Summary
En bekvem, hurtig og omkostningseffektiv metode til at måle andelen af sidepopulationceller i faste tumorcellelinjer præsenteres.
Abstract
Kræft stamceller (CSC' er) er en vigtig årsag til tumor vækst, metastaser, og tilbagefald. Isolation og identifikation af CSC'er er af stor betydning for tumorforskning. I øjeblikket er flere teknikker, der anvendes til identifikation og rensning af CSC'er fra tumorvæv og tumor cellelinjer. Adskillelse og analyse af sidepopulationer (SP) celler er to af de almindeligt anvendte metoder. Metoderne er afhængige af CSC'ernes evne til hurtigt at udvise fluorescerende farvestoffer, såsom Hoechst 33342. Farvestoffets efflux er forbundet med de ATP-bindende kassettetransportører (ABC) og kan hæmmes af ABC-transporterhæmmere. Metoder til farvning af dyrkede tumorceller med Hoechst 33342 og analyse af andelen af deres SP-celler ved flowcytometry er beskrevet. Denne analyse er praktisk, hurtig og omkostningseffektiv. Data genereret i denne analyse kan bidrage til en bedre forståelse af effekten af gener eller andre ekstracellulære og intracellulære signaler på tumorcellernes stængelegenskaber.
Introduction
Kræft stamceller (CSC'er) er delmængder af celler med selvfornyelse evne og flere differentiering potentiale, som spiller en afgørende rolle i tumor vækst, metastaser, og gentagelse1,2. I øjeblikket, CSC'er er blevet identificeret til at eksistere i en række ondartede tumorer, herunder lunge, hjerne, bugspytkirtel, prostata, bryst, og leverkræft3,4,5,6,7,8,9. Identifikation af CSC'er i disse tumorer er hovedsageligt baseret på tilstedeværelsen af overflademarkørproteiner, såsom højt og / eller lavt udtryk for CD44, CD24, CD133 og Sca-19,10, men en unik markør, der kan skelne CSC'er fra ikke-CSC'er, er ikke blevet rapporteret indtil videre. I øjeblikket er flere teknikker bruges til at identificere og rense CSC'er i tumorvæv eller tumor cellelinjer. Disse teknikker er designet ud fra CSC'ernes specifikke egenskaber. Blandt dem er assays og sortering af sidepopulation (SP) celler to af de almindeligt anvendte metoder.
SP celler blev oprindeligt opdaget af Goodell et al.11, når de karakteriserede hæmatopoietiske stamceller i mus knoglemarvsceller. Når musen knoglemarvsceller blev mærket med fluorescerende farvestof Hoechst 33342, en lille gruppe af Hoechst 33342 svagt farvede celler dukkede op i de to-dimensionelle prik plot af en flow cytometri assay. Hoechst 33342 er et DNA-bindende farvestof og har mindst to bindende tilstande, der fører til forskellige spektralegenskaber. Ved visning af fluorescensemission ved to bølgelængder på samme tid kan flere populationer afsløres12. I deres analyse, var Hoechst 33342 ophidset på 350 nm og fluorescens blev målt ved hjælp af 450/20 nm band-pass (BP) filter og 675 nm kant filter long-pass (EFLP)11. Sammenlignet med hele populationen af knoglemarvsceller blev denne gruppe celler beriget med hæmatopoietiske stamceller kaldet SP-celler11. SP celler er i stand til hurtigt at udvise Hoechst 33342. Efflux af dette farvestof er relateret til ATP-bindende kassette (ABC) transportører13, som kan hæmmes af nogle stoffer som Fumitremorgin C14, Verapamil og Reserpine15,16. Derefter blev forskellige proportioner af SP-celler påvist i en række væv, organer, tumorvæv og tumorcellelinjer17,18,19. Disse SP-celler har mange karakteristika ved stamceller17,19.
