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Cancer Research

सॉलिड ट्यूमर सेल लाइनों में साइड पॉपुलेशन का विश्लेषण

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/60658
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

Summary

ठोस ट्यूमर सेल लाइनों में साइड पॉपुलेशन कोशिकाओं के अनुपात को मापने के लिए एक सुविधाजनक, तेज और लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत की जाती है।

Abstract

कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) ट्यूमर ग्रोथ, मेटास्टेसिस और ऑड-ईवन का एक अहम कारण है। ट्यूमर अनुसंधान के लिए सीएससी का अलगाव और पहचान बहुत मायने रखती है। वर्तमान में, ट्यूमर ऊतकों और ट्यूमर सेल लाइनों से सीएससी की पहचान और शुद्धिकरण के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। पक्ष जनसंख्या (एसपी) कोशिकाओं का पृथक्करण और विश्लेषण आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दो तरीके हैं। विधियां सीएससी की फ्लोरोसेंट रंगों को तेजी से निष्कासित करने की क्षमता पर भरोसा करती हैं, जैसे कि होचस्ट 33342। डाई का efflux एटीपी-बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टरों के साथ जुड़ा हुआ है और एबीसी ट्रांसपोर्टर अवरोधकों द्वारा बाधित किया जा सकता है। Hoechst 33342 के साथ सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं को धुंधला करने और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनके एसपी कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। यह परख सुविधाजनक, तेज और लागत प्रभावी है। इस परख में उत्पन्न डेटा ट्यूमर कोशिकाओं के स्टेमनेस गुणों पर जीन या अन्य बाह्राश और इंट्रासेलुलर संकेतों के प्रभाव की बेहतर समझ में योगदान दे सकता है।

Introduction

कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) आत्म-नवीकरण क्षमता और कई भेदभाव क्षमता वाली कोशिकाओं के सबसेट हैं, जो ट्यूमर विकास, मेटास्टेसिस और पुनरावृत्ति1,2में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वर्तमान में, सीएससी को फेफड़े, मस्तिष्क, अग्न्याशय, प्रोस्टेट, स्तन और यकृतकैंसर3, 4,5,6,7,8,9सहित विभिन्न घातक ट्यूमर में मौजूद होने के लिएपहचानागया है। इन ट्यूमर में सीएससी की पहचान मुख्य रूप से सतह मार्कर प्रोटीन की उपस्थिति पर आधारित है, जैसे सीडी 44, सीडी24, सीडी 133, और एससीए-19,10की उच्च और/या कम अभिव्यक्ति, लेकिन एक अनूठा मार्कर जो सीएससी को गैर-सीएससी से अलग कर सकताहै,अब तक सूचित नहीं किया गया है । वर्तमान में, ट्यूमर ऊतक या ट्यूमर सेल लाइनों में सीएससी की पहचान और शुद्ध करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। इन तकनीकों को सीएससी के विशिष्ट गुणों के आधार पर डिजाइन किया गया है। उनमें से, परख और पक्ष जनसंख्या (सपा) कोशिकाओं की छंटाई आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों में से दो हैं ।

एसपी कोशिकाओं को मूल रूप से गूडेल एट अल11द्वारा खोजा गया था, जब वे माउस बोन मैरो कोशिकाओं में हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं की विशेषता थे। जब माउस बोन मैरो कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट डाई होचस्ट 33342 के साथ लेबल किया गया था, तो होचस्ट 33342 मंद-दाग कोशिकाओं का एक छोटा समूह प्रवाह साइटोमेट्री परख के दो आयामी डॉट प्लॉट में दिखाई दिया। Hoechst 33342 एक डीएनए-बाध्यकारी डाई है और इसमें कम से कम दो बाध्यकारी मोड हैं जो विभिन्न स्पेक्ट्रल विशेषताओं का कारण बनते हैं। जब एक ही समय में दो तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को देखते हैं, तो कईआबादी 12से प्रकट हो सकती है। उनकी परख में, Hoechst ३३३४२ ३५० एनएम पर उत्साहित था और फ्लोरेसेंस 450/20 एनएम बैंड-पास (बीपी) फिल्टर और ६७५ एनएम एज फिल्टर लांग-पास (EFLP)11का उपयोग करके मापा गया था । बोन मैरो कोशिकाओं की पूरी आबादी के साथ तुलना में, कोशिकाओं के इस समूह को हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से समृद्ध किया गया था जिसे एसपी सेल11कहा जाता है। एसपी सेल तेजी से Hoechst 33342 निष्कासित करने में सक्षम हैं। इस डाई का प्रभाव एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर्स13से संबंधित है, जिसे कुछ एजेंटों जैसे फ्यूमिर्मेमोर्गिन सी14,वेरामिल और रेसरपाइन15, 16से बाधित किया जा सकता है। उसके बाद, विभिन्न ऊतकों, अंगों, ट्यूमर ऊतकों और ट्यूमर सेल लाइनों17, 18,19में एसपी कोशिकाओं के विभिन्नअनुपातोंका पता चला। इन एसपी सेल में स्टेम सेल17,19की कई विशेषताएं हैं .

