di gocciolini ilipidi nella Drosophilalarvale e adulta , con conseguente accumulo di goccioline lipidiche in enociti4,6,7,8. Anatomicamente, gli oenociti sono strettamente attaccati alla superficie interna basale dell'epidermide laterale in grappoli di circa sei cellule per emisegmento addominale, il che rende impraticabile isolare gli ammassi di enociti dall'epidermide. Pertanto, gli ovociti devono essere attaccati all'epidermide durante la dissezione e la colorazione.
I lipidi sono memorizzati sotto forma di goccioline di lipidi, che sono organelli con membrane a strato singolo nelle cellule9. Goccioline di lipidi esistono in quasi tutti i tipi di cellule in diverse specie10. Le dinamiche delle goccioline lipidiche, comprese le dimensioni e il numero, cambiano in risposta a fattori di stress ambientali. Questo è considerato come un riflesso dello stato metabolico in risposta allo stress, come l'invecchiamento e la fame7,8. Pertanto, è di grande importanza sviluppare un metodo fattibile e affidabile per determinare qualitativamente le dinamiche delle goccioline lipidiche nelle dinamiche degli enociti durante lo sviluppo e in condizioni stressanti. In particolare, nelle larve a stella, gli enociti contengono poche o nessuna goccioline di lipidi rilevabili in condizioni di alimentazione, ma contengono numerose grandi goccioline di lipidi dopo la privazione nutrizionale4. Per verificare l'efficacia di questo metodo, si consiglia di eseguire la colorazione delle goccioline lipidiche negli enociti in condizioni di fame.
Attualmente, sono disponibili diversi coloranti lipofilici per la colorazione delle goccioline lipidiche, come i coloranti non fluorescenti Sudan Black and O.O. Sudan Nero e olio Rosso O sono comunemente utilizzati per esteri di colesterile dei tessuti e triacylglycerol e possono essere facilmente rilevati dalla microscopia leggera. Tuttavia, la colorazione di fondo relativamente elevata e la risoluzione relativamente bassa sono due fattori limitanti per le sue applicazioni nell'analisi qualitativa delle dinamiche delle goccioline lipidiche. Per superare i limiti dei coloranti non fluorescenti, Nile Red e BODIPY 493/503 sono utilizzati come sostituti ideali per la colorazione delle goccioline lipidiche. È stato riferito che Il Nilo Red può anche rilevare un po 'di colesterolo non esterificato, il che rende BODIPY 493/503 un tintio più specifico per le goccioline di lipidi cellulari, in una certa misura12,13,14.
Soprattutto, per soddisfare la necessità di un'analisi rapida e sensibile delle goccioline lipidiche negli enociti, questo protocollo presenta un metodo fattibile e altamente riproducibile di colorazione lipidica-specifica basato su fissativo utilizzando BODIPY 493/503 come colorante macchia. In questo rapporto, gli enociti vengono sezionati e BODIPY 493/503 viene utilizzato per la colorazione delle goccioline di lipidi negli enociti, in cui le goccioline di lipidi vengono rilevate dalla microfocalscopia. La facilità e la convenienza di questa procedura lo rendono ideale per la modifica e l'ulteriore utilizzo in altre applicazioni, come la citometria di flusso.
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Protocol
1. Deposizione delle uova
- Preparare il cibo standard per la deposizione delle uova.
NOT: Per la ricetta e la procedura di cottura per il cibo standard di farina di mais utilizzato qui, vedere i dettagli pubblicati in precedenza15. - Preparare la pasta di lievito fresco aggiungendo 6 mL di acqua distillata a 4 g di lievito essiccato attivo in un tubo centrifugo da 50 mL. Utilizzare una spatola per mescolare e fare una pasta.
- Fare bottiglie di deposizione delle uova riempiendo il cibo di farina di mais nelle bottiglie e diffondere circa 1 g di pasta di lievito sulla superficie del cibo di farina di mais con una spatola.
- Mettere le mosche dei genotipi desiderati in una bottiglia di deposizione delle uova e metterla in un'incubatrice con una temperatura costante di 25 gradi centigradi e un'umidità del 60%.
NOT: Le croci ideali di solito consistono di 150 mosche vergini e almeno 75 maschi. Mantenere le mosche al buio posizionando una scatola a prova di luce sopra le bottiglie di deposizione delle uova aumenterà il tasso di riproduzione. - Prima della raccolta delle uova, lasciate che le mosche depongano le uova per 1 h per consentire la rimozione di tutte le vecchie uova che rimangono conservate negli ovidotti femminili.