Dette manuskript beskriver Hoechst 33342 mærkning og farvning af dyrkede tumorceller og analyse af SP-celler ved flowcytometry. Desuden er optimering af Hoechst 33342 koncentration og den korrekte blocker udvælgelse til en bestemt tumor celle linje ved hjælp af denne fremgangsmåde vist. Endelig er virkningerne af stemness fremme eller hæmning signaler på andelen af SP i tumorceller er påvist. De eksperimentelle eksempler viser, at analyse af SP kan bruges til at udforske virkningerne af forskellige signaler, såsom genekspression, små hæmmere, aktivatorer, cytokiner og kemokiner, på tumorstilke. Sammenlignet med andre metoder til isolering og rensning af CSC'er, såsom sortering af CD44+/ CD24- befolkning, aldehyd dehydrogenase (ALDH) analyse, og tumor kugle dannelse assays, denne metode er lettere for manipulation og er omkostningseffektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celleforberedelse
- Celle fordøjelse og neutralisering
- Frø tumorceller (såsom MDA-MB-231 celler) i en 6 godt plade, og kultur dem i en 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2.
- Høst celler, når deres tæthed når omkring 90%. Aspirér dyrkningsmediet grundigt og vask cellerne 2x med 3 mL fosfat buffered saltvand (PBS).
BEMÆRK: For at undersøge virkningerne af signalvejshæmmere (f.eks. FRA1-hæmmer) eller aktivatorer (f.eks. STAT3-aktivator) på tumorcellers stæsseegenskaber, sås tumorceller i en 6-brøndplade og forbehandles med hæmmere eller aktivatorer i en vis tid før høst. - Der tilsættes 500 μL på 0,25% trypsin-EDTA til hver brønd på 6-brøndspladen, pladen placeres i en inkubator ved 37 °C i 1-3 minutter (min.), og bank forsigtigt på pladen for at løsne cellerne.
BEMÆRK: Langvarig fordøjelse vil påvirke SP-profilen på grund af ændringer i celledygtighed. - Der tilsættes 3 mL PBS suppleret med 2% føtalt kvægserum (FBS) til hver brønd af 6-brøndspladen for at afslutte fordøjelsen og forsigtigt pipette cellerne op og ned 3-5x for at sprede celleklumperne.
- Tilsæt 0,5 mL celleaffjedring til en brønd af en ny 6 brøndplade og undersøg den under et mikroskop. Hvis der observeres celleklumper, skal celleaffjedringen passeres gennem en 70 μM cellefum.
BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin. - Cellerne overføres til et centrifugerør på 15 mL. Centrifuge celler ved 200 x g i 5 minutter til pellet celler. Fjern supernatanten og genbrug dem i 3 mL PBS suppleret med 2% FBS. Pipetter cellerne op og ned 3-5x for at blande grundigt.
- Antal celler
- Der tilsættes 50 μL af celleaffjedringen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og det blandes med en blå opløsning på 50 μL trypan. Pipette 10 μL af blandingen for at tælle antallet af levende celler ved hjælp af en standardmetode, såsom et hæmocytometer.
- Cellerne i PBS fortyndes med 2% FBS til en endelig koncentration på 1 x 106 celler/mL. Der tilsættes 1 mL af celleaffjedringen til et 5 mL polystyren rundt nederste reagensglas, og der fremstilles to prøverør.
2. Celle farvning med Hoechst 33342
- Tilsættes Hoechst 33342 til et rør for at nå en passende endelig koncentration.
BEMÆRK: Den passende koncentration af Hoechst 33342 er f.eks. - Der tilsættes en blokker (f.eks. Fumitremorgin C, Verapamil eller Reserpine) til et andet rør til en passende endelig koncentration, og røret inkuberes ved 37 °C i 30 minutter, inden der tilsættes samme koncentration af Hoechst 33342 som beskrevet i trin 2.1.
BEMÆRK: For MDA-MB-231 celler er den relevante blokker Reserpine (40 μM). Reserpine bruges som blokeringskontrolelement til at kontrollere fraværet af celler i det indhegnede SP-område. - Forbered flere rør, der indeholder celler, og tilsæt Hoechst 33342 til forskellige koncentrationsgradienter. Efter en flow cytometrianalyse skal du vælge den korrekte koncentration i henhold til SP's profil og andel.
BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin, der bruges til at definere den korrekte koncentration af Hoechst 33342. - Forbered flere rør, der indeholder celler, tilsæt blokkeren til forskellige koncentrationsgradienter, inkubat rørene ved 37 °C i 30 minutter, og tilsæt derefter Hoechst 33342 til en passende koncentration. Efter flowcytometrianalysen skal du vælge den korrekte koncentration i henhold til fraværet af celler i det indhegnede SP-område.
BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin, der bruges til at definere den korrekte koncentration af blokker. - Rørene anbringes i en 37 °C inkubator, og de inkuberes i 60 minutter, og rørene rystes hvert 10.
