Summary
Een handige, snelle en kosteneffectieve methode om het aandeel zijpopulatiecellen in solide tumorcellijnen te meten, wordt gepresenteerd.
Abstract
Kankerstamcellen (CSC's) zijn een belangrijke oorzaak van tumorgroei, metastase en recidief. Isolatie en identificatie van CSC's zijn van groot belang voor tumoronderzoek. Momenteel worden verschillende technieken gebruikt voor de identificatie en zuivering van CSC's uit tumorweefsels en tumorcellijnen. Scheiding en analyse van zijpopulatiecellen (SP) zijn twee van de meest gebruikte methoden. De methoden zijn gebaseerd op het vermogen van CSC's om fluorescerende kleurstoffen snel te verdrijven, zoals Hoechst 33342. De efflux van de kleurstof wordt geassocieerd met de ATP-binding cassette (ABC) transporters en kan worden geremd door ABC transporter remmers. Methoden voor het kleuren van gekweekte tumorcellen met Hoechst 33342 en het analyseren van het aandeel van hun SP-cellen door flowcytometrie worden beschreven. Deze test is handig, snel en kosteneffectief. Gegevens die in deze test worden gegenereerd, kunnen bijdragen aan een beter begrip van het effect van genen of andere extracellulaire en intracellulaire signalen op de stameigenschappen van tumorcellen.
Introduction
Kankerstamcellen (CSC's) zijn deelverzamelingen van cellen met zelfvernieuwingsvermogen en multipel differentiatiepotentieel, die een vitale rol spelen bij tumorgroei, metastase en recidief1,2. Momenteel zijn CSC's geïdentificeerd om te bestaan in een verscheidenheid van kwaadaardige tumoren, met inbegrip van long-, hersen-, alvleesklier-, prostaat-, borst- en leverkankers3,4,5,6,7,8,9. Identificatie van CSC's in deze tumoren is voornamelijk gebaseerd op de aanwezigheid van oppervlaktemarkereiwitten, zoals hoge en/of lage expressie van CD44, CD24, CD133 en Sca-19,10, maar een unieke marker die CSC's van niet-CSC's kan onderscheiden, is tot nu toe niet gerapporteerd. Momenteel worden verschillende technieken gebruikt om CSC's in tumorweefsel of tumorcellijnen te identificeren en te zuiveren. Deze technieken zijn ontworpen op basis van de specifieke eigenschappen van CSC's. Onder hen, assays en sortering van zijpopulatie (SP) cellen zijn twee van de meest gebruikte methoden.
SP-cellen werden oorspronkelijk ontdekt door Goodell et al.11, toen ze hematopoëtische stamcellen in beenmergcellen van muizen kenmerkten. Toen de beenmergcellen van de muis werden gelabeld met de fluorescerende kleurstof Hoechst 33342, verscheen een kleine groep Hoechst 33342 zwak bevlekte cellen in de tweedimensionale puntplot van een flowcytometrietest. Hoechst 33342 is een DNA-bindende kleurstof en heeft ten minste twee bindingsmodi die leiden tot verschillende spectrale kenmerken. Bij het bekijken van fluorescentie-emissie op twee golflengten tegelijkertijd, kunnen meerdere populaties worden onthuld12. In hun test werd de Hoechst 33342 opgewekt bij 350 nm en werd de fluorescentie gemeten met behulp van het 450/20 nm band-pass (BP) filter en 675 nm edge filter long-pass (EFLP)11. Vergeleken met de hele populatie beenmergcellen werd deze groep cellen verrijkt met hematopoëtische stamcellen genaamd SP-cellen11. SP-cellen kunnen Hoechst 33342 snel verdrijven. De efflux van deze kleurstof is gerelateerd aan ATP-binding cassette (ABC) transporters13, die kunnen worden geremd door sommige middelen zoals Fumitremorgin C14, Verapamil en Reserpine15,16. Daarna werden verschillende verhoudingen SP-cellen gedetecteerd in een verscheidenheid aan weefsels, organen, tumorweefsels en tumorcellijnen17,18,19. Deze SP-cellen hebben veel kenmerken van stamcellen17,19.
