Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/60658
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

Summary

يتم تقديم طريقة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لقياس نسبة الخلايا السكانية الجانبية في خطوط خلايا الورم الصلبة.

Abstract

الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي سبب مهم لنمو الورم، والانبثاث، وتكرار. عزل وتحديد CSCs ذات أهمية كبيرة لأبحاث الأورام. حاليا، وتستخدم عدة تقنيات لتحديد وتنقية CSCs من الأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية. فصل وتحليل خلايا السكان الجانبية (SP) هما من الطرق الشائعة الاستخدام. تعتمد الأساليب على قدرة CSCs على طرد الأصباغ الفلورية بسرعة ، مثل Hoechst 33342. ويرتبط efflux من الصبغة مع ناقلات كاسيت ATP ملزمة (ABC) ويمكن أن تمنعها مثبطات الناقل ABC. يتم وصف طرق تلطيخ الخلايا السرطانية المستزرعة مع Hoechst 33342 وتحليل نسبة خلايا SP الخاصة بهم عن طريق قياس التدفق الخلوي. هذا المقايسة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. يمكن أن تساهم البيانات التي تم إنشاؤها في هذا الفحص في فهم أفضل لتأثير الجينات أو الإشارات الأخرى خارج الخلية وداخل الخلايا على خصائص الجذعية للخلايا السرطانية.

Introduction

الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعات فرعية من الخلايا ذات القدرة على التجديد الذاتي وإمكانات التمايز المتعددة ، والتي تلعب دورا حيويا في نمو الورم ، والانبثاث ، وتكرار1،2. حاليا، تم تحديد CSCs أن تكون موجودة في مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة، بما في ذلك الرئة والدماغ والبنكرياس والبروستاتا والثدي وسرطان الكبد3و4و5و6و7و8و9. ويستند تحديد CSCs في هذه الأورام أساسا على وجود البروتينات علامة السطح، مثل التعبير عالية و / أو منخفضة من CD44، CD24، CD133، وSca-19،10،ولكن لم يتم الإبلاغ عن علامة فريدة من نوعها التي يمكن أن تميز CSCs من غير CSCs حتى الآن. حاليا، يتم استخدام العديد من التقنيات لتحديد وتنقية CSCs في الأنسجة السرطانية أو خطوط الخلايا السرطانية. تم تصميم هذه التقنيات استنادا إلى خصائص محددة من CSCs. من بينها، المقايسات وفرز الخلايا الجانبية (SP) هي اثنين من الطرق الشائعة الاستخدام.

تم اكتشاف خلايا SP في الأصل من قبل Goodell وآخرون.11، عندما وصفت الخلايا الجذعية الدموية في خلايا نخاع العظم الماوس. عندما وصفت خلايا نخاع العظم الماوس مع صبغة الفلورسنت Hoechst 33342، ظهرت مجموعة صغيرة من الخلايا Hoechst 33342 ملطخة بشكل خافت في مؤامرة نقطة ثنائية الأبعاد من فحص قياس التدفق الخلوي. Hoechst 33342 هو صبغة الحمض النووي ملزمة ولها ما لا يقل عن وضعين ملزمة التي تؤدي إلى خصائص طيفية مختلفة. عند عرض انبعاث الفلورسينس على طولين موجيين في نفس الوقت ، يمكن الكشف عن مجموعات سكانية متعددة12. في المقايسة، كان متحمس Hoechst 33342 في 350 نانومتر، وقاست مضان باستخدام 450/20 نانومتر تمرير النطاق (BP) مرشح و675 نانومتر حافة مرشح تمريرة طويلة (EFLP)11. بالمقارنة مع مجموعة كاملة من خلايا نخاع العظام، تم إثراء هذه المجموعة من الخلايا مع الخلايا الجذعية الدموية تسمى خلايا SP11. خلايا SP قادرة على طرد Hoechst 33342 بسرعة. ويرتبط efflux من هذه الصبغة إلى ATP ملزمة كاسيت (ABC) الناقلات13, والتي يمكن أن تمنع من قبل بعض وكلاء مثل Fumitremorgin C14, فيراباميل وReserpine15,16. بعد ذلك ، تم الكشف عن نسب مختلفة من خلايا SP في مجموعة متنوعة من الأنسجة والأعضاء والأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية17و18و19. هذه الخلايا SP لها العديد من خصائص الخلايا الجذعية17،19.