BEMÆRK: Rysterør er vigtige for farvning, fordi det sikrer fuldstændig kontakt mellem cellerne og farvestoffet for bedre farvningsresultater. - Efter inkubationen centrifugeres cellerne ved 200 x g, 4 °C i 5 min. og suger supernatanten forsigtigt, fordi cellerne danner meget løse og ustabile pellets.
- Resuspend celler af hvert rør i 1 mL iskold PBS suppleret med 2% FBS og pipette cellerne op og ned 3-5x til at blande grundigt. Der tilsættes 1 μL på 1 mg/mL propidium jod (PI) til suspensionen af hvert rør for at identificere døde celler.
BEMÆRK: Alle procedurer i dette trin skal udføres ved 4 °C for at hæmme efflux af Hoechst 33342 fra tumorcellerne. Rørene bør beskyttes mod direkte udsættelse for lys.
3. Analyse efter flowcytometri
BEMÆRK: Brugsanvisning af flowcytometersoftwaren (se Materialeoversigten)er beskrevet i dette afsnit og supplerende figur 1-10.
- Klik på knappen MAPPE i flowcytometersoftwaren. Klik på knappen Eksperiment, og klik derefter på Nyt eksperiment (Supplerende figur 1A,B).
- Klik på knappen OK. "Experiment_001" vises under mappen (supplerende figur 2A,B).
- Klik på knappen Experiment_001 for at ændre mappenavnet til et bestemt navn (f.eks. "20191118-SP"). Klik på Enter. Det nye navn ("20191118-SP") vises under MAPPE (Supplerende figur 3A,B).
- Klik på knappen Nyt eksemplar for at føje et eksemplar til den nye eksperimentmappe ("20191118-SP"). Klik på knappen Nyt rør for at føje et rør til prøven. Klik på knappen Pilespids (Supplerende figur 4A-C).
- Klik på knappen Parametre, og konfigurer parametrene for flowcytometeret(Supplerende figur 5).
- Brug et 610 nm dichroic spejl short-pass (DMSP) til at adskille emissionsbølgelængderne. Brug et 450/20 nm BP-filter til at indsamle den blå fluorescens og en 675 nm EFLP til at indsamle den røde fluorescens.
BEMÆRK: Hoechst 33342 er begejstret med en UV-laser ved 355 nm og PI er begejstret på 488 nm.
- Brug et 610 nm dichroic spejl short-pass (DMSP) til at adskille emissionsbølgelængderne. Brug et 450/20 nm BP-filter til at indsamle den blå fluorescens og en 675 nm EFLP til at indsamle den røde fluorescens.
- Kør celleprøverne på flowcytometeret.
BEMÆRK: SP-celler kan sorteres efter fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) under sterile forhold. Der skal indsamles i alt 100.000-500.000 celler til opfølgningseksperimenter.- Kør celler farves med Hoechst 33342 på flowcytometeret.
- Placer rør, der indeholder celler farves med Hoechst 33342 på cytometeret.
- Klik på knappen Dot Plot for at få vist prik-afbildningen, klik derefter på X-aksen, og angiv den til "FSC-A". Klik på Y-aksen, og angiv den til "PI-A". Vis punktdiagrammen for fremskudt punktpulsområde (FSC-A, X-akse indstillet til lineær tilstand) i forhold til PI-fluorescensen (Y-akse indstillet til logaritmisk skala). Juster spændingerne for at vise de levende celler i højre side og de ikke-levende celler, som er farvestrålende med PI, i øverste venstre hjørne. Derefter etablere en polygonport for at udelukke døde celler og cellerester (Figur 1A) ved at klikke på polygonportknappen for at åbne P1-delsættet, også kendt som FSC-A, PI-A-undersæt (Supplerende figur 6A,B).
- Klik på knappen Dot Plot for at få vist prik-afbildningen, klik på X-aksen, og angiv den til "FSC-A". Klik på Y-aksen, og angiv den til "FSC-W". Vis prik-afbildningen af FSC-A (X-akse) i forhold til fremadgående punktpulsbredde (FSC-W, Y-akse). Højreklik på prikplottet, og klik på knappen P1 under knappen Vis populationer. Klik på knappen Rektangulær port for at oprette en rektangulær port for at åbne P2-delsættet (også kaldet FSC-A, FSC-W-undersæt). Dette vil udelukke celler med store mængder(supplerende figur 7A-C og figur 1A).