Dit manuscript beschrijft Hoechst 33342 etikettering en kleuring van gekweekte tumorcellen en de analyse van SP-cellen door flowcytometrie. Bovendien wordt optimalisatie van de Concentratie Hoechst 33342 en de juiste blokkerselectie voor een specifieke tumorcellijn met behulp van deze aanpak getoond. Ten slotte worden de effecten van stemheidsbevordering of remmingssignalen op het aandeel SP in tumorcellen aangetoond. De experimentele voorbeelden tonen aan dat analyse van SP kan worden gebruikt om de effecten van verschillende signalen te onderzoeken, zoals genexpressie, kleine remmers, activatoren, cytokinen en chemokinen, op tumorstamheid. In vergelijking met andere methoden voor isolatie en zuivering van CSC's, zoals het sorteren van CD44+/ CD24- populatie, aldehydedehydrogenase (ALDH) analyse en tumorbolvormingstesten, is deze methode gemakkelijker te manipuleren en is het kosteneffectief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celvoorbereiding
- Celvertering en neutralisatie
- Zaadtumorcellen (zoals MDA-MB-231 cellen) in een 6 putplaat, en kweek ze in een incubator van 37 °C geleverd met 5% CO2.
- Oogst cellen wanneer hun dichtheid ongeveer 90% bereikt. Aspireer het kweekmedium grondig en was de cellen 2x met 3 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: Om de effecten van signaalwegremmers (bijv. FRA1-remmer) of activators (bijv. STAT3-activator) op de stameigenschappen van tumorcellen te onderzoeken, worden tumorcellen in een 6-putplaat gezaaid en gedurende een bepaalde tijd vóór de oogst voorbehandeld met remmers of activatoren. - Voeg 500 μL 0,25% trypsine-EDTA toe aan elke put van de 6-putplaat, plaats de plaat gedurende 1-3 minuten (min) in een incubator op 37 °C en tik voorzichtig op de plaat om de cellen los te maken.
OPMERKING: Langdurige spijsvertering heeft invloed op het SP-profiel als gevolg van veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen. - Voeg 3 ml PBS aangevuld met 2% foetale runderserum (FBS) toe aan elke put van de 6-putplaat om de spijsvertering te beëindigen en pipetteer de cellen voorzichtig 3-5x op en neer om de celklonters te verspreiden.
- Voeg 0,5 ml celsuspensie toe aan een put van een nieuwe 6-putplaat en onderzoek deze onder een microscoop. Als celklonters worden waargenomen, geeft u de celsuspensie door een 70 μM celzeef.
OPMERKING: Dit is een optionele stap. - Breng de cellen over in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer cellen op 200 x g gedurende 5 min naar pelletcellen. Verwijder het supernatant en resuspend ze in 3 ml PBS aangevuld met 2% FBS. Pipetteer de cellen 3-5x op en neer om grondig te mengen.
- Celtellingen
- Voeg 50 μL van de celsuspensie toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng deze met een trypanblauwe oplossing van 50 μL. Pipet 10 μL van het mengsel om het aantal levende cellen te tellen met behulp van een standaardmethode, zoals een hemocytometer.
- Verdun de cellen in PBS aangevuld met 2% FBS tot een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml. Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan een polystyreenronde reageerbuis met een afgeronde bodem van 5 ml en bereid twee monsterbuizen voor.
2. Celbeitsen met Hoechst 33342
- Voeg Hoechst 33342 toe aan één buis om een geschikte eindconcentratie te bereiken.
OPMERKING: De juiste concentratie Van Hoechst 33342 is bijvoorbeeld 3 μg/ml voor MDA-MB-231 cellen. - Voeg een blokker (bijv. Fumitremorgin C, Verapamil of Reserpine) toe aan een andere buis tot een geschikte eindconcentratie en incubeer de buis gedurende 30 minuten bij 37 °C voordat u dezelfde concentratie Hoechst 33342 toevoegt als beschreven in stap 2.1.
OPMERKING: Voor MDA-MB-231 cellen is de juiste blokker Reserpine (40 μM). Reserpine wordt gebruikt als een blokkeringsbesturingselement om de afwezigheid van cellen in het gated SP-gebied te verifiëren. - Bereid verschillende buizen met cellen voor en voeg Hoechst 33342 toe aan verschillende concentratiegradiënten. Kies na een flowcytometrietest de juiste concentratie op basis van het profiel en de verhouding SP.
OPMERKING: Dit is een optionele stap die wordt gebruikt om de juiste concentratie van Hoechst 33342 te definiëren. - Bereid verschillende buizen met cellen voor, voeg de blokker toe aan verschillende concentratiegradiënten, incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij 37 °C en voeg vervolgens Hoechst 33342 toe aan een geschikte concentratie. Kies na de flowcytometrietest de juiste concentratie op basis van de afwezigheid van cellen in het gated SP-gebied.