यह पांडुलिपि होचस्ट 33342 लेबलिंग और सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं के धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एसपी कोशिकाओं के विश्लेषण का वर्णन करती है। इसके अलावा, Hoechst 33342 एकाग्रता का अनुकूलन और इस दृष्टिकोण का उपयोग कर एक विशिष्ट ट्यूमर सेल लाइन के लिए उचित अवरोधक चयन दिखाया गया है। अंत में, ट्यूमर कोशिकाओं में एसपी के अनुपात पर स्टेमनेस प्रचार या अवरोध संकेतों के प्रभाव का प्रदर्शन किया जाता है। प्रायोगिक उदाहरण प्रदर्शित करते हैं कि एसपी के विश्लेषण का उपयोग ट्यूमर स्टेमनेस पर जीन अभिव्यक्ति, छोटे अवरोधक, एक्टिवेटर, साइटोकिन्स और केमोकिन जैसे विभिन्न संकेतों के प्रभावों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। सीएससी के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, जैसे CD44+/CD24 की छंटाई- जनसंख्या, एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (एएलडीएच) विश्लेषण, और ट्यूमर क्षेत्र गठन परख, यह विधि हेरफेर के लिए आसान है और लागत प्रभावी है।

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Protocol

1. सेल की तैयारी

  1. सेल पाचन और बेअसर
    1. बीज ट्यूमर कोशिकाओं (जैसे एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं) एक 6 अच्छी तरह से थाली में, और उन्हें एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति 5% सीओ2के साथ आपूर्ति की।
    2. फसल कोशिकाओं जब उनके घनत्व के बारे में 90% तक पहुंचता है। संस्कृति माध्यम को अच्छी तरह से एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 2x को फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 3 एमएल के साथ धोएं।
      नोट: ट्यूमर कोशिकाओं की स्टेमनेस सुविधाओं पर सिग्नलिंग पाथवे अवरोधक (जैसे, FRA1 अवरोधक), या एक्टिवेटर (जैसे, स्टेट3 एक्टिवेटर) के प्रभावों की जांच करने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से प्लेट में वरीयता प्राप्त किया जाता है और फसल से पहले एक निश्चित समय के लिए अवरोधकों या सक्रियकर्ताओं के साथ पूर्वउपचारित किया जाता है।
    3. 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में 0.25% ट्राइपसिन-ईडीटीए के 500 माइक्रोन जोड़ें, प्लेट को 1-3 मिनट (न्यूनतम) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें, और धीरे-धीरे कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट को टैप करें।
      नोट: लंबे समय तक पाचन सेल व्यवहार्यता में परिवर्तन के कारण सपा प्रोफाइल को प्रभावित करेगा।
    4. पाचन समाप्त करने के लिए 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक पीबीएस के 3 एमएल जोड़ें और सेल झुरमुटों को तितर-बितर करने के लिए कोशिकाओं को 3-5x ऊपर और नीचे धीरे से पिपेट करें।
    5. एक नई 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में सेल निलंबन के 0.5 एमएल जोड़ें और एक माइक्रोस्कोप के तहत इसकी जांच करें। यदि सेल झुरमुट देखे जाते हैं, तो 70 माइक्रोन सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें।
      नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है।
    6. कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाओं को पैलेट कोशिकाओं के लिए। सुपरनैंट निकालें और उन्हें 2% एफबीएस के साथ पूरक पीबीएस के 3 मिलील में फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाने के लिए 3-5x ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  2. सेल मायने रखता है
    1. सेल सस्पेंशन के 50 माइक्रोल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में डालें और इसे 50 माइक्रोल ट्राइपन ब्लू सॉल्यूशन के साथ मिलाएं। एक मानक विधि का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए मिश्रण का पिपेट 10 माइक्रोन, जैसे कि हेमोसिटोमीटर।
    2. पीबीएस में कोशिकाओं को 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए 2% एफबीएस के साथ पूरक कियाजाता है । सेल सस्पेंशन के 1 एमएल को 5 एमएल पॉलीस्टीरिन राउंड बॉटम टेस्ट ट्यूब में डालें और दो सैंपल ट्यूब तैयार करें।

2. होचस्ट 33342 के साथ सेल धुंधला

  1. एक उपयुक्त अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए एक ट्यूब में Hoechst 33342 जोड़ें।
    नोट: उदाहरण के लिए, Hoechst 33342 की उपयुक्त एकाग्रता एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के लिए 3 μg/एमएल है।
  2. एक अवरोधक (जैसे, Fumitremorgin सी, Verapamil, या Reserpine) एक उपयुक्त अंतिम एकाग्रता के लिए एक और ट्यूब में जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट के रूप में कदम २.१ में वर्णित Hoechst ३३३४२ की एक ही एकाग्रता जोड़ने से पहले ।
    नोट: एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के लिए, उपयुक्त अवरोधक रेसरपाइन (40 माइक्रोन) है। गेटेड एसपी क्षेत्र में कोशिकाओं की अनुपस्थिति को सत्यापित करने के लिए रेसरपाइन का उपयोग अवरुद्ध नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
  3. कोशिकाओं वाली कई ट्यूब तैयार करें और विभिन्न एकाग्रता ढाल में होचस्ट 33342 जोड़ें। एक प्रवाह साइटोमेट्री परख के बाद, एसपी के प्रोफ़ाइल और अनुपात के अनुसार उचित एकाग्रता चुनें।
    नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है जो Hoechst 33342 की उचित एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है।
  4. कोशिकाओं वाली कई ट्यूब तैयार करें, अवरोधक को विभिन्न एकाग्रता ढाल में जोड़ें, ट्यूबों को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, फिर एक उपयुक्त एकाग्रता में होचस्ट 33342 जोड़ें। प्रवाह साइटोमेट्री परख के बाद, गेटेड एसपी क्षेत्र में कोशिकाओं की अनुपस्थिति के अनुसार उचित एकाग्रता का चयन करें।
    नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है जो अवरोधक की उचित एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है।
  5. ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और उन्हें 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, हर 10 मिनट में ट्यूबों को मिलाते हुए।
    नोट: ट्यूबों को अच्छी तरह से मिलाते हुए धुंधला करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह बेहतर धुंधला परिणामों के लिए कोशिकाओं और डाई के बीच पूर्ण संपर्क सुनिश्चित करता है।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 200 x ग्राम,5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनेट को ध्यान से एस्पिट करें, क्योंकि कोशिकाएं बहुत ढीले और अस्थिर छर्रों बनाती हैं।
  7. बर्फ के 1 मिलील में प्रत्येक ट्यूब की कोशिकाओं को फिर से उठाया-ठंडा PBS 2% FBS के साथ पूरक है और कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 3-5x ऊपर और नीचे पिपेट । मृत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रत्येक ट्यूब के निलंबन में 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) का 1 माइक्रोल जोड़ें।
    नोट: ट्यूमर कोशिकाओं से Hoechst 33342 के प्रभाव को बाधित करने के लिए इस चरण में सभी प्रक्रियाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए। ट्यूबों को प्रकाश के सीधे संपर्क से बचाया जाना चाहिए।

3. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण

नोट: फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें) के उपयोग के निर्देश इस खंड में वर्णित हैं और अनुपूरक आंकड़े 1-10हैं।

  1. फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में फोल्डर बटन पर क्लिक करें। प्रयोग बटन पर क्लिक करें, फिर नए प्रयोग पर क्लिक करें(अनुपूरक चित्रा 1A,B)।
  2. ओके बटन पर क्लिक करें। "Experiment_001" फ़ोल्डर (अनुपूरक चित्रा 2 ए,बी) के तहत दिखाईदेगी।
  3. फ़ोल्डर नाम को एक विशिष्ट नाम में बदलने के लिए Experiment_001 बटन पर क्लिक करें (उदाहरण के लिए, "20191118-एसपी")। क्लिक करें एंटरकरें । नया नाम ("20191118-एसपी") फ़ोल्डर (अनुपूरक चित्रा 3 ए,बी) केतहत दिखाई देगा।
  4. नए प्रयोग फ़ोल्डर ("20191118-एसपी") के लिए एक नमूना जोड़ने के लिए नए नमूना बटन पर क्लिक करें। नमूने में एक ट्यूब जोड़ने के लिए नए ट्यूब बटन पर क्लिक करें। क्लिक करें एरोहेड बटन(अनुपूरक चित्रा 4A-C)।
  5. पैरामीटर्स बटन पर क्लिक करें और फ्लो साइटोमीटर(सप्लीमेंट्री फिगर 5)के पैरामीटर सेट करें ।
    1. उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य को अलग करने के लिए 610 एनएम डिक्रोइक मिरर शॉर्ट-पास (डीएमएसपी) का उपयोग करें। लाल फ्लोरेसेंस इकट्ठा करने के लिए ब्लू फ्लोरेसेंस और 675 एनएम ईएफएलपी इकट्ठा करने के लिए 450/20 एनएम बीपी फिल्टर का उपयोग करें।
      नोट: Hoechst 33342 355 एनएम पर एक यूवी लेजर के साथ उत्साहित है और पीआई 488 एनएम पर उत्साहित है।
  6. फ्लो साइटोमीटर पर सेल सैंपल चलाएं।
    नोट: एसपी कोशिकाओं को बाँझ परिस्थितियों में फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) द्वारा हल किया जा सकता है। अनुवर्ती प्रयोगों के लिए कुल 100,000-500,000 कोशिकाओं को एकत्र किया जाना चाहिए।
    1. प्रवाह साइटोमीटर पर Hoechst 33342 के साथ दाग कोशिकाओं को चलाएं।
      1. साइटोमीटर पर होचस्ट 33342 से सना हुआ कोशिकाओं वाली ट्यूब रखें।
      2. डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें, फिर एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एफएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"पीआई-ए"में सेट करें। आगे स्कैटर पल्स क्षेत्र (एफएससी-ए, एक्स-एक्सिस सेट टू रैखिक मोड) बनाम पीआई फ्लोरेसेंस (वाई-एक्सिस सेट टू लॉगरिथम स्केल) के डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करें। वोल्टेज को दाईं ओर और गैर-जीवित कोशिकाओं को दिखाने के लिए समायोजित करें, जो ऊपरी बाएं कोने में पीआई के साथ चमकीले दाग हैं। फिर, पी 1 सबसेट को गेट करने के लिए पॉलीगॉन गेट बटन पर क्लिक करके मृत कोशिकाओं और सेल मलबे(चित्रा 1 ए)को बाहर करने के लिए एक बहुभुज गेट स्थापित करें, जिसे एफएससी-ए, पीआई-ए सबसेट(अनुपूरक चित्रा 6 ए,बी)के रूप में भी जाना जाता है।
      3. डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एफएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एफएससी-डब्ल्यू"में सेट करें। एफएससी-ए (एक्स-एक्सिस) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर पल्स चौड़ाई (एफएससी-डब्ल्यू, वाई-एक्सिस) के डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करें। डॉट प्लॉट पर राइट-क्लिक करें, शो आबादी बटन के नीचे पी1 बटन पर क्लिक करें। पी 2 सबसेट (जिसे एफएससी-ए, एफएससी-डब्ल्यू सबसेट भी कहा जाता है) को गेट करने के लिए आयताकार गेट बनाने के लिए आयताकार गेट बटन पर क्लिक करें। यह बड़ी मात्रा(अनुपूरक चित्रा 7A-C और चित्रा 1A) के साथ कोशिकाओं को बाहर करेगा।
      4. डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एसएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एसएससी-डब्ल्यू"में सेट करें। साइड स्कैटर पल्स एरिया (एसएससी-ए, एक्स-एक्सिस) बनाम साइड स्कैटर पल्स चौड़ाई (एसएससी-डब्ल्यू, वाई-एक्सिस) के डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करें। डॉट प्लॉट पर राइट-क्लिक करें, और शो आबादी बटन के तहत P2 बटन पर क्लिक करें। इसके बाद पी3 सबसेट (जिसे एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट भी कहा जाता है) को गेट करने के लिए आयताकार गेट बनाने के लिए आयताकार गेट बटन पर क्लिक करें । यह एक समान दानेदारता के साथ एक सेल आबादी प्राप्तकरेगा (अनुपूरक चित्रा 8A-C और चित्रा 1A)।
      5. डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"होचस्ट रेड-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"होचस्ट ब्लू-ए"में सेट करें। होचस्ट रेड-ए (एक्स-एक्सिस) बनाम होचस्ट ब्लू-ए (वाई-एक्सिस) के डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करें। डॉट प्लॉट पर राइट-क्लिक करें, शो आबादी बटन के नीचे P3 बटन पर क्लिक करें । P4 सबसेट गेट (जिसे होचस्ट रेड-ए, होचस्ट ब्लू-ए सबसेट के नाम से भी जाना जाता है) को गेट करने के लिए एक बहुभुज गेट बटन पर क्लिक करें। दाएं-क्लिक करें डॉट प्लॉट, जनसंख्या पदानुक्रम दिखाने के लिए शो पॉपुलेशन पदानुक्रम बटन पर क्लिक करें।
        नोट: डॉट प्लॉट तीन अलग-अलग आबादी दिखाएगा: 1) ग्राफ के केंद्र के पास एक G0-G1 चरण की आबादी; 2) ऊपरी दाहिने कोने के पास एक एस-G2/M चरण आबादी; 3) सपा। इसके बाद एसपी को आगे के विश्लेषण के लिए गेटेड किया जाता है(सप्लीमेंट्री फिगर 9ए-डी और फिगर 1ए)। यदि Hoechst लाल-ए बनाम Hoechst ब्लू-ए की डॉट प्लॉट चित्रा 1Aमें दिखाए गए एसपी प्रोफाइल के समान नहीं दिखाती है, तो वोल्टेज को तब तक समायोजित किया जाना चाहिए जब तक कि एक समान प्रोफ़ाइल नहीं देखी जाती है। इस बीच, तदनुसार ऊपर के सभी फाटकों को समायोजित करें।
      6. एसपी सेल के गेट क्षेत्र का निर्धारण करने के बाद, एसपी कोशिकाओं(अनुपूरक चित्रा10) के प्रतिशत का विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक नमूने से 20,000-100,000 घटनाओं को एकत्र करने के लिए डेटा प्राप्त करने पर क्लिक करें।
    2. प्रवाह साइटोमीटर पर अवरोधक के साथ इलाज Hoechst 33342-दाग कोशिकाओं को चलाएं।
      1. साइटोमीटर पर अवरोधक युक्त ट्यूब रखें और एक ही वोल्टेज और फाटकों का उपयोग करके कोशिकाओं को चलाने के लिए आगे की जांच करें कि वोल्टेज और फाटकों का चयन उचित रूप से किया जाता है या नहीं।
        नोट: अकेले धुंधला Hoechst ३३३४२ के साथ तुलना में, केवल कोशिकाओं का एक बहुत छोटा सा अनुपात, यदि कोई हो, सपा के gated क्षेत्र में दिखाई देना चाहिए(चित्रा 1B)।
      2. एसपी कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक नमूने से 20,000-100,000 घटनाओं को एकत्र करें।