تصف هذه المخطوطة هويشست 33342 وسم وتلطيخ الخلايا السرطانية المستزرعة وتحليل خلايا SP حسب قياس التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، يتم عرض الأمثل للتركيز Hoechst 33342 واختيار مانع السليم لخط خلية ورم محددة باستخدام هذا النهج. وأخيرا، يتم إثبات آثار تعزيز الجذعية أو إشارات التثبيط على نسبة SP في الخلايا السرطانية. وتبين الأمثلة التجريبية أنه يمكن استخدام تحليل SP لاستكشاف آثار إشارات مختلفة، مثل التعبير الجيني، ومثبطات صغيرة، والمفعلات، والسيتوكينات، وchemkines، على جذع الورم. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لعزل وتنقية CSCs ، مثل فرز CD44+/ CD24- السكان ، وتحليل ألدهيد ديهيدروجيناز (ALDH) ، وأجهزة قياس تكوين مجال الورم ، فإن هذه الطريقة أسهل للتلاعب وفعالة من حيث التكلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلية

  1. هضم الخلايا وإبطال هادأها
    1. خلايا ورم البذور (مثل خلايا MDA-MB-231) في لوحة بئر 6، وزراعة لهم في حاضنة 37 درجة مئوية الموردة مع 5٪ CO2.
    2. حصاد الخلايا عندما تصل كثافتها إلى حوالي 90٪. يستنشق ثقافة متوسطة جيدا ويغسل الخلايا 2x مع 3 مل من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS).
      ملاحظة: لدراسة آثار مثبطات مسار الإشارات (على سبيل المثال، مثبط FRA1)، أو المنشطات (على سبيل المثال، المنشط STAT3) على ميزات الجذعية للخلايا السرطانية، تزرع الخلايا السرطانية في لوحة بئر 6 ويتم معالجتها مسبقا بمثبطات أو منشطات لفترة معينة من الوقت قبل الحصاد.
    3. أضف 500 ميكرولتر من 0.25٪ من التريبسين-EDTA إلى كل بئر من لوحة البئر 6، وضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق (دقيقة)، واضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا.
      ملاحظة: سيؤثر الهضم المطول على ملف تعريف SP بسبب التغييرات في صلاحية الخلية.
    4. إضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS) إلى كل بئر من لوحة بئر 6 لإنهاء الهضم وماصة بلطف الخلايا صعودا وهبوطا 3-5x لتفريق كتل الخلية.
    5. إضافة 0.5 مل من تعليق الخلية إلى بئر واحد من لوحة بئر 6 جديدة وفحصها تحت المجهر. إذا لوحظ تكتلات الخلايا، تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر.
      ملاحظة: هذه خطوة اختيارية.
    6. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. إزالة supernatant وإعادة إنفاقها في 3 مل من برنامج تلفزيوني تكملها مع 2٪ FBS. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا 3-5x لخلط جيدا.
  2. عدد الخلايا
    1. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق واخلطه مع محلول أزرق سعة 50 ميكرولتر. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط لحساب عدد الخلايا الحية باستخدام طريقة قياسية، مثل مقياس الدم.
    2. تمييع الخلايا في برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ FBS إلى تركيز نهائي من 1 × 106 خلايا / مل. إضافة 1 مل من تعليق الخلية إلى 5 مل البوليسترين جولة أنبوب الاختبار السفلي وإعداد اثنين من أنابيب العينة.

2. تلطيخ الخلية مع Hoechst 33342

  1. إضافة Hoechst 33342 إلى أنبوب واحد للوصول إلى تركيز النهائي المناسب.
    ملاحظة: على سبيل المثال، التركيز المناسب من Hoechst 33342 هو 3 ميكروغرام/مل لخلايا MDA-MB-231.
  2. إضافة مانع (على سبيل المثال، Fumitremorgin C، فيراباميل، أو ريسربين) إلى أنبوب آخر إلى تركيز نهائي مناسب واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل إضافة نفس تركيز Hoechst 33342 كما هو موضح في الخطوة 2.1.
    ملاحظة: بالنسبة لخلايا MDA-MB-231، يكون مانع الصد المناسب Reserpine (40 ميكرومتر). Reserpine يستخدم كعنصر تحكم حظر للتحقق من عدم وجود خلايا في منطقة SP مسور.
  3. إعداد عدة أنابيب تحتوي على خلايا وإضافة Hoechst 33342 إلى تدرجات تركيز مختلفة. بعد فحص قياس التدفق الخلوي، اختر التركيز المناسب وفقا للملف الشخصي ونسبة SP.
    ملاحظة: هذه خطوة اختيارية تستخدم لتعريف التركيز الصحيح من Hoechst 33342.
  4. إعداد عدة أنابيب تحتوي على خلايا، إضافة مانع لتدرجات تركيز مختلفة، واحتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم إضافة Hoechst 33342 إلى تركيز مناسب. بعد فحص قياس التدفق الخلوي، اختر التركيز المناسب وفقا لعدم وجود خلايا في منطقة SP المسورة.
    ملاحظة: هذه خطوة اختيارية تستخدم لتعريف التركيز الصحيح من مانع.
  5. ضع الأنابيب في حاضنة 37 درجة مئوية واحتضنها لمدة 60 دقيقة، وهز الأنابيب كل 10 دقائق.
    ملاحظة: يهز أنابيب جيدا مهم لتلطيخ، لأنه يضمن الاتصال الكامل بين الخلايا وصبغ للحصول على نتائج أفضل تلطيخ.
  6. بعد الحضانة، طرد الخلايا في 200 x g، 4 °C لمدة 5 دقائق، ونسيخ supernatant بعناية، لأن الخلايا تشكل الكريات فضفاضة جدا وغير مستقرة.
  7. Resuspend خلايا كل أنبوب في 1 مل من الجليد الباردة PBS تكملها مع 2٪ FBS وماصة الخلايا صعودا وهبوطا 3-5x لخلط جيدا. إضافة 1 ميكرولتر من 1 ملغم / مل البروبيديوم يوديد (PI) إلى تعليق كل أنبوب لتحديد الخلايا الميتة.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات في هذه الخطوة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمنع ارتجاع Hoechst 33342 من الخلايا السرطانية. يجب حماية الأنابيب من التعرض المباشر للضوء.