OPMERKING: Dit is een optionele stap die wordt gebruikt om de juiste concentratie blokker te definiëren. - Plaats de buizen in een incubator van 37 °C en incubeer ze gedurende 60 minuten en schud de buizen elke 10 minuten.
OPMERKING: Het grondig schudden van buizen is belangrijk voor kleuring, omdat het zorgt voor volledig contact tussen de cellen en de kleurstof voor betere kleurresultaten. - Centrifugeer na de incubatie de cellen op 200 x g, 4 °C gedurende 5 minuten en aspireer het supernatant zorgvuldig, omdat de cellen zeer losse en onstabiele pellets vormen.
- Resuspend cellen van elke buis in 1 ml ijskoud PBS aangevuld met 2% FBS en pipet de cellen op en neer 3-5x om grondig te mengen. Voeg 1 μL propidiumjodide (PI) van 1 μL toe aan de suspensie van elke buis om dode cellen te identificeren.
OPMERKING: Alle procedures in deze stap moeten worden uitgevoerd bij 4 °C om de efflux van Hoechst 33342 uit de tumorcellen te remmen. De buizen moeten worden beschermd tegen directe blootstelling aan licht.
3. Analyse per flow cytometrie
OPMERKING: Instructies voor het gebruik van de flowcytometersoftware (zie materiaaltabel) worden in deze sectie beschreven en aanvullende figuren 1–10.
- Klik in de flowcytometersoftware op de mapknop. Klik op de knop Experiment en klik vervolgens op Nieuw experiment ( aanvullendefiguur 1A,B).
- Klik op de knop OK. "Experiment_001" verschijnt onder de MAP (Aanvullende figuur 2A,B).
- Klik op de knop Experiment_001 om de mapnaam te wijzigen in een specifieke naam (bijvoorbeeld "20191118-SP"). Klik op Enter. De nieuwe naam ("20191118-SP") verschijnt onder FOLDER (Aanvullende figuur 3A,B).
- Klik op de knop Nieuw exemplaar om een exemplaar toe te voegen aan de nieuwe experimentmap ("20191118-SP"). Klik op de knop Nieuwe buis om een buis aan het monster toe te voegen. Klik op de pijlpuntknop (aanvullende figuur 4A-C).
- Klik op de knop Parameters en stel de parameters van de flowcytometer in (Aanvullende figuur 5).
- Gebruik een 610 nm dichroïsche spiegel short-pass (DMSP) om de emissiegolflengten te scheiden. Gebruik een 450/20 nm BP-filter om de blauwe fluorescentie te verzamelen en een EFLP van 675 nm om de rode fluorescentie te verzamelen.
OPMERKING: Hoechst 33342 is opgewonden met een UV-laser bij 355 nm en PI is opgewonden bij 488 nm.
- Gebruik een 610 nm dichroïsche spiegel short-pass (DMSP) om de emissiegolflengten te scheiden. Gebruik een 450/20 nm BP-filter om de blauwe fluorescentie te verzamelen en een EFLP van 675 nm om de rode fluorescentie te verzamelen.
- Voer de celmonsters uit op de flow cytometer.
OPMERKING: SP-cellen kunnen onder steriele omstandigheden worden gesorteerd door fluorescentiegeactiveerde celsortering (FACS). In totaal moeten 100.000-500.000 cellen worden verzameld voor de vervolgexperimenten.- Run cellen bevlekt met Hoechst 33342 op de flow cytometer.
- Plaats buizen met cellen bevlekt met Hoechst 33342 op de cytometer.
- Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik vervolgens op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "PI-A". Geef de puntplot weer van het voorwaartse spreidingspulsgebied (FSC-A, X-as ingesteld op lineaire modus) versus de PI-fluorescentie (Y-as ingesteld op logaritmische schaal). Pas de spanningen aan om de levende cellen aan de rechterkant en de niet-levende cellen, die fel gekleurd zijn met PI, in de linkerbovenhoek weer te geven. Stel vervolgens een polygoonpoort in om dode cellen en celresten uit te sluiten (figuur 1A) door op de knop Polygon Gate te klikken om de P1-subset, ook bekend als FSC-A, PI-A-subset ( Aanvullendefiguur 6A, B ) tegaten.
- Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "FSC-W". Geef de puntplot weer van FSC-A (X-as) versus voorwaartse spreidingspulsbreedte (FSC-W, Y-as). Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop P1 onder de knop Populaties weergeven. Klik op de knop Rechthoekige poort om een rechthoekige poort te maken om de P2-subset (ook wel FSC-A, FSC-W-subset genoemd) te gaten. Dit zal cellen met grote volumes uitsluiten (Aanvullende figuur 7A-C en figuur 1A).
- Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "SSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "SSC-W". Geef de puntplot weer van het pulsgebied van de zijverstrooiing (SSC-A, X-as) versus de breedte van de zijverstrooiingspuls (SSC-W, Y-as). Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop P2 onder De populaties weergeven. Klik vervolgens op de knop Rechthoekige poort om een rechthoekige poort te maken om de P3-subset (ook bekend als SSC-A, SSC-W-subset) te gaten. Hierdoor krijgt een celpopulatie met uniforme granulariteit (aanvullende figuur 8A-C en figuur 1A).
- Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "Hoechst Red-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "Hoechst Blue-A". Geef de puntplot weer van Hoechst Red-A (X-as) versus Hoechst Blue-A (Y-as). Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop P3 onder de knop Populaties weergeven. Klik op de knop Polygon Gate om een polygoonpoort te maken om de P4-subset (ook bekend als Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A subset) te gaten. Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop Populatiehiërarchie weergeven om de populatiehiërarchie weer te geven.
OPMERKING: De puntplot toont drie verschillende populaties: 1) een G0-G1-fasepopulatie in de buurt van het midden van de grafiek; 2) een S-G2/M fase populatie in de rechterbovenhoek; 3) de SP. De SP wordt vervolgens voor verdere analyse geheisd (aanvullende figuur 9A-D en figuur 1A). Als de puntplot van Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A geen SP-profiel vertoont dat vergelijkbaar is met dat in figuur 1A,moeten de spanningen worden aangepast totdat een vergelijkbaar profiel wordt gezien. Pas ondertussen alle bovenstaande poorten dienovereenkomstig aan. - Nadat u het poortgebied van de SP-cellen hebt bepaald, klikt u op Gegevens verzamelen om 20.000-100.000 gebeurtenissen uit elk monster te verzamelen om het percentage SP-cellen te analyseren ( Aanvullendefiguur 10).
- Voer de Hoechst 33342-bevlekte cellen uit die zijn behandeld met een blokker op de flowcytometer.
- Plaats buizen met blokker op de cytometer en laat cellen lopen met dezelfde spanningen en poorten om verder te controleren of de spanningen en poorten op de juiste manier zijn geselecteerd.
OPMERKING: In vergelijking met Hoechst 33342 kleuring alleen, zou slechts een zeer klein deel van de cellen, indien aanwezig, moeten verschijnen in het omheinde gebied van de SP (Figuur 1B). - Verzamel 20.000-100.000 gebeurtenissen uit elk monster om het percentage SP-cellen te analyseren.
- Plaats buizen met blokker op de cytometer en laat cellen lopen met dezelfde spanningen en poorten om verder te controleren of de spanningen en poorten op de juiste manier zijn geselecteerd.
- Run cellen bevlekt met Hoechst 33342 op de flow cytometer.
4. Gegevensanalyse
OPMERKING: Instructies voor het gebruik van de flow cytometrie analyse software (zie tabel van materialen) worden beschreven in deze sectie en aanvullende figuren 11–16.
- Kopieer de bestanden in fcs-formaat naar een computer, open de flow cytometrie analyse software en sleep een voorbeeldbestand naar de software (Aanvullende figuur 11A,B).
- Poortcellen en verkrijg het percentage SP-cellen.
- Dubbelklik op dit voorbeeldbestand, klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "PI-A". Maak vervolgens een polygoonpoort en klik op de knop OK om de SUBSET FSC-A, PI-A(Aanvullende figuur 12A-E)te verkrijgen.
- Dubbelklik op het SUBSETBESTAND FSC-A, PI-A, klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "FSC-W". Maak vervolgens een rechthoekige poort en klik op de knop OK om de subset FSC-A, FSC-W te verkrijgen (Aanvullende figuur 13A-E).
- Dubbelklik op het FSC-A, FSC-W subsetbestand, klik op de X-as en stel deze in op "SSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "SSC-W". Maak vervolgens een rechthoekige poort en klik op de knop OK om de subset SSC-A, SSC-W(Aanvullende figuur 14A-E)te verkrijgen.
