Summary
Presenteres her er detaljerte metoder for disseksjon og lipid dråpe farging av oenocytes i Drosophila larver ved hjelp av BODIPY 493/503, en lipid dråpe-spesifikke fluorescerende fargestoff.
Abstract
Lipider er avgjørende for utvikling av dyr og fysiologiske homeostase. Feilregulering av lipid metabolisme resulterer i ulike utviklingsmessige defekter og sykdommer, som fedme og fettlever. Vanligvis er lipider lagret i lipid dråper, som er multifunksjonelle lipid lagring organeller i celler. Lipid dråper varierer i størrelse og tall i ulike vev og under ulike forhold. Det har blitt rapportert at lipid dråper er strengt kontrollert gjennom regulering av dens kognitiv og degradering. I Drosophila melanogaster, oenocyte er en viktig vev for lipid metabolisme og har nylig blitt identifisert som en menneskelig lever analog om lipid mobilisering som svar på stress. Men mekanismene underliggende regulering av lipid dråpe metabolisme i oenocytes forblir unnvikende. For å løse dette problemet, er det av største viktighet å utvikle en pålitelig og følsom metode for direkte visualisere lipid dråpe dynamiske endringer i oenocytes under utvikling og under stressende forhold. Dra nytte av lipofile BODIPY 493/503, en lipid dråpe spesifikke fluorescerende fargestoff, beskrevet her er en detaljert protokoll for disseksjon og påfølgende lipid dråpe farging i oenocytes av Drosophila larver som svar på sult. Dette gjør det mulig for kvalitativ analyse av lipid dråpe dynamikk under ulike forhold ved konfokalmikroskopi mikroskopi. Videre kan denne raske og svært reproduserbar metode også brukes i genetiske skjermer for indentifying romanen genetiske faktorer som involverer lipid dråpe metabolisme i oenocytes og andre vev.
Introduction
Lipider er avgjørende for celle overlevelse. I tillegg til deres tradisjonelle rolle som integrerte komponenter av cellulære membran systemer, spiller lipider også viktige funksjoner i energiforsyningen og signaliserer Transduction gjennom hele livssyklusen til enkelte dyr1. Således, lipid metabolisme må samsvare med strenge forskrifter for å opprettholde fysiologiske hemostase i celler. Det er kjent at feilregulering av lipid metabolisme resulterer i ulike sykdommer, som diabetes og fettlever. Til tross for den store betydningen av lipid metabolisme i dyrehelse, mekanismene underliggende lipid metabolisme regulering forblir i stor grad ukjent.
Drosophila har vært mye brukt i mange år siden professor Thomas H. Morgan begynte å bruke dem i studier som involverer genetikk og andre grunnleggende biologiske spørsmål2. I de siste ti årene, nye bevis har vist at Drosophila er en utmerket modell organisme i studiet av mange lipid metabolisme-tilknyttede sykdommer, som fedme1,3. Spesielt Drosophila aksjer svært bevart metabolske gener med mennesker og besitter tilsvarende relevant vev/organer og celletyper for lipid metabolisme.
For eksempel, fettet kroppen av Drosophila, som er ansvarlig for triacylglyceride lagring, funksjoner analoge til menneskelig fettvev. Nylig, en klynge av spesialiserte hepatocytter celler (dvs. oenocytes), som har blitt rapportert å være en funksjonell analog til den menneskelige leveren, har vist seg å være involvert i fatty acid og hydrokarboner i olje metabolismen i frukt fluer4,5. Ligner på saken i pattedyr lever, oenocytes svare på sult ved å aktivere lipid dråpe dannelse i både larvestadiet og voksen Drosophila, noe som resulterer i lipid dråpe akkumulering i oenocytes4,6,7,8. Anatomisk, oenocytes er tett festet til basal indre overflate av lateral epidermis i klynger på omtrent seks celler per abdominal hemisegment, som gjør det upraktisk å isolere oenocyte klynger fra epidermis. Således må oenocytes festes til epidermis under disseksjon og farging.