3. التحليل حسب قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: إرشادات لاستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد)موضحة في هذا القسم والأرقام التكميلية 1-10.

  1. في برنامج قياس التدفق الخلوي، انقر فوق الزر FOLDER . انقر فوق الزر تجربة، ثم انقر فوق تجربة جديدة (الشكل التكميلي 1A،B).
  2. انقر فوق الزر موافق. "Experiment_001" سوف تظهر تحت المجلد (الشكل التكميلي 2A،ب).
  3. انقر فوق الزر Experiment_001 لتغيير اسم المجلد إلى اسم محدد (على سبيل المثال، "20191118-SP"). انقر فوق إدخال. الاسم الجديد ("20191118-SP") سوف تظهر تحت المجلد (الشكل التكميلي 3A,B).
  4. انقر فوق الزر عينة جديدة لإضافة نموذج إلى مجلد التجربة الجديدة ("20191118-SP"). انقر فوق الزر أنبوب جديد لإضافة أنبوب إلى العينة. انقر فوق الزر Arrowhead (الشكل التكميلي 4A-C).
  5. انقر فوق الزر معلمات وإعداد معلمات مقياس التدفق الخلوي(الشكل التكميلي 5).
    1. استخدم مرآة 610 نانومتر قصيرة التمرير (DMSP) لفصل أطوال الموجة الانبعاثية. استخدام مرشح BP 450/20 نانومتر لجمع الفلورسينس الأزرق و675 نانومتر EFLP لجمع الفلورسينس الأحمر.
      ملاحظة: Hoechst 33342 متحمس مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية في 355 نانومتر وPI متحمس في 488 نانومتر.
  6. تشغيل عينات الخلية على مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: يمكن فرز خلايا SP حسب فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) في ظل ظروف معقمة. وينبغي جمع ما مجموعه 000 100 إلى 000 500 خلية لإجراء تجارب المتابعة.
    1. تشغيل الخلايا الملطخة Hoechst 33342 على تدفق الخلايا.
      1. ضع أنابيب تحتوي على خلايا ملطخة ب Hoechst 33342 على مقياس الخلايا.
      2. انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة ثم انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "PI-A". عرض مخطط النقطة لمنطقة النبض المبعثر الأمامي (FSC-A، المحور X الذي تم تعيينه إلى الوضع الخطي) مقابل مضان PI (مجموعة محور ص إلى مقياس لوغاريتمي). ضبط الفولتية لإظهار الخلايا الحية في الجانب الأيمن والخلايا غير الحية، والتي هي ملطخة الزاهية مع PI، في الزاوية اليسرى العليا. ثم قم بإنشاء بوابة مضلع لاستبعاد الخلايا الميتة وحطام الخلية(الشكل 1A)بالنقر فوق الزر بوابة المضلع لبوابة المجموعة الفرعية P1، والمعروفة أيضا باسم FSC-A، مجموعة فرعية PI-A (الشكل التكميلي 6A،B).
      3. انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "FSC-W". عرض رسم النقطة FSC-A (المحور X) مقابل عرض النبض المبعثر للأمام (FSC-W، محور ص). انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، انقر فوق الزر P1 أسفل الزر إظهار المجموعات السكانية. انقر فوق الزر بوابة مستطيلة لإنشاء بوابة مستطيلة إلى بوابة المجموعة الفرعية P2 (يعرف أيضا FSC-A، FSC-W الفرعية). وهذا يستبعد الخلايا ذات الأحجام الكبيرة(الشكل التكميلي 7A-C والشكل 1A).
      4. انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "SSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "SSC-W". عرض رسم نقطة من ناحية النبض مبعثر الجانب (SSC-A، X-محور) مقابل عرض النبض مبعثر الجانب (SSC-W، Y-محور). انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، وانقر فوق الزر P2 أسفل إظهار المجموعات السكانية. ثم انقر فوق الزر بوابة مستطيلة لإنشاء بوابة مستطيلة إلى بوابة المجموعة الفرعية P3 (يعرف أيضا باسم SSC-A، SSC-W الفرعية). وهذا سوف تحصل على السكان الخلية مع الحبيبية موحدة (الشكل التكميلي 8A-C والشكل 1A).
      5. انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "Hoechst الأحمر-A"; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى"Hoechst الأزرق-A". عرض رسم نقطة Hoechst الأحمر-A (المحور X) مقابل Hoechst الأزرق-A (المحور ص). انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، انقر فوق الزر P3 أسفل الزر إظهار المجموعات السكانية. انقر فوق الزر بوابة المضلع لإنشاء بوابة مضلعة لبوابة المجموعة الفرعية P4 (تعرف أيضا باسم Hoechst Red-A، مجموعة فرعية Hoechst Blue-A). انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، وانقر فوق الزر إظهار التسلسل الهرمي للسكان لإظهار التسلسل الهرمي للسكان.
        ملاحظة: سوف تظهر مؤامرة نقطة ثلاثة مجموعات مختلفة: 1) مجموعة G0-G1 المرحلة السكانية بالقرب من وسط الرسم البياني; 2) مجموعة من المراحل S-G2/M بالقرب من الزاوية اليمنى العليا؛ 3) SP. ثم يتم بوابة SP لمزيد من التحليل (الشكل التكميلي 9A-D والشكل 1A). إذا كانت مؤامرة نقطة Hoechst الأحمر ألف مقابل Hoechst الأزرق ألف لا تظهر لمحة عن SP مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 1A، وينبغي تعديل الفولتية حتى ينظر إلى ملف تعريف مماثل. وفي الوقت نفسه، ضبط جميع البوابات أعلاه وفقا لذلك.
      6. بعد تحديد منطقة بوابة خلايا SP، انقر فوق الحصول على البيانات لجمع أحداث 20,000-100,000 من كل عينة لتحليل النسبة المئوية لخلايا SP(الشكل التكميلي 10).
    2. تشغيل الخلايا الملطخة Hoechst 33342 تعامل مع مانع على مقياس التدفق الخلوي.
      1. ضع أنابيب تحتوي على مانع على مقياس الخلايا وتشغيل الخلايا باستخدام نفس الفولتية والبوابات لمزيد من التحقق مما إذا كان يتم اختيار الفولتية والبوابات بشكل مناسب.
        ملاحظة: بالمقارنة مع تلطيخ Hoechst 33342 وحده، يجب أن تظهر نسبة صغيرة جدا من الخلايا، إن وجدت، في المنطقة المسورة من SP (الشكل 1B).
      2. جمع الأحداث 20،000-100،000 من كل عينة لتحليل النسبة المئوية للخلايا SP.