- Lasciate che le mosche depongano le uova in una nuova bottiglia per la deposizione delle uova per 1 h e rimuovono gli adulti dalla bottiglia.
NOT: Controllare il tempo di deposizione delle uova per ridurre al minimo la gamma dello sviluppo al fine di ottenere larve all'interno di uno stadio di sviluppo controllato con precisione. - Lasciare che le uova si sviluppino per 84 h nella terza larva instella nell'incubatrice a 25 gradi centigradi con un ciclo di 12 h/12 h di luce/buio.
2. Trattamento della fame per le larve
NOT: Come accennato in precedenza, nelle larve a stella, ci sono poche o nessuna goccioline lipidiche rilevabili negli enociti in condizioni di alimentazione normale, ma numerose grandi goccioline lipidiche possono essere indotte negli enociti in condizioni di stress, come la fame. Per verificare ulteriormente questo metodo, è necessario pretrattare queste larve per indurre la biogenesi delle goccioline lipidiche negli enociti. Qui, un corso di tempo di fame di 12 h, 24 h, e 36 h è stato scelto come paradigma. In particolare, un breve periodo di fame (ad esempio, 3 h) è sufficiente per indurre goccioline di lipidi rilevabili negli enociti. La durata della fame può variare in base a specifici obiettivi e impostazioni sperimentali.
- Fare camere per la fame e trattamenti di controllo.
- Per le camere di trattamento della fame: mettere una carta da filtro di dimensioni appropriate in un piatto Petri di 6 cm e pipetta 1 mL di PBS sulla carta da filtro.
- Per le camere di trattamento di controllo: posizionare 5 mL di bloomington cibo standard di farina di mais nel piatto Petri.
- Utilizzare una spatola per scavare delicatamente lo strato superiore di cibo contenente larve che sono ancora scavando nel cibo e trasferirli in un piatto Petri riempito con 5 mL di PBS. Mescolare delicatamente le larve in PBS per rimuovere qualsiasi contaminazione alimentare dalle larve e renderla il più pulita possibile.
- Utilizzare un piccolo pennello per raccogliere 40 3 larve instelle della stessa dimensione approssimativa. Ordinali in modo casuale in una camera di fame o di controllo, con 20 larve ciascuna.
- Posizionare le camere nell'incubatrice a 25 gradi centigradi con il 60% di umidità e consentire lo sviluppo di 12 h, 24 h e 36 h di trattamento.
NOT: Per le larve nella camera di fame, aggiungere 1 mL di PBS ogni 12 h per evitare la disidratazione delle larve.
3. Dissezione degli Enociti
- Utilizzare un piccolo pennello per raccogliere le larve dell'età appropriata (12 h, 24 h o 36 h dopo il trattamento), quindi trasferirle in un nuovo piatto Petri riempito con 5 mL di PBS ghiacciato da lavare.
NOT: Ripetere il passaggio 2.2 quando si tratta di larve in una camera di controllo per rimuovere qualsiasi contaminazione alimentare. - Riempire una piastra di dissezione con PBS ghiacciato e utilizzare le pinze per trasferire delicatamente le larve nella piastra di dissezione. Mettere la piastra di dissezione sotto un microscopio stereo per la seguente fase di dissezione.
NOT: La temperatura gelata aiuterà a rallentare i movimenti delle larve e facilitare la dissezione. - Ruotare il lato ventrale delle larve verso l'alto e il lato dorsale verso il basso e tenere delicatamente in posizione con pinze. Fissare le larve alla piastra di dissezione posizionando un perno di dissezione attraverso la pharynx all'estremità anteriore e un altro perno attraverso lo spiracolo all'estremità posteriore.
NOT: Il lato dorsale è più facilmente identificabile dalla presenza dei tronchi dorsali della trachea. - Utilizzare le forbici a molla Vannas per incise (longitudinalmente) attraverso l'epidermide dall'estremità anteriore a quella posteriore.
- Rimuovere il tessuto interno dell'epidermide usando le pinze.
NOT: Occorre prestare attenzione quando si rimuovono i rami tracheali per evitare danni agli enociti, che sono localizzati nella superficie interna dell'epidermide. - Con le pinze, recuperare i perni di dissezione e trasferire l'epidermide in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml riempito con PBS sul ghiaccio.
- Continuare a sezionare altre larve seguendo la procedura descritta sopra.
4. Colorazione delle goccioglie a ibiadi
- Incubare l'epidermide sezionata nel buffer di fissaggioper 30 min a temperatura ambiente (RT) su un rotatore.