Lipider lagres i form av lipid dråper, som er organeller med enkelt lags membraner i celle9. Lipid dråper finnes i nesten alle celletyper på tvers av ulike arter10. Lipid dråpe dynamikk, inkludert størrelse og antall, endring i respons til miljømessige stressfaktorer. Dette regnes som en refleksjon av metabolske status som svar på stress, slik som aldring og sult7,8. Derfor er det av stor betydning å utvikle en gjennomførbar og pålitelig metode for å kvalitativt bestemme lipid dråpe dynamikk i oenocytes under utvikling og under stressende forhold. Spesielt i den tredje skikkelsen larver, oenocytes inneholde få eller ingen synlige lipid dråper under matet forhold, men de inneholder mange store lipid dråper etter ernæring deprivasjon4. For å verifisere effektiviteten av denne metoden, er det foreslått å utføre lipid dråpe farging i oenocytes under sultet forhold.
Foreløpig er flere lipofile fargestoffer tilgjengelig for lipid dråper flekker, slik som nonfluorescent fargestoffer Sudan Black og Oil Red O og fluorescerende fargestoffer Nile Red og BODIPY 493/50311. Sudan Black og Oil Red O er ofte brukt for vev cholesteryl estere og triacylglyceroler og kan lett oppdages av lys mikroskopi. Men relativt høy bakgrunn flekker og relativt lav oppløsning er to Begrensende faktorer for sine applikasjoner i kvalitativ analyse av lipid dråpe dynamikk. For å overvinne begrensningene av nonfluorescent fargestoffer, Nile Red og BODIPY 493/503 benyttes som ideelle erstatninger for lipid dråpe farging. Det har blitt rapportert at Nilen rød kan også oppdage noen unesterified kolesterol, som gjør BODIPY 493/503 en mer spesifikk fargestoff for mobilnettet lipid dråper, til en viss grad12,13,14.
Fremfor alt, for å oppfylle et behov for rask og følsom analyse av lipid dråper i oenocytes, presenterer denne protokollen en gjennomførbar og svært reproduserbar metode for bindemiddel-baserte lipid dråpe-spesifikke flekker ved hjelp av BODIPY 493/503 som flekken fargestoff. I denne rapporten, oenocytes er dissekert, og BODIPY 493/503 brukes for lipid dråpe farging i oenocytes, der lipid dråper oppdages av konfokalmikroskopi mikroskopi. Den enkle og rimelig av denne prosedyren gjør det ideelt for modifisering og videre bruk i andre programmer, for eksempel Flow flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. egg legging
- Forbered standard cornmeal mat for egglegging.
Merk: For oppskriften og matlaging prosedyre for standard cornmeal mat som brukes her, se tidligere publiserte detaljer15. - Forbered fersk gjær lime ved å legge 6 mL destillert vann til 4 g aktiv tørket gjær i en 50 mL sentrifugal slangen. Bruk en slikkepott til å mikse og lage en lime.
- Lag egg-legging flasker ved å fylle cornmeal mat i flaskene og spre ca 1 g gjær lime på overflaten av cornmeal mat med en slikkepott.
- Plasser fluene av ønsket genotyper i en egg-legging flaske og legg den i en inkubator med en konstant temperatur på 25 ° c og fuktighet på 60%.
Merk: Ideal krysser vanligvis består av 150 jomfru fluer og minst 75 menn. Holde fluer i mørket ved å plassere en Lystett boks over egg-legging flasker vil øke gjengivelsen rate. - Før egg samling, la fluer legge egg for 1 t for å tillate fjerning av alle gamle egg som forblir lagret i den kvinnelige oviducts.
- La fluer legge egg i en ny egg-legging flaske for 1 time og fjerne de voksne fra flasken.
Merk: Kontroller egg-legging tid for å minimere utviklingsmessige området for å få larver innenfor et presist kontrollert utviklingstrinn. - La eggene å utvikle for 84 h inn i tredje skikkelsen larver i inkubator ved 25 ° c med en 12 h/12 h lys/mørk syklus.