- Dubbelklik op het subsetbestand SSC-A, SSC-W, klik op de X-as en stel deze in op "Hoechst Red-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "Hoechst Blue-A". Maak vervolgens een polygoonpoort en klik op de knop OK om de subset Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A (Aanvullende figuur 15A-E) te verkrijgen.
- Open de lay-outeditor door op de knop Lay-outeditor openen te klikken. Sleep het SSC-A- en SSC-W-subsetbestand naar layout-editor en klik vervolgens op de knop Klik om lay-outvenster op te slaan in bestand om de afbeeldingsresultaten op te slaan ( Aanvullende figuur16A-C).
- Sla de werkruimte op om de gating-informatie te bewaren bij het sluiten van de software.
- Voer t-testanalyses uit met statistische analysesoftware om het verschil tussen twee groepen te vergelijken. Een waarde van P < 0,05 werd als statistisch significant gedefinieerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens deze methode werden vier experimentele SP-analyses uitgevoerd. In de eerste ontdekten we het aandeel SP-cellen in MDA-MB-231, een drievoudige negatieve menselijke borstkankercellijn, onder normale omstandigheden. Na het tellen van de cellen werd Hoechst 33342 toegevoegd aan één buis met 1 x 106 cellen tot een eindconcentratie van 3 μg/ml. Reserpine en Hoechst 33342 werden aan een andere buis toegevoegd aan eindconcentraties van respectievelijk 40 μM en 3 μg/ml. PI werd aan beide buizen toegevoegd. De puntplot van FSC-A (X-as) versus PI-A (Y-as) toonde drie populaties: 1) een PI-positieve celpopulatie, die de dode cellen vertegenwoordigde; 2) celresten; en 3) de belangrijkste populatie waren PI-negatieve cellen, die verder werden geanalyseerd (figuur 1A,B). Een eencellige populatie die is afgeleid van de puntplot van FSC-A (X-as) versus FSC-W (Y-as) en de puntplot van SSC-A (X-as) versus SSC-W (Y-as) werd gebruikt om het aandeel SP-cellen te analyseren (figuur 1A,B). De SP-cellen werden afgesloten van de puntplot van Hoechst Red-A (X-as) versus Hoechst Blue-A (Y-as), en hun percentage was ongeveer 0,9% in MDA-MB-231 cellen (Figuur 1A). Reserpine verminderde echter sterk het aandeel SP-cellen(figuur 1B),wat ondersteunt dat het poortschilderen voor SP correct is.
Het tweede experiment was het bepalen van de geschikte kleuringsconcentratie van Hoechst 33342 in MDA-MB-435 cellen. Na het tellen van de cellen werd Hoechst 33342 toegevoegd aan 1 x10 6 cellen, die werden gesuspendeerd in 1 ml PBS aangevuld met 2% FBS, aan verschillende concentratiegradiënten, waaronder 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 en 4 μg/ml. Zoals blijkt uit figuur 2A, toen de concentratie van Hoechst 33342 te laag was (d.w.z. 0,5, 1, 1,5 μg/ml), was het moeilijk om SP-cellen te onderscheiden van andere celpopulaties, omdat veel cellen zich in een zwak bevlekte toestand bevond. Toen de concentratie van Hoechst 33342 te hoog was (d.w.z. 2,5, 3, 3,5, 4 μg/ml), daalde het aandeel SP-cellen totdat het verdween. 2 μg/ml Hoechst 33342 was dus de beste concentratie voor SP-analyse in MDA-MB-435 cellen. Om de juiste blokker voor deze cellijn te bepalen, werden Hoechst 33342 en een blokker (Verapamil of Reserpine) toegevoegd aan 1 x 106 cellen, die werden gesuspendeerd in 1 ml PBS aangevuld met 2% FBS, tot eindconcentraties van respectievelijk 2 μg/ml en 40 μM. Zoals weergegeven in figuur 2B,verdreef ongeveer 0,4% van de cellen de kleurstof na behandeling met Verapamil. Na behandeling met Reserpine daalde de verhouding echter tot ongeveer 0,1% (figuur 2C). Vanuit dit experiment werd Reserpine beschouwd als een meer geschikte blokker voor deze cellijn.
In het derde voorbeeld werden A549-cellen (menselijke longadenocarcinoomcellen) gedurende 48 uur (h) voorbehandeld met STAT3 activator-Colivelin20 (100 nM). De STAT3-signaleringsroute is belangrijk voor het bevorderen van de stamheidskenmerken van tumorcellen21. Zoals weergegeven in figuur 3,nam het aandeel SP-cellen toe bij colivelinstimulatie.