4. تحليل البيانات

ملاحظة: إرشادات لاستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد)موضحة في هذا القسم والأرقام التكميلية 11-16.

  1. نسخ الملفات بتنسيق FCS إلى جهاز كمبيوتر، وفتح تدفق برنامج تحليل قياس الخلايا، واسحب ملف عينة واحدة إلى البرنامج (الشكل التكميلي 11A،B).
  2. بوابة الخلايا والحصول على النسبة المئوية للخلايا SP.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق هذا الملف نموذج، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC -A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "PI-A". ثم قم بإنشاء بوابة مضلع ثم انقر فوق الزر موافق للحصول على مجموعة فرعية FSC-A PI-A (الشكل التكميلي 12A-E).
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف مجموعة فرعية FSC-A، PI-A،انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "FSC-W". ثم قم بإنشاء بوابة مستطيلة ثم انقر فوق الزر موافق للحصول على FSC-A، FSC-W الفرعية (الشكل التكميلي 13A-E).
    3. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف مجموعة فرعية FSC-A، FSC-W،انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "SSC-A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "SSC-W". ثم قم بإنشاء بوابة مستطيلة ثم انقر فوق الزر موافق للحصول على مجموعة فرعية SSC-A SSC-W (الشكل التكميلي 14A-E).
    4. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف مجموعة فرعية SSC-A، SSC-W،انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "Hoechst Red-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى"Hoechst الأزرق-A". ثم قم بإنشاء بوابة مضلع وانقر فوق الزر موافق للحصول على Hoechst الأحمر-A، Hoechst الأزرق-A فرعية (الشكل التكميلي 15A-E).
    5. افتح محرر التخطيط بالنقر فوق الزر فتح محرر تخطيط. اسحب SSC-A، SSC-W ملف المجموعة الفرعية إلى محرر تخطيط، ثم انقر فوق انقر لحفظ نافذة التخطيط إلى ملف زر لحفظ نتائج الصورة(الشكل التكميلي 16A-C).
  3. احفظ مساحة العمل للاحتفاظ بمعلومات gating عند إغلاق البرنامج.
  4. إجراء تحليلات t-test باستخدام برنامج التحليل الإحصائي لمقارنة الفرق بين مجموعتين. وقد عرفت قيمة P < 0.05 بأنها ذات دلالة إحصائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد أجريت أربعة تحليلات تجريبية لسبو وفقا لهذه الطريقة. في أول واحد، اكتشفنا نسبة خلايا SP في MDA-MB-231، وهو خط خلايا سرطان الثدي البشري السلبي الثلاثي، في ظل الظروف العادية. بعد عد الخلايا، تمت إضافة Hoechst 33342 في أنبوب واحد يحتوي على 1 × 106 خلايا إلى تركيز نهائي قدره 3 ميكروغرام / مل. وأضيف ريسيربين وهويشست 33342 إلى أنبوب آخر إلى تركيزات نهائية تبلغ 40 ميكرومترا و3 ميكروغرام/مل على التوالي. تمت إضافة PI إلى كلا الأنبوبين. وأظهرت مؤامرة نقطة FSC-A (المحور السيني) مقابل PI-A (المحور ص) ثلاثة مجموعات السكان: 1) مجموعة خلايا PI إيجابية، والتي تمثل الخلايا الميتة؛ 2) خلية إيجابية PI- 1، والتي تمثل الخلايا الميتة؛ 1) خلية إيجابية PI-A(1). 2) حطام الخلية؛ و3) وكان السكان الرئيسيين الخلايا PI-السلبية، والتي خضعت لمزيد من التحليل(الشكل 1A،B). تم استخدام مجموعة من خلايا واحدة مسورة من مؤامرة نقطة FSC-A (المحور X) مقابل FSC-W (محور ص) ومؤامرة نقطة من SSC-A (المحور X) مقابل SSC-W (محور ص) لتحليل نسبة خلايا SP(الشكل 1A،B). تم بوابة خلايا SP من مؤامرة نقطة Hoechst الأحمر -A (المحور العاشر) مقابل Hoechst الأزرق -A (المحور ص)، وكانت نسبتها حوالي 0.9٪ في خلايا MDA-MB-231 (الشكل 1A). ومع ذلك، Reserpine إلى حد كبير انخفاض نسبة خلايا SP (الشكل 1B)، مما يدعم أن اللوحة بوابة لSP هو الصحيح.