2. sult behandling for Larvene
Merk: Som nevnt ovenfor, i tredje skikkelsen larver, er det få eller ingen synlige lipid dråper i oenocytes under normale fôring forhold, men mange store lipid dråper kan bli indusert i oenocytes under stress forhold, for eksempel sult. For ytterligere å verifisere denne metoden, er det nødvendig å forbehandle disse Larvene å indusere lipid dråpe kognitiv i oenocytes. Her, en sult tid løpet av 12 h, 24 h, og 36 h ble valgt som paradigmet. Spesielt er en kort periode med sult (f. eks 3 h) tilstrekkelig til å indusere synlig lipid dråper i oenocytes. Sult varigheten kan variere i henhold til spesifikke eksperimentelle mål og innstillinger.
- Gjør kamre for sult og kontroll behandlinger.
- For sult behandling kamre: plassere et filter papir av passende størrelse i en 6 cm Petri parabolen og pipette 1 mL PBS på filter papir.
- For kontroll behandling kamre: sted 5 mL av Bloomington standard cornmeal mat i Petri parabolen.
- Bruk en slikkepott til forsiktig grave opp det øverste laget av mat som inneholder larver som fortsatt gravende i maten og overføre dem til en Petri parabol fylt med 5 mL PBS. Rør Larvene forsiktig i PBS for å fjerne eventuell mat forurensning fra larvene og gjøre den så ren som mulig.
- Bruk en liten pensel for å samle 40 tredje skikkelsen larver av samme omtrentlige størrelse. Sorter dem tilfeldig inn i en sult eller kontroll kammer, med 20 larver hver.
- Plasser kamrene i inkubator ved 25 ° c med 60% luftfuktighet og la utvikling for 12 h, 24 h, og 36 h av behandlingen.
Merk: For Larvene i sult kammeret, tilsett 1 mL PBS hver 12 h for å unngå larver dehydrering.
3. Disseksjon av Oenocytes
- Bruk en liten pensel til å plukke larver av riktig alder (12 h, 24 h, eller 36 h etter behandling), og deretter overføre dem til en ny Petri parabolen fylt med 5 mL iskald PBS å vaske.
Merk: Gjenta trinn 2,2 når du arbeider med larver i et kontroll kammer for å fjerne eventuell mat forurensning. - Fyll en disseksjon plate med iskald PBS og bruk tang for å forsiktig overføre larver inn i disseksjon plate. Sett disseksjon platen under et stereo mikroskop for følgende disseksjon trinn.
Merk: Isen-kald temperatur vil hjelpe langsomme bevegelser av larvene og tilrettelegge disseksjon. - Snu Larvene ventrale side opp og rygg side ned og forsiktig holde på plass ved hjelp av tang. Fest Larvene til disseksjon platen ved å plassere en disseksjon pinne om svelget i fremre ende og en annen pinne gjennom Spirakler ved bakre ende.
Merk: Rygg partiet er lettest å identifisere ved tilstedeværelsen av rygg stammene i luftrøret. - Bruk Vännäs fjær saks til incise (lengderetningen) gjennom epidermis fra fremre til bakre ende.
- Fjern det innvendige vevet i epidermis ved hjelp av tang.
Merk: Forsiktighet må utvises når du fjerner tracheal grener for å unngå skade på oenocytes, som er lokalisert i den interne overflaten av epidermis. - Med tang, hente disseksjon pinner og overføre epidermis til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube fylt med PBS på isen.
- Fortsett å analysere andre larver følge prosedyren beskrevet ovenfor.
4. lipid dråpe farging
- Ruge den dissekert epidermis i fiksering bufferfor 30 min ved romtemperatur (RT) på en rotator.