NOT: Il buffer di fissazione contiene il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS. - Rimuovere il buffer di fissaggio, seguito da un lavaggio rapido. Per eseguire un lavaggio rapido, aggiungere 1 mL di PBS a RT nel tubo dopo la rimozione del PFA, risospendere delicatamente i tessuti e scartare il PBS.
ATTENZIONE: Il buffer di fissazione contiene PFA, che è dannoso per la salute umana. È importante smaltire correttamente il buffer di fissaggio come rifiuti pericolosi. - Lavare i campioni 3x per 5 min ciascuno con PBS per lavare tutti i possibili residui di PFA.
- Incubare l'epidermide con BODIPY 493/503 (1 g/mL; vedi Tabella dei materiali) per 30 min a RT su un rotatore.
NOT: Da questo passo in poi, avvolgere il tubo di microcentrifuga con un pezzo di foglio di alluminio per proteggere i campioni dalla luce e ridurre al minimo il possibile fotosbiancamento. - Rimuovere la soluzione di colorazione BODIPY 493/503 e lavare i campioni 3x per 10 min ciascuno con PBS per rimuovere completamente i coloranti residui.
5. Montaggio e imaging
- Posizionare 6 - L del supporto di montaggio su un vetrino pulito al microscopio.
NOT: Il supporto di montaggio viene utilizzato per un tempo di rilevamento più lungo in base alle relative proprietà antidissolve. - Utilizzare le pinze per prelevare un'epidermide e rimuovere delicatamente il PBS residuo con una salvietta.
- Posizionare l'epidermide nel supporto di montaggio e regolarne l'orientamento in modo che la sua superficie interna contenente gli enociti si trova sul fondo e la sua superficie esterna è in alto.
- Posizionare delicatamente una coverslip sull'epidermide.
NOT: Rimuovere qualsiasi mezzo di montaggio aggiuntivo che fuoriesca da sotto la vescine con una salvietta, se necessario. Per facilitare l'imaging, spingere delicatamente verso il basso sulla coverslip con pinze in modo che quando si osserva la diapositiva attraverso il microscopio, il cluster di enociti può essere facilmente immagine in un unico piano. In alternativa, è possibile tagliare l'epidermide in due semi-epidermide attraverso la linea mediana per evitare il rollup dell'intera epidermide durante il montaggio dei tessuti. - Applicare lo smalto trasparente intorno ai bordi del coverslip per sigillare.
- Mettere i vetrini in una scatola campione a prova di luce e lasciare asciugare lo smalto a RT, che può richiedere 5-10 min.
- Procedere con l'analisi microscopica. Scatta le immagini utilizzando un microscopio confocale (ingrandimento di 63x con impostazioni ottimizzate del filtro GFP o FITC, eccitazione - 488 nm, emissione 503 nm) per acquisire segnali puliti e sensibili con sfondo ridotto al minimo.
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Representative Results
La riuscita esecuzione di questa procedura dovrebbe risultare in una chiara colorazione delle goccioline di lipidi che rivela il numero e le dimensioni delle goccioline di lipidi negli enociti. La figura 1A,A',A'' mostra che ci sono poche goccioline lipidiche rilevabili (punti verdi) negli enociti delle normali larve di alimentazione durante le diverse fasi dello sviluppo. La figura 1B,B',B'' mostra un aumento dell'importo delle goccioline di lipidi (punti verdi) negli enociti in risposta a 12 h (B), 24 h (B), e 36 h (B') periodi di fame. Va notato che dopo 96 h, le larve nutrite (A) sembravano mostrare un certo accumulo di goccioline lipidi negli enociti, che potrebbero essere state dovute ai loro tassi di crescita rapidi. I ricercatori dovrebbero prestare maggiore attenzione quando si tratta con le larve durante questa fase.
