Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila
Summary
Presentati qui sono i metodi dettagliati per la dissezione e la colorazione delle goccioline lipidiche degli ovociti nelle larve di Drosophila utilizzando BODIPY 493/503, un colorante fluorescente specifico per gocciolaiole lipidiche.
Abstract
I lipidi sono essenziali per lo sviluppo animale e l’omeostasi fisiologica. Disregolazione del metabolismo dei lipidi si traduce in vari difetti dello sviluppo e malattie, come l’obesità e fegato grasso. Di solito, i lipidi sono memorizzati in goccioline lipidiche, che sono gli organelli di conservazione lipidica multifunzionale nelle cellule. Le goccioline di lipidi variano per dimensioni e numero in tessuti diversi e in condizioni diverse. È stato riferito che le goccioline di lipidi sono strettamente controllate attraverso la regolazione della sua biogenesi e degradazione. In Drosophila melanogaster, l’enocito è un tessuto importante per il metabolismo dei lipidi ed è stato recentemente identificato come un analogo del fegato umano per quanto riguarda la mobilitazione dei lipidi in risposta allo stress. Tuttavia, i meccanismi alla base della regolazione del metabolismo delle goccioline lipidi che si sono mantilati rimangono sfuggente. Per risolvere questo problema, è della massima importanza sviluppare un metodo affidabile e sensibile per visualizzare direttamente i cambiamenti dinamici delle goccioline di lipidi negli enociti durante lo sviluppo e in condizioni stressanti. Approfittando del LIPophilic BODIPY 493/503, un colorante fluorescente specifico per le gocciolaiate di lipidi, descritto qui, è un protocollo dettagliato per la dissezione e la successiva macchiatura di idropidi nei lipidi delle larve di Drosophila in risposta alla fame. Ciò consente un’analisi qualitativa della dinamica delle gocciolamenti lipidiche in varie condizioni mediante microscopia confocale. Inoltre, questo metodo rapido e altamente riproducibile può essere utilizzato anche negli schermi genetici per identificare nuovi fattori genetici che coinvolgono il metabolismo delle goccioline lipidi che coinvolgono il metabolismo delle goccioline lipidi che coinvolgono gli enociti e altri tessuti.
Introduction
I lipidi sono essenziali per la sopravvivenza delle cellule. Oltre al loro ruolo tradizionale come componenti integrali dei sistemi di membrana cellulare, i lipidi svolgono anche funzioni cruciali nell’approvvigionamento energetico e nella trasduzione della segnalazione durante i cicli di vita dei singoli animali1. Pertanto, il metabolismo dei lipidi deve conformarsi a rigide normative per mantenere l’emostasi fisiologica nelle cellule. È noto che la disregolazione del metabolismo dei lipidi si traduce in varie malattie, come il diabete e fegato grasso. Nonostante la grande importanza del metabolismo dei lipidi nella salute degli animali, i meccanismi alla base della regolazione del metabolismo dei lipidi rimangono in gran parte sconosciuti.
La Drosophila è stata ampiamente utilizzata per anni da quando il professor Thomas H. Morgan ha iniziato a usarli in studi che coinvolgono la genetica e altre domande biologiche di base2. Negli ultimi decenni, prove emergenti hanno dimostrato che la Drosophila è un organismo modello eccellente nello studio di molte malattie legate al metabolismo dei lipidi, come l’obesità1,3. In particolare, la Drosophila condivide geni metabolici altamente conservati con gli esseri umani e possiede tessuti/organi e tipi di cellule rilevanti simili per il metabolismo dei lipidi.