Merk: Fikserings bufferen inneholder 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS. - Fjern fikserings bufferen, etterfulgt av en rask vask. For å utføre en rask vask, tilsett 1 mL PBS ved RT inn i røret etter fjerning av PFA, forsiktig resuspend vevet, og kast PBS.
Forsiktig: Fikserings bufferen inneholder PFA, som er skadelig for menneskers helse. Det er viktig at fikserings bufferen skal kastes som farlig avfall. - Vask prøvene 3x i 5 minutter hver med PBS å vaske ut alle mulige PFA rester.
- Ruge epidermis med BODIPY 493/503 (1 μg/mL; se tabell over materialer) i 30 min ved RT på en rotator.
Merk: Fra dette trinnet og framover, vikle mikrosentrifugen røret med et stykke aluminiumsfolie for å beskytte prøvene fra lys og minimere mulig Foto-bleking. - Fjern BODIPY 493/503 farge løsning og vask prøvene 3x i 10 min hver med PBS å fjerne rester av fargestoffer.
5. montering og bildebehandling
- Plasser 6 μL av monterings medium på et rent objektglass.
Merk: Festemiddel brukes til lengre deteksjons tid basert på dens Antifade egenskaper. - Bruk tang for å plukke opp en epidermis og forsiktig fjerne den resterende PBS med en tørke.
- Plasser epidermis i festemiddelet og Juster retningen slik at den innvendige overflaten som inneholder oenocytes er på bunnen og den utvendige overflaten er på toppen.
- Plasser en dekkglass forsiktig på epidermis.
Merk: Fjern eventuelt ekstra festemiddel som lekker fra under dekkglass med en serviett, om nødvendig. For å lette bildebehandling, trykk forsiktig ned på dekkglass med tang slik at når du observerer raset gjennom mikroskopet, kan oenocyte klyngen lett avbildet i ett enkelt fly. Alternativt er det praktisk mulig å kutte epidermis i to semi-epidermis gjennom den midterste linjen for å unngå å rulle opp av hele epidermis når du monterer vev. - Påfør klar neglelakk rundt kantene av dekkglass å forsegle.
- Sett lysbildene i en Lystett sample boksen og la neglelakk tørke på RT, som kan ta 5-10 min.
- Fortsett med mikroskopisk analyse. Ta bilder ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop (forstørrelse av 63x med optimaliserte GFP-eller FITC-filterinnstillinger, eksitasjon = 488 NM, kvote = 503 NM) for å anskaffe rene og følsomme signaler med minimert bakgrunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket gjennomføring av denne prosedyren skal resultere i klare lipid dråper flekker som avslører antall og størrelsen på lipid dråper i oenocytes. Figur 1a, A ', a ' ' viser at det er få synlige lipid dråper (grønne prikker) i oenocytes av normal fôring larver under ulike utviklingstrinn. Figur 1B, B ', b ' ' viser økt lipid dråper (grønne prikker) beløp i oenocytes som svar på 12 h (b), 24 h (b '), og 36 h (b ' ') perioder med sult. Det bør bemerkes at etter 96 h, den matet larver (A) syntes å vise noen lipid dråpe akkumulering i oenocytes, som kan ha vært på grunn av deres raske vekstrater. Forskere bør betale økt oppmerksomhet når du arbeider med Larvene i løpet av denne fasen.
Figur 1: representative bilder av lipid dråpe farging. Bildene er vist over tid løpet av utvikling og sult i oenocytes av Drosophila LARVER bruker BODIPY 493/503. (a, a ', a ' ') Lipid dråpe farging (grønne prikker) av representative bilder av oenocytes klynge i matet larver. (b, b ', b ' ') Lipid dråpe farging (grønne prikker) i representative bilder av oenocytes klynger etter 12 h (B), 24 h (B '), og 36 h (B ' ') perioder med sult, fra larver med en alder av 84 h. Alle bilder ble tatt i samme forstørrelse. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blant de som er skissert ovenfor, er det flere viktige trinn i denne protokollen, med egglegging tidsperiode som en av disse. Som en lipid-mobilisere vev, er oenocyte svært følsom for ernæring status6,8. Langvarig egg-legging tidsperioder kan føre til Gol larver og økt mat konkurranse, noe som fører til unøyaktige resultater. Den 1 h egg-legging tidsperiode som brukes i denne protokollen gjør Larvene å utvikle uten ernæring konkurranse. Et mye større antall larver som kan følge av lengre egg-legging tidsperioder kan også påvirke lipid dråpe mengder og mønstre (f. eks størrelse, tall og morfologi) i oenocytes.