4. डेटा विश्लेषण

नोट: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें) के उपयोग के लिए निर्देश इस खंड में वर्णित हैं और अनुपूरक आंकड़े 11-16।

  1. एफसीएस प्रारूप में फाइलों को कंप्यूटर में कॉपी करें, फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस सॉफ्टवेयर खोलें, और एक सैंपल फाइल को सॉफ्टवेयर(सप्लीमेंट्री फिगर 11ए,बी)में खींचें।
  2. गेट सेल और एसपी सेल का प्रतिशत प्राप्त करें।
    1. डबल इस नमूना फ़ाइलपर क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एफएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"पीआई-ए"में सेट करें। इसके बाद एक पॉलीगॉन गेट बनाएं और एफएससी-ए, पीआई-ए सबसेट(सप्लीमेंट्री फिगर 12ए-ई)प्राप्त करने के लिए ओके बटन पर क्लिक करें ।
    2. डबल क्लिक एफएससी-ए, पीआई-ए सबसेट फाइल, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एफएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एफएससी-डब्ल्यू"में सेट करें। फिर, आयताकार गेट बनाएं और एफएससी-ए, एफएससी-डब्ल्यू सबसेट(अनुपूरक चित्रा 13ए-ई)प्राप्त करने के लिए ओके बटन पर क्लिक करें।
    3. एफएससी-ए, एफएससी-डब्ल्यू सबसेट फाइलपर डबल क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एसएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एसएससी-डब्ल्यू"में सेट करें। इसके बाद आयताकार गेट बनाएं और एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट(सप्लीमेंट्री फिगर 14ए-ई)प्राप्त करने के लिए ओके बटन पर क्लिक करें।
    4. डबल क्लिक करें एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट फाइल, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"होचस्ट रेड-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"होचस्ट ब्लू-ए"में सेट करें। फिर, एक बहुभुज गेट बनाएं और होचस्ट रेड-ए, होचस्ट ब्लू-ए सबसेट(अनुपूरक चित्रा 15A-ई)प्राप्त करने के लिए ओके बटन पर क्लिक करें।
    5. ओपन लेआउट एडिटर बटन पर क्लिक करके लेआउट एडिटर खोलें। एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट फाइल को लेआउट एडिटर में खींचें, फिर इमेज रिजल्ट्स(सप्लीमेंट्री फिगर 16ए-सी)को सेव करने के लिए फाइल बटन के लिए लेआउट विंडो को सेव करने के लिए क्लिक क्लिक करें ।
  3. सॉफ्टवेयर बंद करते समय गेटिंग की जानकारी रखने के लिए कार्यक्षेत्र को सहेजें।
  4. दो समूहों के बीच अंतर की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ टी-टेस्ट विश्लेषण करें। पी < 0.05 का मूल्य सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में परिभाषित किया गया था।