- Klik på knappen Dot Plot for at få vist prikplottet, klik på X-aksen, og angiv den til "SSC-A". Klik på Y-aksen, og angiv den til "SSC-W". Vis punktdiagram over sideopstødpulsområdet (SSC-A, X-akse) i forhold til sidespredningspulsbredden (SSC-W, Y-aksen). Højreklik på prikplottet, og klik på knappen P2 under knappen Vis populationer. Klik derefter på knappen Rektangulær port for at oprette en rektangulær port for at åbne P3-delsættet (også kaldet SSC-A, SSC-W-undersæt). Dette vil få en cellepopulation med ensartet granularitet(supplerende figur 8A-C og figur 1A).
- Klik på knappen Dot Plot for at få vist prikplottet, klik på X-aksen, og angiv den til "Hoechst Red-A". Klik på Y-aksen, og sæt den til "Hoechst Blue-A". Vis prikplottet for Hoechst Red-A (X-akse) versus Hoechst Blue-A (Y-akse). Højreklik på prikplottet, og klik på knappen P3 under knappen Vis populationer. Klik på polygonportknappen for at oprette en polygonport for at åbne P4-delsættet (også kendt som Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delsæt). Højreklik på prikplottet, klik på knappen Vis populationshierarki for at få vist populationshierarkiet.
BEMÆRK: Prikplottet vil vise tre forskellige populationer: 1) en G0-G1-fasepopulation nær midten af grafen; 2) en S-G2/M fasepopulation nær øverste højre hjørne; 3) SP. SP undersøges derefter nærmere(supplerende figur 9A-D og figur 1A). Hvis prikplottet hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A ikke viser en SP-profil svarende til den, der er vist i figur 1A, skal spændingerne justeres, indtil en lignende profil er set. I mellemtiden justere alle ovenstående porte i overensstemmelse hermed. - Når du har bestemt gateområdet for SP-cellerne, skal du klikke på Hent data for at indsamle hændelser på 20.000-100.000 fra hver prøve for at analysere procentdelen afSP-celler ( Supplerende figur 10).
- Kør Hoechst 33342-farvede celler behandlet med blokker på flowcytometeret.
- Placer rør, der indeholder blokker på cytometeret, og kør celler ved hjælp af de samme spændinger og porte for yderligere at kontrollere, om spændingerne og portene er valgt korrekt.
BEMÆRK: Sammenlignet med Hoechst 33342 farvning alene, kun en meget lille del af cellerne, hvis nogen, bør forekomme i gated område af SP (Figur 1B). - Indsaml 20.000-100.000 hændelser fra hver prøve for at analysere procentdelen af SP-celler.
- Placer rør, der indeholder blokker på cytometeret, og kør celler ved hjælp af de samme spændinger og porte for yderligere at kontrollere, om spændingerne og portene er valgt korrekt.
- Kør celler farves med Hoechst 33342 på flowcytometeret.
4. Dataanalyse
BEMÆRK: Brugsanvisning af flowcytometrianalysesoftwaren (se Materialeoversigten)er beskrevet i dette afsnit og supplerende figur 11-16.
- Kopier filerne i FCS-format til en computer, åbn flowcytometryanalysesoftwaren, og træk en eksempelfil til softwaren (Supplementary Figure 11A,B).
- Gate celler og få den procentdel af SP celler.
- Dobbeltklik på denne eksempelfil, klik på X-aksen, og angiv den til "FSC-A". Klik på Y-aksen, og angiv den til "PI-A". Opret derefter en polygonport, og klik på knappen OK for at hente undersættet FSC-A, PI-A (Supplementary Figure 12A-E).
- Dobbeltklik på undersætfilen FSC-A, PI-A, klik på X-aksen, og angiv den til "FSC-A". Klik på Y-aksen, og angiv den til "FSC-W". Opret derefter en rektangulær port, og klik på knappen OK for at hente undersættet FSC-A, FSC-W (Supplementary Figure 13A-E).
- Dobbeltklik på undersætfilen FSC-A, FSC-W, klik på X-aksen, og angiv den til "SSC-A". Klik på Y-aksen, og angiv den til "SSC-W". Opret derefter en rektangulær port, og klik på knappen OK for at hente undersættet SSC-A, SSC-W (Supplementary Figure 14A-E).