In het laatste voorbeeld werden T47D-cellen (menselijke borstkankercellen) voorbehandeld met 0,1 μM FRA1-remmer-SKLB816 (ook wel 13an genoemd) gedurende 48 h22. FRA1 is een gerapporteerde poortwachter van epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT) en betrokken bij de regulatie van tumorstamness23. Zoals weergegeven in figuur 4,daalde het aandeel SP-cellen als gevolg van de behandeling van FRA1-remmers.
Figuur 1: Gating strategie van MDA-MB-231 cellen in SP analyse. (A) Gatingstrategie van MDA-MB-231 cellen, die werden gekleurd met Hoechst 33342 (3 μg/ml) en propidiumjodide (PI, 1 μg/ml). (B) Gatingstrategie van MDA-MB-231 cellen, die werden behandeld met Reserpine (40 μM) en gekleurd met Hoechst 33342 (3 μg/ml) en PI (1 μg/ml). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Optimalisatie van de concentratie Van Hoechst 33342 en selectie van blokker in MDA-MB-435 cellen. (A) De SP-analyseresultaten van MDA-MB-435-cellen, die werden gekleurd met Hoechst 33342 (Hoechst) bij verschillende concentratiegradiënten (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/ml) samen met PI (1 μg/ml). (B) Het SP-analyseresultaat van MDA-MB-435-cellen, die werden behandeld met Verapamil (40 μM) en gekleurd met Hoechst 33342 (2 μg/ml) en PI (1 μg/ml). (C) Het SP-analyseresultaat van MDA-MB-435-cellen, die werden behandeld met Reserpine (40 μM) en gekleurd met Hoechst 33342 (2 μg/ml) en PI (1 μg/ml). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Het aandeel SP-cellen werd versterkt door STAT3 activator in A549-cellen. (A) De SP-analyseresultaten van A549-cellen die gedurende 48 uur zijn voorbehandeld met STAT3-activator-Colivelin (100 nM) of de voertuigbesturing (Ctrl)-H2O. A549-cellen behandeld met Reserpine (45 μM) werden gebruikt als blokkeercontrole. A549-cellen werden gekleurd met Hoechst 33342 (7 μg/ml) en PI (1 μg/ml). (B) De statistische resultaten van het aandeel SP-cellen in A549-cellen behandeld met Colivelin (100 nM) en de voertuigcontrole ervan. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + standaardfout van het gemiddelde (SEM), n = 3 voor elke groep. "*" geeft P < 0,05 aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Het aandeel SP-cellen werd geremd door FRA1-remmer in T47D-cellen. (A) De SP-analyseresultaten van T47D-cellen voorbehandeld met SKLB816 (0,1 μM) of de voertuigbesturing (Ctrl)-DMSO gedurende 48 uur. T47D-cellen behandeld met Reserpine (40 μM) werden gebruikt als blokkeercontrole. T47D-cellen werden gekleurd met Hoechst 33342 (8 μg/ml) en PI (1 μg/ml). (B) De statistische resultaten van het aandeel SP-cellen in T47D-cellen behandeld met SKLB816 (0,1 μM) en de voertuigcontrole ervan. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + SEM, n = 3 voor elke groep. "*" geeft P < 0,05 aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.1. (A) Klik op de mapknop. (B) Klik op de knop Experiment en klik vervolgens op de knop Nieuw experiment. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.2. (A) Klik op de knop OK. (B) Experiment_001 verschijnt onder FOLDER. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.3. (A) Klik op de knop Experiment_001 om de naam van Experiment_001 te wijzigen in een specifieke naam (bijv. "20191118-SP"). (B) Klik op de enter-knop. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.4. (A) Klik op de knop Nieuw exemplaar. (B) Klik op de knop Nieuwe buis. (C) Klik op de pijlpuntknop. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 5: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.5. (A) Klik op de knop Parameters om de parameters in te stellen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 6: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.6.1.2. (A) Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "PI-A". (B) Klik op de knop Polygon Gate om een polygoonpoort te maken om de P1-subset (ook bekend als FSC-A, PI-A-subset) te gaten. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 7: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.6.1.3. (A) Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "FSC-W". (B) Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de P1-knop onder De populaties weergeven. (C) Klik op de knop Rechthoekige poort om een rechthoekige poort te maken om de P2-subset (ook bekend als FSC-A, FSC-W-subset) te openen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 8: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.6.1.4. (A) Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "SSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "SSC-W". (B) Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop P2 onder de knop Populaties weergeven . (C) Klik op de knop Rechthoekige poort om een rechthoekige poort te maken om de P3-subset (ook bekend als SSC-A, SSC-W-subset) te gaten. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 9: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.6.1.5. (A) Klik op de knop Puntplot om de puntplot weer te geven, klik op de X-as en stel deze in op "Hoechst Red-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "Hoechst Blue-A". (B) Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik op de knop P3 onder de knop Populaties weergeven. (C) Klik op de knop Polygon Gate om een polygoonpoort te maken om de P4-subset (ook bekend als Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A subset) te gaten. (D) Klik met de rechtermuisknop op de puntplot en klik vervolgens op de knop Populatiehiërarchie weergeven om de populatiehiërarchie weer te geven. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 10: Instructies voor flow cytometer software stap nummer 3.6.1.6. (A) Klik op de knop Gegevens verzamelen en verzamel vervolgens 20.000-100.000 gebeurtenissen uit elk voorbeeld. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 11: Instructies voor flow cytometrie analyse software stap nummer 4.1. (A) Open de flow cytometrie analyse software en sleep een monsterbestand in de software. (B) Het voorbeeldbestand wordt geïmporteerd. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 12: Instructies voor flow cytometrie analyse software stap nummer 4.2.1. (A) Dubbelklik op dit voorbeeldbestand. (B) Klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "PI-A". (C) Klik op de knop Een polygoonpoort maken om een polygoonpoort te maken. (D) Klik op de knop OK om de SUBSET FSC-A, PI-A te verkrijgen. (E) De FSC-A, PI-A subset wordt verkregen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 13: Instructies voor flow cytometrie analyse software stap nummer 4.2.2. (A) Dubbelklik op het SUBSETBESTAND FSC-A, PI-A. (B) Klik op de X-as en stel deze in op "FSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "FSC-W". (C) Klik op de knop Een rechthoekige poort maken om een rechthoekige poort te maken. (D) Klik op de knop OK om de SUBSET FSC-A, FSC-W teverkrijgen. (E) De SUBSET FSC-A, FSC-W isverkregen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 14: Instructies voor software voor stroomcytometrieanalyse stapnummer 4.2.3. (A) Dubbelklik op het FSC-A, FSC-W subset bestand. (B) Klik op de X-as en stel deze in op "SSC-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "SSC-W". (C) Klik op de knop Een rechthoekige poort maken om een rechthoekige poort te maken. (D) Klik op de knop OK om de subset SSC-A, SSC-W te verkrijgen. (E) De SSC-A, SSC-W subset wordt verkregen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 15: Instructies voor flow cytometrie analyse software stap nummer 4.2.4. (A) Dubbelklik op het deelverzamelingsbestand SSC-A, SSC-W. (B) Klik op de X-as en stel deze in op "Hoechst Red-A"; klik op de Y-as en stel deze in op "Hoechst Blue-A". (C) Klik op de knop Een polygoonpoort maken om een polygoonpoort te maken. (D) Klik op de knop OK om de subset Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A te verkrijgen. (E) De hoechst rood-A, hoechst blauw-a deelverzameling wordt verkregen. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 16: Instructies voor flow cytometrie analyse software stap nummer 4.2.5. (A) Klik op de knop Lay-outeditor openen om de lay-outeditor te openen. (B) Sleep het voorbeeldbestand SSC-A, SSC-W subset naar Layout Editor. (C) Klik op de knop Klik om lay-outvenster op te slaan in bestand om de afbeeldingsresultaten op te slaan. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke punten om in gedachten te houden voor de SP-test. De eerste is de selectie van een goede blokker, zoals Verapamil of Reserpine, voor elke cellijn, omdat de "gate" locatie van de SP-cellen wordt bepaald op basis van de positie waarin een groot aantal SP-cellen verdwijnt na de toevoeging van de blocker. Voor de MDA-MB-231 cellijn werkt Reserpine goed. Voor andere cellijnen kunnen verschillende blokkers echter beter werken.
De tweede is de concentratie van Hoechst 33342. Het percentage SP-cellen nam toe naarmate de kleuringsconcentratie van Hoechst 33342 afnam, zoals uit de representatieve gegevens bleek. Dit fenomeen kan worden verklaard door de kleurstofopnamekinetiek24. Veranderingen in kleurstofconcentratie beïnvloeden de verrijking van Hoechst 33342 in cellen. Daarom is de kleuringsconcentratie van Hoechst 33342 nauw verbonden met de resultaten van de SP-test. Bovendien verschillen de opname en uitzetting van Hoechst 33342 per celtype. Zo moeten de juiste concentraties van Hoechst 33342 vóór de SP-analyse worden onderzocht op verschillende cellijnen.