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Representative Results

इस विधि के अनुसार चार प्रायोगिक एसपी विश्लेषण किए गए। पहले एक में, हमने सामान्य परिस्थितियों में एमडीए-एमबी-231 में एसपी कोशिकाओं के अनुपात का पता लगाया, जो एक ट्रिपल नकारात्मक मानव स्तन कैंसर सेल लाइन है। सेल गिनती के बाद, Hoechst ३३३४२ एक ट्यूब में जोड़ा गया था जिसमें 1 x 106 कोशिकाओं को 3 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया था । Reserpine और Hoechst ३३३४२ क्रमशः ४० μM और 3 μg/mL, की अंतिम सांद्रता के लिए एक और ट्यूब में जोड़ा गया । पीआई को दोनों ट्यूबों में जोड़ा गया। एफएससी-ए (एक्स-एक्सिस) बनाम पीआई-ए (वाई-एक्सिस) के डॉट प्लॉट ने तीन आबादी दिखाई: 1) एक पीआई-पॉजिटिव सेल आबादी, जो मृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है; 2) सेल मलबा; और 3) मुख्य आबादी पीआई-निगेटिव कोशिकाएं थीं, जिन्हें आगे के विश्लेषण(चित्रा 1A,बी)के अधीन किया गया था। एफएससी-ए (एक्स-एक्सिस) बनाम एफएससी-डब्ल्यू (वाई-एक्सिस) के डॉट प्लॉट और एसएससी-ए (एक्स-एक्सिस) बनाम एसएससी-डब्ल्यू (वाई-एक्सिस) के डॉट प्लॉट से गेटेड एक सिंगल-सेल आबादी का इस्तेमाल एसपी सेल(चित्रा 1 ए,बी)के अनुपात का विश्लेषण करने के लिए किया गया था । एसपी सेल होएचस्ट रेड-ए (एक्स-एक्सिस) बनाम होचस्ट ब्लू-ए (वाई-एक्सिस) के डॉट प्लॉट से गेटेड थे, और उनका प्रतिशत एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं(चित्रा 1A)में लगभग ०.९% था । हालांकि, Reserpine बहुत सपा कोशिकाओं(चित्रा 1B)के अनुपात में कमी आई है, का समर्थन है कि सपा के लिए गेट पेंटिंग सही है ।

दूसरा प्रयोग एमडीए-एमबी-435 कोशिकाओं में Hoechst 33342 की उपयुक्त धुंधला एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए किया गया था। सेल काउंटिंग के बाद, Hoechst 33342 को 1 x 106 कोशिकाओं में जोड़ा गया था, जिन्हें पीबीएस के 1 एमएल में 2% एफबीएस के साथ पूरक किया गया था, जिसमें 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, और 4 μg/ml शामिल हैं। जैसा कि चित्रा 2 एमें दिखाया गया है, जब Hoechst 33342 की एकाग्रता बहुत कम थी (यानी, 0.5, 1, 1.5 μg/mL), यह अन्य सेल आबादी से सपा कोशिकाओं को अलग करना मुश्किल था, क्योंकि बहुत सारी कोशिकाएं मंद-दाग वाली स्थिति में थीं। जब Hoechst 33342 की एकाग्रता बहुत अधिक थी (यानी, 2.5, 3, 3.5, 4 μg/mL), सपा कोशिकाओं के अनुपात में कमी आई जब तक यह गायब हो गया। इस प्रकार, 2 μg/mL Hoechst 33342 एमडीए-एमबी-435 कोशिकाओं में एसपी विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा एकाग्रता था। इसके अलावा, इस सेल लाइन के लिए उचित अवरोधक निर्धारित करने के लिए, Hoechst 33342 और एक अवरोधक (Verapamil या Reserpine) 1 x 106 कोशिकाओं में जोड़ा गया था, जो पीबीएस के 1 मिलीएल में निलंबित कर दिया गया था 2% FBS के साथ पूरक, क्रमशः 2 μg/mL और 40 μM की अंतिम सांद्रता के लिए । जैसा कि चित्रा 2Bमें दिखाया गया है, लगभग 0.4% कोशिकाओं ने वेरापमिल उपचार के बाद डाई को निष्कासित कर दिया। हालांकि, Reserpine उपचार के बाद, अनुपात के बारे में ०.१%(चित्रा 2C)को गिरा दिया । इस प्रयोग से, रेसरपाइन को इस सेल लाइन के लिए अधिक उपयुक्त अवरोधक माना जाता था।

तीसरे उदाहरण में, A549 कोशिकाओं (मानव फेफड़े एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं) को 48 घंटे (एच) के लिए स्टेट3 एक्टिवेटर-कोलिवलिन20 (100 एनएम) के साथ पूर्वनिचारित किया गया था। ट्यूमर कोशिकाओं की स्टेमनेस विशेषताओं को बढ़ावा देने के लिए स्टेट3 सिग्नलिंग पाथवे महत्वपूर्ण है21. जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, सपा कोशिकाओं का अनुपात कोलिवलिन उत्तेजना पर बढ़ गया।

अंतिम उदाहरण में, T47D कोशिकाओं (मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं) 48 एच22के लिए 0.1 μM FRA1 अवरोधक-SKLB816 (13an भी नाम) के साथ पूर्व नियोजित किया गया था। FRA1 एपिथेलियल-मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी) का एक रिपोर्ट द्वारपाल है और ट्यूमर स्टेमनेस23के नियमन में शामिल है । जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है, FRA1 अवरोधक के उपचार के कारण एसपी कोशिकाओं का अनुपात कम हो गया।