- Dobbeltklik på SSC-A-, SSC-W-undersætfilen, klik på X-aksen, og angiv den til "Hoechst Red-A". Klik på Y-aksen, og sæt den til "Hoechst Blue-A". Opret derefter en polygonport, og klik på knappen OK for at hente undersættet Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A (Supplementary Figure 15A-E).
- Åbn Layouteditor ved at klikke på knappen Åbn layouteditor. Træk SSC-A-, SSC-W-undersætfilen til Layouteditor, og klik derefter på knappen Klik for at gemme layoutvinduet for at gemme billedresultaterne ( Supplerende figur16A-C).
- Gem arbejdsområdet for at bevare gatingoplysningerne, når du lukker softwaren.
- Udfør t-testanalyser med statistisk analysesoftware for at sammenligne forskellen mellem to grupper. En værdi på P < 0,05 blev defineret som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der blev udført fire eksperimentelle SP-analyser efter denne metode. I den første opdagede vi andelen af SP-celler i MDA-MB-231, som er en tredobbelt negativ human brystkræftcellelinje under normale forhold. Efter celletælling blev Hoechst 33342 tilsat et rør, der indeholdt 1 x 106 celler, til en endelig koncentration på 3 μg/mL. Reserpine og Hoechst 33342 blev tilsat et andet rør til de endelige koncentrationer på henholdsvis 40 μM og 3 μg/mL. PI blev tilføjet til begge rør. Prikplottet af FSC-A (X-akse) versus PI-A (Y-akse) viste tre populationer: 1) en PI-positiv cellepopulation, som repræsenterede de døde celler; 2) cellerester; og 3) hovedpopulationen var PI-negative celler, som blev underkastet yderligere analyse (figur 1A,B). En enkeltcellet population, der er gateret fra prikplottet FSC-A (X-akse) versus FSC-W (Y-akse) og prikplottet af SSC-A (X-akse) versus SSC-W (Y-akse), blev brugt til at analysere andelen af SP-celler (Figur 1A,B). SP-cellerne blev gated fra prikplottet af Hoechst Red-A (X-akse) versus Hoechst Blue-A (Y-akse), og deres procentdel var omkring 0,9% i MDA-MB-231 celler (Figur 1A). Reserpine reducerede imidlertid i høj grad andelen af SP-celler (Figur 1B), hvilket understøtter, at portmaleriet til SP er korrekt.
Det andet eksperiment var at bestemme den passende farvning koncentration af Hoechst 33342 i MDA-MB-435 celler. Efter celletælling blev Hoechst 33342 føjet til 1 x 106 celler, som blev suspenderet i 1 mL PBS suppleret med 2% FBS, til forskellige koncentrationsgradienter, herunder 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 og 4 μg/mL. Som vist i figur 2A, hvor koncentrationen af Hoechst 33342 var for lav (dvs. 0,5, 1, 1,5 μg/mL), var det svært at skelne SP-celler fra andre cellepopulationer, fordi mange celler var i svagt farvede tilstand. Da koncentrationen af Hoechst 33342 var for høj (dvs. 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL), faldt andelen af SP-celler, indtil den forsvandt. Således var 2 μg/mL Hoechst 33342 den bedste koncentration til SP-analyse i MDA-MB-435 celler. For at bestemme den korrekte blokker for denne cellelinje blev Hoechst 33342 og en blokker (Verapamil eller Reserpine) desuden føjet til 1 x 106 celler, som blev suspenderet i 1 mL PBS suppleret med 2% FBS, til endelige koncentrationer på henholdsvis 2 μg/mL og 40 μM. Som det fremgår af figur 2B, udviste ca. 0,4% af cellerne farvestoffet efter Verapamil-behandlingen. Efter Reserpine-behandlingen faldt forholdet imidlertid til ca. 0,1 % (figur 2C). Fra dette eksperiment blev Reserpine betragtet som en mere passende blokering for denne cellelinje.
I det tredje eksempel blev A549-celler (humane lunge adenocarcinomceller) forbehandlet med STAT3-aktivator-Colivelin20 (100 nM) i 48 timer (h). STAT3-signalvejen er vigtig for at fremme snestcellernes stængelegenskaber21. Som vist i figur 3steg andelen af SP-celler ved Colivelin-stimulering.