De derde is een goede variatiecoëfficiënt (CV) van de flowcytometer, die ook van cruciaal belang is voor de SP-analyse25. UV-laservermogen is een belangrijk criterium voor betere cv's12. Dit protocol maakt gebruik van een commerciële flowcytometer (zie tabel met materialen)om de SP-test uit te voeren. In dit cuvette-flow-cell instrument gebruikten we de UV-laser met een vermogen van 15 mW om de beste cv's te krijgen. Over het algemeen zorgt een relatief hoog UV-laservermogen voor de optimale cv's. Zo zorgt 50-100 mW voor het optimale Hoechst-signaal op jet-in-air instrumenten12. Sommige lasers bieden een lager UV-vermogen, wat cv's kan verminderen. In deze gevallen is een goede laseruitlijning van cruciaal belang.
De laatste is de invloed van andere factoren tijdens het experiment. Celstatus, temperatuur, kleurtijd, werking van flowcytometrie en andere factoren kunnen ook van invloed zijn op het aandeel en de kwaliteit van de SP-test. Veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen tijdens de bereiding van celsuspensingen hebben bijvoorbeeld invloed op de verhouding van SP-cellen. Daarom moeten de beste experimentele omstandigheden worden onderzocht voordat sp-analyse wordt uitgevoerd. Gezien de bovenstaande factoren kan de SP-verhouding van dezelfde cellijn, gemeten door verschillende laboratoria, verschillen. De verhoudingen van MDA-MB-231-cellen en A549-cellen werden bijvoorbeeld gerapporteerd als respectievelijk ~ 0,1%–4,8%26,27,28,29 en ~0,8%–18%30,31,32,33,34.
Onderzoekers kunnen deze test aanpassen voor verschillende toepassingen, zoals de studie van andere tumorcellijnen of primaire patiënt-afgeleide tumorcellen. Als het protocol niet goed werkt voor de cellen die worden getest, kunnen de onderzoekers MDA-MB-231-cellen gebruiken als positieve controle en de cellen bevlekken volgens de gegeven specificaties. Omdat dit protocol zeer gevoelig is voor de concentratie van Hoechst 33342, kleuringstemperatuur en -tijd etc., moeten de onderzoekers al deze omstandigheden nauwkeurig controleren. Het percentage SP in veel soorten menselijke tumorcellijnen is relatief laag (~ 0%–37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Als een te hoog of laag sp-percentage wordt waargenomen, kan dit te wijten zijn aan onjuiste concentraties Van Hoechst 33342 of gebruikte blokker. Als het probleem verband lijkt te houden met de flowcytometer, moet technische ondersteuning worden verkregen.
Hoewel het gebruik van SP om CSC's te analyseren en te scheiden zeer efficiënt is, heeft het nog steeds bepaalde beperkingen. De eerste is de hoge gevoeligheid voor kleuringsomstandigheden12. Veel factoren, zoals de concentratie van Hoechst 33342, celstatus, temperatuur, tijd van kleuring, werking van flowcytometrie en de blokkerselectie, kunnen de kwaliteit van sp-analyse beïnvloeden. De tweede is het cytotoxische effect van Hoechst 33342. Hoechst 33342 is een DNA-bindende kleurstof, maar is giftig voor cellen wanneer het hoge concentraties bereikt en vermindert zo de celactiviteit37.
Samengevat is SP-analyse een van de meest gebruikte methoden in de afgelopen jaren om CSC's in tumorcellijnen te identificeren en te zuiveren. Hoewel de methode enkele beperkingen heeft, is het bij afwezigheid van specifieke CSC's nog steeds een methode voor handige, snelle en kosteneffectieve verrijking van CSC's. Deze methode is gunstig voor het bestuderen van de biologische functies van CSC's en voor de identificatie van specifieke oppervlaktemarkeringen. Bovendien kan het, door de effecten van verschillende signalen op de SP-verhouding van tumorcellen te detecteren, aanwijzingen geven voor het regulerende effect van deze signaalroutes op csc-functies, en de ontdekking van nieuwe mechanismen vergemakkelijken, die uiteindelijk de gerichte therapie van tumoren kunnen begeleiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 en 81972787; Natural Science Foundation van Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten, Nankai University 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