Figure 1
चित्रा 1: एसपी विश्लेषण में एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति। }एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति, जो होचस्ट 33342 (3 माइक्रोग्राम/एमएल) और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई, 1 माइक्रोग्राम/एमएल) से सना हुआ था। (ख)एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति, जिनका उपचार रेसरपाइन (40 माइक्रोन) के साथ किया गया था और होएचस्ट 33342 (3 माइक्रोग्राम/एमएल) और पीआई (1 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ दाग दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: Hoechst 33342 एकाग्रता का अनुकूलन और एमडीए-एमबी-435 कोशिकाओं में अवरोधक का चयन। (A)एमडीए-एमबी-435 कोशिकाओं के एसपी विश्लेषण परिणाम, जो विभिन्न एकाग्रता ग्रेडिएंट (0.5, 1, 1.5, 2.5, 3, 3.5, 4 μg/mL) के साथ एक साथ PI (1 μg/mL) पर Hoechst 33342 (Hoechst) के साथ दाग थे। (ख)एमडीए-एमबी-435 कोशिकाओं का एसपी विश्लेषण परिणाम, जिनका इलाज वेरापमिल (40 माइक्रोन) के साथ किया गया और होचस्ट 33342 (2 माइक्रोग्राम/एमएल) और पीआई (1 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ दाग दिया गया। (ग)एमडीए-एमबी-435 कोशिकाओं का एसपी विश्लेषण परिणाम, जिनका उपचार रेसरपाइन (40 माइक्रोन) के साथ किया गया था और होचस्ट 33342 (2 माइक्रोग्राम/एमएल) और पीआई (1 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ दाग दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: A549 कोशिकाओं में STAT3 सक्रियक द्वारा एसपी कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि की गई थी। (A)STAT3 एक्टिवेटर-कोलिवलिन (१०० एनएम) या ४८ घंटे के लिए इसके वाहन नियंत्रण (Ctrl)-H2O के साथ पूर्वनिर् लगाया A549 कोशिकाओं के एसपी विश्लेषण परिणाम । Reserpine (45 μM) के साथ इलाज A549 कोशिकाओं को अवरुद्ध नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। A549 कोशिकाओं Hoechst ३३३४२ (7 μg/mL) और पीआई (1 μg/mL) के साथ दाग थे । (ख)कोलिवलिन (100 एनएम) और उसके वाहन नियंत्रण के साथ इलाज A549 कोशिकाओं में सपा कोशिकाओं के अनुपात के सांख्यिकीय परिणाम। डेटा को प्रत्येक समूह के लिए मतलब + मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, एन = 3। "*" 0.05 < पी इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: एसपी कोशिकाओं का अनुपात T47D कोशिकाओं में FRA1 अवरोधक द्वारा बाधित किया गया था। (A)T47D कोशिकाओं के एसपी विश्लेषण परिणाम SKLB816 (०.१ μM) या उसके वाहन नियंत्रण (Ctrl)-DMSO के साथ ४८ घंटे के लिए पूर्वtreated । Reserpine (40 μM) के साथ इलाज T47D कोशिकाओं को अवरुद्ध नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। T47D कोशिकाओं Hoechst ३३३४२ (8 μg/mL) और पीआई (1 μg/mL) के साथ दाग थे । (ख)SKLB816 (0.1 μM) और उसके वाहन नियंत्रण के साथ इलाज T47D कोशिकाओं में सपा कोशिकाओं के अनुपात के सांख्यिकीय परिणाम । डेटा प्रत्येक समूह के लिए मतलब + SEM, n = 3 के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । "*" 0.05 < पी इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 3.1 के लिए निर्देश। (A) फोल्डर बटन पर क्लिक करें। (B) एक्सपेरिमेंट बटन पर क्लिक करें और फिर नए एक्सपेरिमेंट बटन पर क्लिक करें। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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अनुपूरक चित्रा 6: फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 3.6.1.2 के लिए निर्देश। (A)डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एफएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे "पीआई-ए"में सेट करें। (ख)पी1 सबसेट (जिसे एफएससी-ए, पीआई-ए सबसेट के नाम से भी जाना जाता है) को गेट करने के लिए पॉलीगॉन गेट बटन पर क्लिक करें। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 7: फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 3.6.1.3 के लिए निर्देश। (A)डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे "एफएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे "एफएससी-डब्ल्यू"में सेट करें। (B)डॉट प्लॉट पर राइट क्लिक करें और शो आबादी बटन के तहत पी1 बटन पर क्लिक करें । (ग)पी2 सबसेट (जिसे एफएससी-ए, एफएससी-डब्ल्यू सबसेट भी कहा जाता है) को गेट करने के लिए आयताकार गेट बनाने के लिए आयताकार गेट बटन पर क्लिक करें । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 8: फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 3.6.1.4 के लिए निर्देश। (A) डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एसएससी-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एसएससी-डब्ल्यू"में सेट करें। (ख)डॉट प्लॉट पर राइट-क्लिक करें और शो ब्रिसिबल बटन के नीचे पी2 बटन पर क्लिक करें ।(C)पी3 सबसेट गेट (जिसे एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट के नाम से भी जाना जाता है) को गेट करने के लिए आयताकार गेट बटन पर क्लिक करें। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 9: फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 3.6.1.5 के लिए निर्देश। (A) डॉट प्लॉट को प्रदर्शित करने के लिए डॉट प्लॉट बटन पर क्लिक करें, एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"होचस्ट रेड-ए"में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"होचस्ट ब्लू-ए"में सेट करें। (B)डॉट प्लॉट पर राइट क्लिक करें और शो ब्रिएंस बटन के नीचे पी3 बटन पर क्लिक करें । (ग)P4 सबसेट गेट (जिसे होचस्ट रेड-ए, होचस्ट ब्लू-ए सबसेट के नाम से भी जाना जाता है) को गेट करने के लिए पॉलीगॉन गेट बटन पर क्लिक करें । (घ)डॉट प्लॉट पर राइट-क्लिक करें, फिर जनसंख्या पदानुक्रम दिखाने के लिए शो पॉपुलेशन पदानुक्रम बटन पर क्लिक करें । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 10: प्रवाह साइटोमीटर सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 3.6.1.6 के लिए निर्देश। (A) अधिग्रहण डेटा बटन पर क्लिक करें, फिर प्रत्येक नमूने से 20,000-100,000 घटनाओं को इकट्ठा करें। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 11: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 4.1 के लिए निर्देश। (A)फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस सॉफ्टवेयर खोलें और एक सैंपल फाइल को सॉफ्टवेयर में खींचें । (ख)नमूना फाइल आयात की जाती है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 12: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 4.2.1 के लिए निर्देश। (A)इस सैंपल फाइल पर डबल क्लिक करें। (B) एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे'एफएससी-ए'पर सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"पीआई-ए"में सेट करें। (ग) पॉलीगॉन गेट बनाने के लिए एक बहुभुज गेट बटन बनाएं पर क्लिक करें। (D)एफएससी-ए, पीआई-ए सबसेट प्राप्त करने के लिए ओके बटन पर क्लिक करें। (ई)एफएससी-ए, पीआई-ए सबसेट प्राप्त किया जाता है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 13: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्टेप संख्या 4.2.2 के लिए निर्देश। (A) एफएससी-ए, पीआई-ए सबसेट फाइल पर डबल क्लिक करें।(B) एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे'एफएससी-ए'में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एफएससी-डब्ल्यू"में सेट करें। (C) आयताकार गेट बनाने के लिए आयताकार गेट बटन बनाने पर क्लिक करें। (D)एफएससी-ए, एफएससी-डब्ल्यू सबसेट प्राप्त करने के लिए ओके बटन पर क्लिक करें। (ई)एफएससी-ए, एफएससी-डब्ल्यू सबसेट प्राप्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 14: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्टेप संख्या 4.2.3 के लिए निर्देश। (A) एफएससी-ए, एफएससी-डब्ल्यू सबसेट फाइल पर डबल क्लिक करें। (B) एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे'एसएससी-ए'में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"एसएससी-डब्ल्यू"में सेट करें। (ग) आयताकार गेट बनाने के लिए आयताकार गेट बटन बनाएं क्लिक करें। (घ)एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट प्राप्त करने के लिए ओके बटन पर क्लिक करें । (ई)एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट प्राप्त किया जाता है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 15: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्टेप नंबर 4.2.4 के लिए निर्देश। (A) एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट फाइल पर डबल क्लिक करें।(B) एक्स-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे'होचस्ट रेड-ए'में सेट करें; वाई-एक्सिस पर क्लिक करें और इसे"होचस्ट ब्लू-ए"में सेट करें। (ग) पॉलीगॉन गेट बनाने के लिए एक बहुभुज गेट बटन बनाएं पर क्लिक करें। (घ)होचस्ट रेड-ए, होचस्ट ब्लू-ए सबसेट प्राप्त करने के लिए ओके बटन पर क्लिक करें । (ई)होचस्ट रेड-ए, होचस्ट ब्लू-ए सबसेट प्राप्त किया जाता है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 16: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्टेप संख्या 4.2.5 के लिए निर्देश। (A) लेआउट एडिटर को खोलने के लिए ओपन लेआउट एडिटर बटन पर क्लिक करें। (ख) एसएससी-ए, एसएससी-डब्ल्यू सबसेट सैंपल फाइल को लेआउट एडिटरके पास खींचें । (C)इमेज रिजल्ट्स को सेव करने के लिए फाइल बटन के लिए लेआउट विंडो को सेव करने के लिए क्लिक करें क्लिक करें। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सपा की परख के लिए कई अहम बातें ध्यान में रखनी हैं। पहला प्रत्येक सेल लाइन के लिए वेरामिल या रेसरपाइन जैसे उचित अवरोधक का चयन है, क्योंकि सपा कोशिकाओं का "गेट" स्थान उस स्थिति के अनुसार निर्धारित किया जाता है जिस पर अवरोधक के अलावा बड़ी संख्या में सपा कोशिकाएं गायब हो जाती हैं। एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन के लिए रेसरपाइन अच्छा काम करता है। हालांकि, अन्य सेल लाइनों के लिए, विभिन्न ब्लॉकर्स बेहतर काम कर सकते हैं।