I tillegg, forlenget egg-legging tidsperioder også resulterer i en larvestadiet befolkning med en bred variasjon av utviklingstrinn stadier. I denne sammenheng bør forskerne være forsiktig når du bruker mutanter som påvirker embryonale eller larvestadiet utvikling, siden deres innflytelse på lipid dråpe mønstre kan være påvirket av sekundære effekter av utviklingsmessige defekter. Tiden kurset prosedyren tyder på at lipid dråper er sjelden oppdages i Fed condition oenocytes under utvikling fra tidlig tredje skikkelsen larver (84 h) til slutten av tredje skikkelsen larver (120 h). I tillegg, i motsetning til den gule pigmentering av oenocytes hos voksne, larvestadiet oenocytes er fargeløs5. Dermed bør økt oppmerksomhet rettes under oenocyte disseksjon å unngå potensiell skade på oenocytes, spesielt når du fjerner det omgivende vev (dvs. tracheal grener). Videre lipid dråper er enkelt lags membran organeller, som er følsomme for vaskemidler som Triton X-1009. Derfor er det viktig å sørge for at buffere som brukes i denne protokollen, ikke inneholder vaskemidler.
Som nevnt ovenfor, er det flere fargestoffer som brukes til å bestemme lipid dråpe beløpet og mønster endringer i Drosophila og andre arter. Blant disse kan BODIPY 493/503 være mest egnet for lipid dråpe-spesifikke flekker sammenlignet med andre fluorescerende (for eksempel Nilen rød) eller nonfluorescent fargestoffer (f. eks olje rød O); Selv om, mer romanen og avanserte fargestoffer utvikles. For eksempel, LipidSpot 488 og dets derivater er en serie av nyutviklede fluorescerende fargestoffer med minimal bakgrunn farging av cellulære membraner og andre organeller. De tillater rask farging av lipid dråper i både levende og faste celler, uten vask trinn kreves16,17. En begrensning av denne lipid dråpe farge protokollen er at det ikke er optimalt for kvantitativt måle fett reserver i celler, selv om det fungerer godt for kvalitative vurdering av lipid dråpestørrelse, tall og morfologi.
I tillegg til lipid dråpe farging i oenocytes, kan denne metoden også brukes til andre vev i larver (dvs. muskler, fett kroppen, og gut vev) med mindre modifikasjoner under vev disseksjon og snitting7. Videre denne metoden fungerer også godt for lipid dråpe farging av voksen vev7. En modifisert versjon av denne metoden kan utvides til bredere applikasjoner i kombinasjon med immunhistokjemi farging med antistoffer. I dette tilfellet bør fast vev være gjennomsyret med saponin (0,1% for 30 min ved RT) i stedet for tradisjonelle vaskemidler før incubating med antistoffer, som forenkler kryssing av antistoffer over plasma membraner og vedlikehold av lipid dråpe membran integritet8.
Oppsummert denne protokollen gir en mulig metode for forskere å undersøke om visse genetiske eller miljømessige manipulasjoner forårsake kvalitative endringer i lipid dråpe mengder og mønstre (dvs. størrelse, antall og morfologi) uten behov for vanskelige operasjoner og kostbart utstyr og materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (31671422, 31529004, og 31601112), den 111 Project (D18010), den lokale innovative og forskningsteam prosjekt av Guangdong Perl elv talenter program (2017BT01S155), og Kina postdoktor Science Foundation (2018M640767).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell? Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