Ad esempio, il corpo grasso della Drosophila, che è responsabile dell’immagazzinamento del triacylgliceride, funzioni analoghe al tessuto adiposo umano. Recentemente, un gruppo di cellule specializzate epatociti -come (cioè, ovociti), che sono stati segnalati per essere un analogo funzionale al fegato umano, hanno dimostrato di essere coinvolti nel metabolismo dell’acido grasso e degli idrocarburi nei moscerini della frutta4,5. Simile al caso nei fegati di mammiferi, gli enociti rispondono alla fame attivando la formazione di gocciolini ilipidi nella Drosophilalarvale e adulta , con conseguente accumulo di goccioline lipidiche in enociti4,6,7,8. Anatomicamente, gli oenociti sono strettamente attaccati alla superficie interna basale dell’epidermide laterale in grappoli di circa sei cellule per emisegmento addominale, il che rende impraticabile isolare gli ammassi di enociti dall’epidermide. Pertanto, gli ovociti devono essere attaccati all’epidermide durante la dissezione e la colorazione.
I lipidi sono memorizzati sotto forma di goccioline di lipidi, che sono organelli con membrane a strato singolo nelle cellule9. Goccioline di lipidi esistono in quasi tutti i tipi di cellule in diverse specie10. Le dinamiche delle goccioline lipidiche, comprese le dimensioni e il numero, cambiano in risposta a fattori di stress ambientali. Questo è considerato come un riflesso dello stato metabolico in risposta allo stress, come l’invecchiamento e la fame7,8. Pertanto, è di grande importanza sviluppare un metodo fattibile e affidabile per determinare qualitativamente le dinamiche delle goccioline lipidiche nelle dinamiche degli enociti durante lo sviluppo e in condizioni stressanti. In particolare, nelle larve a stella, gli enociti contengono poche o nessuna goccioline di lipidi rilevabili in condizioni di alimentazione, ma contengono numerose grandi goccioline di lipidi dopo la privazione nutrizionale4. Per verificare l’efficacia di questo metodo, si consiglia di eseguire la colorazione delle goccioline lipidiche negli enociti in condizioni di fame.
Attualmente, sono disponibili diversi coloranti lipofilici per la colorazione delle goccioline lipidiche, come i coloranti non fluorescenti Sudan Black and O.O. Sudan Nero e olio Rosso O sono comunemente utilizzati per esteri di colesterile dei tessuti e triacylglycerol e possono essere facilmente rilevati dalla microscopia leggera. Tuttavia, la colorazione di fondo relativamente elevata e la risoluzione relativamente bassa sono due fattori limitanti per le sue applicazioni nell’analisi qualitativa delle dinamiche delle goccioline lipidiche. Per superare i limiti dei coloranti non fluorescenti, Nile Red e BODIPY 493/503 sono utilizzati come sostituti ideali per la colorazione delle goccioline lipidiche. È stato riferito che Il Nilo Red può anche rilevare un po ‘di colesterolo non esterificato, il che rende BODIPY 493/503 un tintio più specifico per le goccioline di lipidi cellulari, in una certa misura12,13,14.
Soprattutto, per soddisfare la necessità di un’analisi rapida e sensibile delle goccioline lipidiche negli enociti, questo protocollo presenta un metodo fattibile e altamente riproducibile di colorazione lipidica-specifica basato su fissativo utilizzando BODIPY 493/503 come colorante macchia. In questo rapporto, gli enociti vengono sezionati e BODIPY 493/503 viene utilizzato per la colorazione delle goccioline di lipidi negli enociti, in cui le goccioline di lipidi vengono rilevate dalla microfocalscopia. La facilità e la convenienza di questa procedura lo rendono ideale per la modifica e l’ulteriore utilizzo in altre applicazioni, come la citometria di flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tra quelli sopra descritti, ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo, con il periodo di deposizione delle uova essendo uno di questi. Come tessuto lipidico-mobilizzante, l’enocito è altamente sensibile allo stato nutrizionale6,8. Periodi di tempo prolungati per la deposizione delle uova possono provocare larve cantata e una maggiore concorrenza alimentare, portando a risultati imprecisi. Il periodo di deposizione delle uova di 1 h utilizzato in ques…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 e 31601112), dal Progetto 111 (D18010), dal Local Innovative and Research Teams Project del Guangdong Perl River Talents Program (2017BT01S15) e dal China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