दूसरा है होचस्ट 33342 की एकाग्रता। प्रतिनिधि आंकड़ों से पता चला है कि होचस्ट 33342 की धुंधला एकाग्रता कम होते ही एसपी कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ गया। इस घटना को डाई तेज काइनेटिक्स24द्वारा समझाया जा सकता है। डाई एकाग्रता में परिवर्तन कोशिकाओं में Hoechst 33342 के संवर्धन को प्रभावित करते हैं। इसलिए, Hoechst 33342 धुंधला एकाग्रता एसपी परख के परिणामों से निकटता से संबंधित है। इसके अलावा, तेज और Hoechst ३३३४२ के निष्कासन सेल प्रकार के बीच बदलती हैं । इस प्रकार, एसपी विश्लेषण से पहले विभिन्न सेल लाइनों के लिए Hoechst 33342 की उचित सांद्रता का पता लगाया जाना चाहिए।

तीसरा प्रवाह साइटोमीटर का भिन्नता (सीवी) का एक अच्छा गुणांक है, जो एसपी विश्लेषण25के लिए भी महत्वपूर्ण है। यूवी लेजर पावर बेहतर सीवी12के लिए एक महत्वपूर्ण मानदंड है । यह प्रोटोकॉल सपा परख करने के लिए एक वाणिज्यिक प्रवाह साइटोमीटर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करता है। इस क्यूवेट-फ्लो-सेल इंस्ट्रूमेंट में हमने 15 एमडब्ल्यू की पावर के साथ यूवी लेजर का इस्तेमाल करते हुए बेहतरीन सीवी हासिल किए। सामान्य तौर पर, अपेक्षाकृत उच्च यूवी लेजर पावर इष्टतम सीवी प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, 50-100 एमडब्ल्यू जेट-इन-एयर इंस्ट्रूमेंट्स12पर इष्टतम होचस्ट सिग्नल प्रदान करते हैं। कुछ लेजर कम यूवी पावर प्रदान करते हैं, जो सीवी को कम कर सकते हैं। इन मामलों में, अच्छा लेजर संरेखण महत्वपूर्ण है।