وكانت التجربة الثانية لتحديد تركيز تلطيخ مناسبة من Hoechst 33342 في خلايا MDA-MB-435. بعد عد الخلايا، تمت إضافة Hoechst 33342 إلى 1 × 106 خلايا، والتي تم تعليقها في 1 مل من PBS تكملها 2٪ FBS، إلى تدرجات تركيز مختلفة، بما في ذلك 0.5، 1، 1.5، 2، 2.5، 3، 3.5، و 4 ميكروغرام / مل. كما هو مبين في الشكل 2A، عندما كان تركيز Hoechst 33342 منخفضا جدا (أي 0.5 ، 1 ، 1.5 ميكروغرام / مل) ، كان من الصعب التمييز بين خلايا SP وخلايا الخلايا الأخرى ، لأن الكثير من الخلايا كانت في حالة ملطخة بشكل خافت. عندما كان تركيز Hoechst 33342 مرتفعا جدا (أي 2.5 و3 و3.5 و4 ميكروغرام / مل) ، انخفضت نسبة خلايا SP حتى اختفت. وهكذا، كان 2 ميكروغرام/مل Hoechst 33342 أفضل تركيز لتحليل SP في خلايا MDA-MB-435. بالإضافة إلى ذلك، لتحديد مانع المناسبة لهذا الخط الخلية، Hoechst 33342 وحاصر (فيراباميل أو ريسربين) أضيفت إلى 1 × 106 الخلايا، والتي علقت في 1 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ FBS، إلى تركيزات النهائي من 2 ميكروغرام / مل و 40 ميكرومتر، على التوالي. كما هو مبين في الشكل 2B، حوالي 0.4 ٪ من الخلايا طرد الصبغة بعد العلاج فيراباميل. ومع ذلك، بعد العلاج ريسيربين، انخفضت النسبة إلى حوالي 0.1٪(الشكل 2C). من هذه التجربة، كان يعتبر ريسيربين مانع أكثر ملاءمة لخط الخلية هذا.

في المثال الثالث، تم المعالجة المسبقة لخلايا A549 (خلايا الورم الغدي الرئوي البشري) مع المنشط STAT3-Colivelin20 (100 nM) لمدة 48 ساعة (ح). مسار الإشارات STAT3 مهم لتعزيز ملامح الجذعية من الخلايا السرطانية21. كما هو مبين في الشكل 3، زادت نسبة خلايا SP عند تحفيز Colivelin.

في المثال الأخير، تم المعالجة المسبقة لخلايا T47D (خلايا سرطان الثدي البشرية) بمثبط 0.1 ميكرومتر FRA1-SKLB816 (المسمى أيضا 13an) لمدة 48 ساعة22. FRA1 هو حارس بوابة المبلغ عنها من الانتقال الظهاري-mesenchymal (EMT) وتشارك في تنظيم stemness الورم23. كما هو مبين في الشكل 4، انخفضت نسبة خلايا SP بسبب علاج مثبط FRA1.