I det sidste eksempel blev T47D-celler (humane brystkræftceller) forbehandlet med 0,1 μM FRA1-hæmmer-SKLB816 (også kaldet 13an) i 48 timerog 22. FRA1 er en rapporteret gatekeeper af epitel-mesenchymal overgang (EMT) og involveret i regulering af tumor stængel23. Som vist i figur 4faldt andelen af SP-celler på grund af behandlingen af FRA1-hæmmer.
Figur 1: Gating strategi MDA-MB-231 celler i SP analyse. (A) Gating-strategi for MDA-MB-231-celler, som var farvet med Hoechst 33342 (3 μg/mL) og propidium-jod (PI, 1 μg/mL). (B) Gating-strategi for MDA-MB-231-celler, som blev behandlet med Reserpine (40 μM) og farvet med Hoechst 33342 (3 μg/mL) og PI (1 μg/mL). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Optimering af Hoechst 33342 koncentration og udvælgelse af blokker i MDA-MB-435 celler. (A) SP-analyseresultaterne af MDA-MB-435-celler, som var plettet med Hoechst 33342 (Hoechst) ved forskellige koncentrationsgradienter (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL) sammen med PI (1 μg/mL). (B) SP-analyseresultatet af MDA-MB-435-celler, som blev behandlet med Verapamil (40 μM) og farvet med Hoechst 33342 (2 μg/mL) og PI (1 μg/mL). (C) SP-analyseresultatet af MDA-MB-435-celler, som blev behandlet med Reserpine (40 μM) og farvet med Hoechst 33342 (2 μg/mL) og PI (1 μg/mL). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Andelen af SP-celler blev forstærket af STAT3-aktivator i A549-celler. (A)SP-analyseresultaterne af A549-celler forbehandlet med STAT3-aktivator-Colivelin (100 nM) eller dets køretøjskontrol (Ctrl)-H2O i 48 timer. A549 celler behandlet med Reserpine (45 μM) blev anvendt som blokeringskontrol. A549-celler blev plettet med Hoechst 33342 (7 μg/mL) og PI (1 μg/mL). (B) De statistiske resultater af andelen af SP-celler i A549-celler behandlet med Colivelin (100 nM) og dets køretøjskontrol. Data præsenteres som middelværdien + standardfejlen i middelværdien (SEM), n = 3 for hver gruppe. "*" angiver P < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Andelen af SP-celler blev hæmmet af FRA1-hæmmer i T47D-celler. (A) SP-analyseresultaterne af T47D-celler forbehandlet med SKLB816 (0,1 μM) eller dets køretøjskontrol (Ctrl)-DMSO i 48 timer. T47D-celler behandlet med Reserpine (40 μM) blev anvendt som blokeringskontrol. T47D-celler blev plettet med Hoechst 33342 (8 μg/mL) og PI (1 μg/mL). (B) De statistiske resultater af andelen af SP-celler i T47D-celler behandlet med SKLB816 (0,1 μM) og dets køretøjskontrol. Data præsenteres som middelværdi + SEM, n = 3 for hver gruppe. "*" angiver P < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.1. (A) Klik på knappen MAPPE. (B) Klik på knappen Eksperiment, og klik derefter på knappen Nyt eksperiment. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.2. (A) Klik på knappen OK. (B) Experiment_001 dukker op under MAPPE. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 3: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.3. (A) Klik på knappen Experiment_001 for at ændre navnet på Experiment_001 til et bestemt navn (f.eks. "20191118-SP"). (B) Klik på knappen Enter. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 4: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.4. (A)Klik på knappen Nyt eksemplar. (B) Klik på knappen Nyt rør. (C) Klik på knappen Pilespids. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 5: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.5. (A) Klik på knappen Parametre for at konfigurere parametrene. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 6: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.6.1.2. (A) Klik på knappen Dot Plot for at få vist prik-afbildningen, klik på X-aksen, og angiv den til "FSC-A". Klik på Y-aksen, og indstil den til "PI-A". (B) Klik på knappen Polygonport for at oprette en polygonport for at åbne P1-delsættet (også kaldet FSC-A, PI-A-undersæt). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 7: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.6.1.3. (A) Klik på knappen Dot Plot for at få vist prikplottet, klik på X-aksen, og angiv den til "FSC-A"; klik på Y-aksen, og angiv den til "FSC-W". (B) Højreklik på prikplottet, og klik på knappen P1 under knappen Vis populationer. (C) Klik på knappen Rektangulær port for at oprette en rektangulær port for at åbne P2-delsættet (også kaldet undersæt af FSC-A, FSC-W). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 8: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.6.1.4. (A) Klik på knappen Dot Plot for at få vist prikplottet, klik på X-aksen, og angiv den til "SSC-A"; Klik på Y-aksen, og angiv den til "SSC-W". (B) Højreklik på prikplottet, og klik på P2-knappen under knappen Vis populationer . (C) Klik på knappen Rektangulær port for at oprette en rektangulær port for at åbne P3-undersættet (også kaldet SSC-A, SSC-W-undersæt). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 9: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.6.1.5. (A) Klik på knappen Dot Plot for at få vist prikplottet, klik på X-aksen, og angiv den til "Hoechst Red-A"; Klik på Y-aksen, og sæt den til "Hoechst Blue-A". (B) Højreklik på prikplottet, og klik på knappen P3 under knappen Vis populationer. (C) Klik på polygonportknappen for at oprette en polygonport for at åbne P4-delsættet (også kendt som Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delmængden). (D) Højreklik på prikplottet, og klik derefter på knappen Vis populationshierarki for at få vist populationshierarkiet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 10: Instruktioner til flowcytometersoftwaretrin 3.6.1.6. (A) Klik på knappen Hent data, og indsaml derefter 20.000-100.000 hændelser fra hver prøve. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 11: Instruktioner til flowcytometrianalysesoftwaretrin 4.1. (A) Åbn flowcytometry-analysesoftwaren, og træk en eksempelfil ind i softwaren. (B) Eksempelfilen importeres. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 12: Instruktioner til flowcytometrianalysesoftwaretrin 4.2.1. (A) Dobbeltklik på denne eksempelfil. Klik på Y-aksen, og angiv den til "PI-A". (C) Klik på knappen Opret en polygonport for at oprette en polygonport. (D) Klik på knappen OK for at hente undersættet FSC-A, PI-A. (E)Undersættet FSC-A, PI-A er fremstillet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 13: Instruktioner til flowcytometrianalysesoftwaretrin 4.2.2. (A) Dobbeltklik på undersætfilen FSC-A og PI-A. (B) Klik på X-aksen, og angiv den til "FSC-A". Klik på Y-aksen, og angiv den til "FSC-W". (C) Klik på knappen Opret en rektangulær port for at oprette en rektangulær port. (D) Klik på knappen OK for at hente undersættet FSC-A, FSC-W.
Supplerende figur 14: Instruktioner til flowcytometrianalysesoftwaretrin 4.2.3. (A) Dobbeltklik på undersætfilen FSC-A, FSC-W. (B) Klik på X-aksen, og angiv den til "SSC-A". Klik på Y-aksen, og angiv den til "SSC-W". (C) Klik på knappen Opret en rektangulær port for at oprette en rektangulær port. (D) Klik på knappen OK for at hente undersættet SSC-A, SSC-W. (E)SSC-A, SSC-W delmængden er opnået. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 15: Instruktioner til flowcytometrianalysesoftwaretrin 4.2.4. (A) Dobbeltklik på SSC-A-, SSC-W-undersætfilen. Klik på Y-aksen, og sæt den til "Hoechst Blue-A". (C) Klik på knappen Opret en polygonport for at oprette en polygonport. (D) Klik på knappen OK for at hente undersættet Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. (E)Undersættet Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A er fremstillet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 16: Instruktioner til flowcytometrianalysesoftwaretrin 4.2.5. (A) Klik på knappen Åbn layouteditor for at åbne layouteditoren. (b) Træk eksempelfilen til SSC-A, SSC-W-undersæt til Layouteditor. (C) Klik på knappen Klik for at gemme layoutvinduet i filen for at gemme billedresultaterne. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere vigtige punkter at huske på for SP assay. Den første er valget af en korrekt blokker, såsom Verapamil eller Reserpine, for hver cellelinje, fordi SP-cellernes "gate" placering bestemmes i henhold til den position, hvor et stort antal SP-celler forsvinder efter tilføjelsen af blokkeren. For MDA-MB-231 cellelinjen fungerer Reserpine godt. For andre cellelinjer kan forskellige blokkere dog fungere bedre.