अंतिम प्रयोग के दौरान अन्य कारकों का प्रभाव है। सेल स्थिति, तापमान, धुंधला होने का समय, प्रवाह साइटोमेट्री का संचालन, और अन्य कारक भी एसपी परख के अनुपात और गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, सेल निलंबन की तैयारी के दौरान कोशिका व्यवहार्यता में परिवर्तन एसपी कोशिकाओं के अनुपात को प्रभावित करेगा। इसलिए, एसपी विश्लेषण करने से पहले सर्वोत्तम प्रायोगिक स्थितियों का पता लगाया जाना चाहिए। उपरोक्त कारकों को ध्यान में रखते हुए, विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा मापा गया एक ही सेल लाइन का एसपी अनुपात अलग हो सकता है। उदाहरण के लिए, एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं और A549 कोशिकाओं का अनुपात क्रमशः ~0.1%-4.8%26, 27,28,29 और ~ 0.8%-18%30,31,32,33,34, 34,बताया गया।

शोधकर्ता विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस परख को संशोधित कर सकते हैं, जैसे अन्य ट्यूमर सेल लाइनों का अध्ययन, या प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाएं। यदि प्रोटोकॉल कोशिकाओं का परीक्षण किया जा रहा है के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करता है, शोधकर्ताओं ने सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं का उपयोग कर सकते है और दिया विनिर्देशों के बाद कोशिकाओं दाग । क्योंकि यह प्रोटोकॉल Hoechst 33342 की एकाग्रता, तापमान और समय आदि को धुंधला करने के प्रति बहुत संवेदनशील है, शोधकर्ताओं को इन सभी स्थितियों की बारीकी से जांच करनी चाहिए। कई प्रकार की मानव ट्यूमर कोशिका रेखाओं में एसपी का प्रतिशत अपेक्षाकृत कम(~ 0%-37%)19,26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36है । यदि एसपी का अत्यधिक उच्च या निम्न प्रतिशत देखा जाता है, तो यह Hoechst 33342 या अवरोधक का उपयोग करने के अनुचित सांद्रता के कारण हो सकता है। यदि समस्या प्रवाह साइटोमीटर से संबंधित प्रतीत होती है, तो तकनीकी सहायता प्राप्त की जानी चाहिए।

हालांकि सीएससी का विश्लेषण करने और अलग करने के लिए एसपी का उपयोग अत्यधिक कुशल है, फिर भी इसकी कुछ सीमाएं हैं। पहला है12परिस्थितियों को धुंधला करने के प्रति इसकी उच्च संवेदनशीलता । होचस्ट 33342 की एकाग्रता, सेल स्थिति, तापमान, धुंधला होने का समय, प्रवाह साइटोमेट्री का संचालन और अवरोधक चयन जैसे कई कारक एसपी विश्लेषण की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। दूसरा है होचस्ट 33342 का साइटोटॉक्सिक प्रभाव। Hoechst 33342 एक डीएनए बाध्यकारी डाई है, लेकिन कोशिकाओं के लिए विषाक्त है जब यह उच्च सांद्रता तक पहुंचता है और इस तरह कोशिका गतिविधि37कम कर देता है।

संक्षेप में, एसपी विश्लेषण ट्यूमर सेल लाइनों में सीएससी की पहचान और शुद्ध करने के लिए हाल के वर्षों में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है। यद्यपि विशिष्ट सीएससी सतह मार्कर के अभाव में विधि की कुछ सीमाएं हैं, यह अभी भी सीएससी के सुविधाजनक, तेजी से और लागत प्रभावी संवर्धन के लिए एक विधि है। यह विधि सीएससी के जैविक कार्यों का अध्ययन करने और विशिष्ट सतह मार्कर की पहचान के लिए फायदेमंद है। इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के एसपी अनुपात पर विभिन्न संकेतों के प्रभावों का पता लगाकर, यह सीएससी सुविधाओं पर इन सिग्नल रास्तों के नियामक प्रभाव के लिए सुराग प्रदान कर सकता है, और नए तंत्र की खोज को सुविधाजनक बना सकता है, जो अंततः ट्यूमर की लक्षित चिकित्सा का मार्गदर्शन कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन 81572599, 81773124 और 81972787 के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था; तियानजिन सिटी (चीन) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन 19JCYBJC27300; तियानजिन पीपुल्स हॉस्पिटल और नानकाई विश्वविद्यालय सहयोगी अनुसंधान अनुदान 2016rmnk005; केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष, नानकाई विश्वविद्यालय 63191153 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well cell culture plate CORNING 3516 9.5 cm2 (approx.)
Colivelin MCE HY-P1061A Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries (BIOIND) 04-001-1ACS
Flow cytometer BD Biosciences BD LSRFortessa
Flow cytometer software BD Biosciences FACSDiva
Flow cytometry analysis software BD Biosciences FlowJo
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Polystyrene round bottom test tube CORNING 352054 12 x 75 mm, 5 mL
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide
Reserpine Sigma-Aldrich 83580 (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester
SKLB816 Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Verapamil hydrochloride Sigma-Aldrich V4629 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride

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References

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Dong, X., Wei, Y., Xu, T., Tan, X., Li, N. Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines. J. Vis. Exp. (168), e60658, doi:10.3791/60658 (2021).

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