Figure 1
الشكل 1: استراتيجية غاتينج من خلايا MDA-MB-231 في تحليل SP. (أ) استراتيجية غاتينغ من خلايا MDA-MB-231، التي كانت ملطخة Hoechst 33342 (3 ميكروغرام / مل) و يوديد البروبيديوم (PI، 1 ميكروغرام / مل). (ب) استراتيجية غاتينغ من خلايا MDA-MB-231، التي عولجت مع ريسيربين (40 ميكرومتر) وملطخة Hoechst 33342 (3 ميكروغرام / مل) وPI (1 ميكروغرام / مل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحسين تركيز Hoechst 33342 واختيار مانع في خلايا MDA-MB-435. (أ)نتائج تحليل SP لخلايا MDA-MB-435، التي كانت ملطخة ب Hoechst 33342 (Hoechst) بتدرجات تركيز مختلفة (0.5، 1، 1.5، 2، 2.5، 3، 3.5، 4 ميكروغرام/مل) مع PI (1 ميكروغرام/مل). (ب)نتيجة تحليل SP لخلايا MDA-MB-435، التي عولجت مع فيراباميل (40 ميكرومتر) وملطخة ب Hoechst 33342 (2 ميكروغرام/مل) وPI (1 ميكروغرام/مل). (ج) نتيجة تحليل SP لخلايا MDA-MB-435، التي عولجت ب Reserpine (40 ميكرومتر) وملطخة ب Hoechst 33342 (2 ميكروغرام/مل) وPI (1 ميكروغرام/مل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تم تعزيز نسبة خلايا SP بواسطة المنشط STAT3 في خلايا A549. (أ)نتائج تحليل SP من خلايا A549 المعالجة مسبقا مع ستات3 المنشط-Colivelin (100 nM) أو التحكم في السيارة (Ctrl) -H2O لمدة 48 ساعة. تم استخدام خلايا A549 المعالجة ب Reserpine (45 ميكرومتر) كعنصر تحكم مانع. كانت خلايا A549 ملطخة ب Hoechst 33342 (7 ميكروغرام / مل) وPI (1 ميكروغرام / مل). (ب)النتائج الإحصائية لنسبة خلايا SP في خلايا A549 المعالجة مع Colivelin (100 nM) والتحكم في السيارة. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط + خطأ قياسي في الوسط (SEM)، n = 3 لكل مجموعة. "*" يشير إلى P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تم تثبيط نسبة خلايا SP بواسطة مثبط FRA1 في خلايا T47D. (أ)نتائج تحليل SP للخلايا T47D المعالجة مسبقا مع SKLB816 (0.1 ميكرومتر) أو التحكم في السيارة (Ctrl) - DMSO لمدة 48 ساعة. تم استخدام خلايا T47D المعالجة ب Reserpine (40 ميكرومتر) كعنصر تحكم في الحظر. كانت خلايا T47D ملطخة ب Hoechst 33342 (8 ميكروغرام / مل) وPI (1 ميكروغرام / مل). (ب)النتائج الإحصائية لنسبة خلايا SP في خلايا T47D المعالجة ب SKLB816 (0.1 ميكرومتر) والتحكم في السيارة. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط + SEM، n = 3 لكل مجموعة. "*" يشير إلى P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: إرشادات للتدفق cytometer البرنامج الخطوة رقم 3.1. (أ) انقر فوق الزر FOLDER . (B) انقر فوق الزر تجربة ثم انقر فوق الزر تجربة جديدة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: إرشادات لبرنامج قياس التدفق الخلوي الخطوة رقم 3.2. (أ) انقر فوق الزر موافق. (ب) Experiment_001 يظهر تحت المجلد. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: تعليمات لتدفق الخلايا برنامج الخطوة رقم 3.3. (أ) انقر على زر Experiment_001 لتغيير اسم Experiment_001 إلى اسم معين (على سبيل المثال، "20191118-SP"). (B) انقر فوق الزر إدخال . يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 4: تعليمات لتدفق الخلايا برنامج الخطوة رقم 3.4. (أ) انقر فوق الزر عينة جديدة. (B) انقر فوق زر الأنبوب الجديد. (C) انقر فوق الزر رأس السهم. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 5: تعليمات لتدفق الخلايا برنامج الخطوة رقم 3.5. (أ) انقر فوق الزر معلمات لإعداد المعلمات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 6: تعليمات للتدفق cytometer البرمجيات الخطوة رقم 3.6.1.2. (أ) انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "PI-A". (B) انقر فوق الزر بوابة المضلع لإنشاء بوابة مضلعة لبوابة مجموعة فرعية P1 (المعروف أيضا باسم FSC-A، PI-A الفرعية). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 7: تعليمات للتدفق cytometer البرمجيات الخطوة رقم 3.6.1.3. (أ) انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A"؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "FSC-W". (B) انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة وانقر فوق الزر P1 أسفل إظهار السكان زر. (C) انقر فوق الزر بوابة مستطيلة لإنشاء بوابة مستطيلة لبوابة مجموعة فرعية P2 (المعروف أيضا باسم FSC-A، FSC-W الفرعية). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 8: تعليمات لبرنامج قياس التدفق الخلوي رقم 3.6.1.4. (أ) انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "SSC-A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "SSC-W". (B) انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة وانقر فوق الزر P2 أسفل الزر إظهار السكان . (C) انقر فوق الزر بوابة مستطيلة لإنشاء بوابة مستطيلة لبوابة مجموعة P3 الفرعية (المعروفة أيضا باسم SSC-A، SSC-W الفرعية). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 9: تعليمات للتدفق cytometer البرمجيات الخطوة رقم 3.6.1.5. (أ) انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "Hoechst الأحمر-A"; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى"Hoechst الأزرق-A". (B) انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة وانقر فوق الزر P3 أسفل الزر إظهار السكان. (C) انقر فوق الزر بوابة المضلع لإنشاء بوابة مضلعة لبوابة مجموعة فرعية P4 (المعروف أيضا باسم Hoechst الأحمر-A, Hoechst الأزرق-A الفرعية). (D) انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، ثم انقر فوق الزر إظهار التسلسل الهرمي للسكان لإظهار التسلسل الهرمي للسكان. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 10: تعليمات لبرنامج قياس التدفق الخلوي رقم 3.6.1.6. (أ) انقر فوق الزر الحصول على البيانات، ثم جمع الأحداث 20000-100000 من كل عينة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 11: تعليمات لتحليل التدفق الخلوي برنامج الخطوة رقم 4.1. (أ) افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي واسحب ملف عينة واحدة إلى البرنامج. (B) يتم استيراد ملف العينة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 12: تعليمات لتحليل التدفق الخلوي برنامج الخطوة رقم 4.2.1. (أ) انقر نقرا مزدوجا فوق هذا الملف العينة. (ب) انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "PI-A". (C) انقر فوق الزر إنشاء بوابة مضلع لإنشاء بوابة مضلع. (D) انقر فوق الزر موافق للحصول على مجموعة فرعية FSC-A PI-A. (ه)يتم الحصول على مجموعة فرعية FSC-A، PI-A. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 13: تعليمات لتحليل التدفق الخلوي برنامج الخطوة رقم 4.2.2. (أ) انقر نقرا مزدوجا فوق ملف مجموعة فرعية FSC-A، PI-A. (B) انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "FSC-W". (ج) انقر فوق الزر إنشاء بوابة مستطيلة لإنشاء بوابة مستطيلة. (D) انقر فوق الزر موافق للحصول على مجموعة فرعية FSC-A، FSC-W. (E) يتم الحصول على مجموعة فرعية FSC-A، FSC-W. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 14: تعليمات لتحليل التدفق الخلوي برنامج الخطوة رقم 4.2.3. (أ) انقر نقرا مزدوجا فوق ملف مجموعة فرعية FSC-A، FSC-W. (B) انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "SSC-A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "SSC-W". (C) انقر فوق الزر إنشاء بوابة مستطيلة لإنشاء بوابة مستطيلة. (D) انقر فوق الزر موافق للحصول على مجموعة فرعية SSC-A, SSC-W. (E) يتم الحصول على مجموعة فرعية SSC-A, SSC-W. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 15: تعليمات لتحليل التدفق الخلوي برنامج الخطوة رقم 4.2.4. (أ) انقر نقرا مزدوجا فوق SSC-A، SSC-W ملف الفرعية. (ب) انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "Hoechst الأحمر-A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى"Hoechst الأزرق-A". (C) انقر فوق الزر إنشاء بوابة مضلع لإنشاء بوابة مضلع. (D) انقر فوق الزر موافق للحصول على مجموعة فرعية Hoechst الأحمر-A، Hoechst الأزرق-A. (ه)يتم الحصول على مجموعة فرعية Hoechst الأحمر ألف ، Hoechst الأزرق ألف. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 16: تعليمات لتحليل التدفق الخلوي برنامج الخطوة رقم 4.2.5. (A) انقر فوق الزر فتح محرر التخطيط لفتح محرر التخطيط. (B) اسحب SSC-A، SSC-W نموذج مجموعة فرعية ملف إلى محرر تخطيط. (C) انقر فوق الزر انقر لحفظ نافذة التخطيط إلى ملف لحفظ نتائج الصورة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك العديد من النقاط الرئيسية التي يجب وضعها في الاعتبار لإجراء فحص SP. الأول هو اختيار مانع مناسب، مثل فيراباميل أو ريسربين، لكل خط خلية، لأنه يتم تحديد موقع "بوابة" من خلايا SP وفقا للموضع الذي يختفي فيه عدد كبير من خلايا SP بعد إضافة مانع. لخط الخلية MDA-MB-231، Reserpine يعمل بشكل جيد. ومع ذلك، بالنسبة لخطوط الخلايا الأخرى، قد تعمل حاصرات مختلفة بشكل أفضل.