Den anden er koncentrationen af Hoechst 33342. Procentdelen af SP-celler steg, da farvningskoncentrationen af Hoechst 33342 faldt, som de repræsentative data viste. Dette fænomen kan forklares ved farvestofoptagelse kinetik24. Ændringer i farvestofkoncentrationen påvirker berigelsen af Hoechst 33342 i celler. Derfor er Hoechst 33342 farvningskoncentration tæt forbundet med resultaterne af SP-analysen. Desuden varierer optagelse og udvisning af Hoechst 33342 mellem celletyper. Korrekt koncentrationer af Hoechst 33342 skal således undersøges for forskellige cellelinjer inden SP-analysen.
Den tredje er en god variationskoefficient (CV) for flowcytometeret, som også er kritisk for SP-analysen25. UV-lasereffekt er et vigtigt kriterium for bedre CV'er12. Denne protokol bruger et cytometer (se Materialetabel) til at udføre SP-analysen. I dette cuvette-flow-celle instrument brugte vi UV-laseren med en effekt på 15 mW for at få de bedste CV'er. Generelt giver en relativt høj UV-lasereffekt de optimale CV'er. For eksempel giver 50-100 mW det optimale Hoechst-signal på jet-in-air-instrumenter12. Nogle lasere giver lavere UV-effekt, hvilket kan reducere CV'er. I disse tilfælde er god laserjustering kritisk.
Den sidste er indflydelsen fra andre faktorer under eksperimentet. Cellestatus, temperatur, farvningstid, drift af strømningscytometri og andre faktorer kan også påvirke SP-analysens andel og kvalitet. For eksempel vil ændringer i celle levedygtighed under forberedelsen af celle suspensioner påvirke forholdet mellem SP celler. Derfor skal de bedste eksperimentelle forhold undersøges, før du udfører SP-analyse. I betragtning af ovenstående faktorer kan SP-forholdet for den samme cellelinje målt af forskellige laboratorier være anderledes. Andelen af MDA-MB-231-celler og A549-celler blev f.eks.
Forskere kan ændre denne analyse til forskellige applikationer, såsom undersøgelse af andre tumor cellelinjer, eller primære patient-afledte tumorceller. Hvis protokollen ikke fungerer godt for de celler, der testes, kan forskerne bruge MDA-MB-231 celler som den positive kontrol og plette cellerne efter de givne specifikationer. Fordi denne protokol er meget følsom over for koncentrationen af Hoechst 33342, farvning temperatur og tid osv., forskerne bør kontrollere alle disse betingelser nøje. Procentdelen af SP i mange typer af humane tumorcellelinjer er relativt lav (~ 0%-37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Hvis der observeres en for høj eller lav procentdel af SP, kan det skyldes uhensigtsmæssige koncentrationer af Hoechst 33342 eller blocker, der anvendes. Hvis problemet synes at være relateret til flowcytometeret, bør der opnås teknisk support.
Selvom brugen af SP til at analysere og adskille CSC'er er yderst effektiv, har den stadig visse begrænsninger. Den første er dens høje følsomhed over for farvningsbetingelser12. Mange faktorer, såsom koncentrationen af Hoechst 33342, cellestatus, temperatur, farvningstid, drift af flowcytometry og klodsvalg kan påvirke kvaliteten af SP-analysen. Den anden er den cytotoksiske effekt af Hoechst 33342. Hoechst 33342 er et DNA-bindende farvestof, men er giftigt for celler, når det når høje koncentrationer og dermed reducerer celleaktivitet37.
Sammenfattende er SP-analyse en af de mest anvendte metoder i de senere år til at identificere og rense CSC'er i tumorcellelinjer. Selv om metoden har visse begrænsninger, er den i mangel af specifikke CSC'ers overflademarkører stadig en metode til bekvem, hurtig og omkostningseffektiv berigelse af CSC'er. Denne metode er gavnlig til undersøgelse af CSC'ernes biologiske funktioner og til identifikation af specifikke overflademarkører. Desuden, ved at opdage virkningerne af forskellige signaler på SP forholdet mellem tumorceller, kan det give fingerpeg om den lovgivningsmæssige virkning af disse signal veje på CSC funktioner, og lette opdagelsen af nye mekanismer, som i sidste ende kan guide den målrettede behandling af tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 og 81972787; Naturvidenskab Stiftelsen af Tianjin City (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundforskningsfonde for de centrale universiteter, Nankai-universitetet 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