Figura 1: Immagini rappresentative della colorazione delle goccioline di lipidi. Le immagini sono mostrate nel corso del tempo di sviluppo e fame negli enociti delle larve di Drosophila utilizzando BODIPY 493/503. (A, A', A'') Colorazione delle goccioline lipidi (punti verdi) di immagini rappresentative di enociti raggruppati in larve nutrite. (B,B', B'') Colorazione delle goccioline di lipidi (punti verdi) in immagini rappresentative di grappoli di enociti dopo 12 h (B), 24 h (B'), e 36 h (B') periodi di fame, a partire da larve con un'età di 84 h. Tutte le immagini sono state scattate nello stesso ingrandimento. Barra di scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Tra quelli sopra descritti, ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo, con il periodo di deposizione delle uova essendo uno di questi. Come tessuto lipidico-mobilizzante, l'enocito è altamente sensibile allo stato nutrizionale6,8. Periodi di tempo prolungati per la deposizione delle uova possono provocare larve cantata e una maggiore concorrenza alimentare, portando a risultati imprecisi. Il periodo di deposizione delle uova di 1 h utilizzato in questo protocollo consente alle larve di svilupparsi senza concorrenza nutrizionale. Un numero molto maggiore di larve che possono derivare da periodi di tempo di deposizione delle uova più lunghi può anche influenzare le quantità di goccioline lipidi e modelli (ad esempio, dimensioni, numero e morfologia) negli enociti.
Inoltre, periodi di tempo prolungati di deposizione delle uova si traduce anche in una popolazione larvale con un'ampia variazione di stadi di sviluppo. In questo contesto, i ricercatori dovrebbero fare attenzione quando utilizzano mutanti che influenzano lo sviluppo embrionale o larvale, poiché la loro influenza sui modelli di gocciolina lipidica può essere influenzata dagli effetti secondari dei difetti dello sviluppo. La procedura del corso temporale suggerisce che le goccioline di lipidi sono raramente rilevabili nella condizione nutrita di enociti durante lo sviluppo dalle prime larve della terza stella (84 h) alle larve della terza stella (120 h). Inoltre, a differenza della pigmentazione dell'ambra degli onociti negli adulti, gli onociti larvali sono incolore5. Pertanto, è necessario prestare maggiore attenzione durante la dissezione degli enociti per evitare potenziali danni agli enociti, specialmente quando si rimuovono i tessuti circostanti (ad esempio, i rami tracheali). Inoltre, le goccioline lipidiche sono organelli a membrana singola, che sono sensibili a detergenti come Triton X-1009. Pertanto, è importante assicurarsi che i buffer utilizzati in questo protocollo non contengano detergenti.
Come accennato in precedenza, ci sono diversi coloranti utilizzati per determinare la quantità di goccioline lipidi e cambiamenti di modello nella Drosophila e in altre specie. Tra questi, BODIPY 493/503 può essere più adatto per la colorazione lipidica specifica per le gocciolamenti rispetto ad altri coloranti fluorescenti (ad esempio, Nile Red) o non fluorescenti (ad esempio, OX rosso olio); anche se, più coloranti nuovi e avanzati sono in fase di sviluppo. Ad esempio, LipidSpot 488 e i suoi derivati sono una serie di coloranti fluorescenti di nuova creazione con una colorazione di fondo minima di membrane cellulari e altri organelli. Consentono una rapida colorazione delle goccioline di lipidi nelle cellule vive e fisse, senza alcuna fase di lavaggio richiesta16,17. Una limitazione di questo protocollo di colorazione delle goccioline lipidi che non è ottimale per misurare quantitativamente le riserve di grasso nelle cellule, anche se funziona bene per la valutazione qualitativa delle dimensioni delle goccioline lipidiche, del numero e della morfologia.
Oltre alla colorazione delle goccioglie lipidiche negli enociti, questo metodo può essere applicato anche ad altri tessuti nelle larve (ad esempio, muscoli, corpo grasso e tessuto intestinale) con piccole modifiche durante la dissezione e la sezione del tessuto7. Inoltre, questo metodo funziona bene anche per la colorazione delle goccioline di lipidi dei tessuti adulti7. Una versione modificata di questo metodo può essere estesa ad applicazioni più ampie in combinazione con la colorazione immunohistochimica con anticorpi. In questo caso, i tessuti fissi devono essere permeati di saponina (0,1% per 30 min at RT) invece di detergenti tradizionali prima dell'incubazione con anticorpi, che facilita l'incrocio degli anticorpi attraverso le membrane plasmatiche e il mantenimento dell'integrità della membrana delle goccioline lipidiche
In sintesi, questo protocollo fornisce un metodo fattibile per i ricercatori per studiare se alcune manipolazioni genetiche o ambientali causano cambiamenti qualitativi nella quantità e nei modelli delle goccioline di lipidi (ad esempio, dimensioni, numero e morfologia) senza la necessità di operazioni difficili e costose attrezzature e materiali.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 e 31601112), dal Progetto 111 (D18010), dal Local Innovative and Research Teams Project del Guangdong Perl River Talents Program (2017BT01S15) e dal China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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