والثاني هو تركيز Hoechst 33342. زادت النسبة المئوية لخلايا SP مع انخفاض تركيز التلطيخ في Hoechst 33342 ، كما أظهرت البيانات التمثيلية. ويمكن تفسير هذه الظاهرة من خلال امتصاص الصبغة الحركية24. تؤثر التغيرات في تركيز الصبغة على إثراء Hoechst 33342 في الخلايا. لذلك، هويشست 33342 تركيز تلطيخ يرتبط ارتباطا وثيقا بنتائج الفحص SP. وعلاوة على ذلك، فإن استيعاب وطرد Hoechst 33342 يختلفان بين أنواع الخلايا. وبالتالي، يجب استكشاف التركيزات المناسبة ل Hoechst 33342 لخطوط الخلايا المختلفة قبل تحليل SP.

والثالث هو معامل جيد للتباين (CV) من مقياس التدفق الخلوي ، وهو أمر بالغ الأهمية أيضا لتحليل SP25. الأشعة فوق البنفسجية ليزر السلطة هي معايير هامة لتحسين السير الذاتية12. يستخدم هذا البروتوكول مقياس تدفق الخلايا التجاري (راجع جدول المواد)لإجراء اختبار SP. في هذا الجهاز cuvette تدفق الخلية، استخدمنا الليزر الأشعة فوق البنفسجية مع قوة 15 كيلوواط للحصول على أفضل السير الذاتية. بشكل عام، توفر طاقة ليزر الأشعة فوق البنفسجية العالية نسبيا السير الذاتية المثلى. على سبيل المثال، توفر 50-100 كيلوواط إشارة Hoechst الأمثل على أجهزة الطائرات النفاثة في الهواء12. توفر بعض أشعة الليزر طاقة أقل للأشعة فوق البنفسجية، مما يمكن أن يقلل من السير الذاتية. في هذه الحالات، محاذاة الليزر جيدة أمر بالغ الأهمية.

والأخير هو تأثير عوامل أخرى خلال التجربة. حالة الخلية ودرجة الحرارة ووقت التلطيخ وتشغيل قياس التدفق الخلوي وعوامل أخرى قد تؤثر أيضا على نسبة ونوعية المقايسة SP. على سبيل المثال، ستؤثر التغيرات في صلاحية الخلية أثناء إعداد تعليق الخلايا على نسبة خلايا SP. لذلك، يجب استكشاف أفضل الظروف التجريبية قبل إجراء تحليل SP. وبالنظر إلى العوامل المذكورة أعلاه، قد تكون نسبة SP لنفس خط الخلية التي تقاس بمختبرات مختلفة مختلفة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن نسب خلايا MDA-MB-231 وخلايا A549 لتكون ~ 0.1٪ -4.8٪26و27و28و29 و ~ 0.8٪ -18٪30و31و32و33و34على التوالي.

يمكن للباحثين تعديل هذا المقايسة لتطبيقات مختلفة، مثل دراسة خطوط الخلايا السرطانية الأخرى، أو الخلايا السرطانية الأولية المشتقة من المريض. إذا كان البروتوكول لا يعمل بشكل جيد للخلايا التي يجري اختبارها، يمكن للباحثين استخدام خلايا MDA-MB-231 كعنصر تحكم إيجابي ووصمة عار الخلايا وفقا للمواصفات المحددة. لأن هذا البروتوكول حساس جدا لتركيز Hoechst 33342 ، تلطيخ درجة الحرارة والوقت وما إلى ذلك ، يجب على الباحثين التحقق من كل هذه الشروط عن كثب. نسبة SP في العديد من أنواع خطوط خلايا الورم البشري منخفضة نسبيا (~ 0٪-37٪)19،26،27،28،29،30،31،32،33،34،35،36. إذا لوحظت نسبة عالية أو منخفضة بشكل مفرط من SP ، فقد يكون ذلك بسبب تركيزات غير مناسبة من Hoechst 33342 أو مانع المستخدمة. إذا كان يبدو أن المشكلة تتعلق بمقياس التدفق الخلوي ، فيجب الحصول على الدعم الفني.

على الرغم من أن استخدام SP لتحليل وفصل CSCs هو كفاءة عالية، فإنه لا يزال لديه بعض القيود. الأول هو حساسيته العالية لظروف تلطيخ12. يمكن أن تؤثر العديد من العوامل، مثل تركيز Hoechst 33342 وحالة الخلية ودرجة الحرارة ووقت التلطيخ وتشغيل قياس التدفق الخلوي واختيار مانع الخلايا، على جودة تحليل SP. والثاني هو التأثير السام للخلايا من Hoechst 33342. Hoechst 33342 هو صبغة الحمض النووي ملزمة، ولكن سامة للخلايا عندما تصل إلى تركيزات عالية، وبالتالي يقلل من نشاط الخلية37.

وباختصار، تحليل SP هي واحدة من الأساليب الأكثر استخداما في السنوات الأخيرة لتحديد وتنقية CSCs في خطوط الخلايا السرطانية. ورغم أن هذه الطريقة لها بعض القيود، فإنها لا تزال، في غياب علامات سطحية محددة لمركبات الكربون الكلورية فلورية، طريقة لإثراء مركبات الكربون الكلورية فلورية بطريقة ملائمة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. وهذه الطريقة مفيدة لدراسة الوظائف البيولوجية لمراكز الدراسة المغلقة وتحديد علامات سطحية محددة. وعلاوة على ذلك، من خلال الكشف عن آثار إشارات مختلفة على نسبة SP من الخلايا السرطانية، فإنه يمكن أن توفر أدلة على التأثير التنظيمي لهذه المسارات إشارة على ميزات CSCs، وتسهيل اكتشاف آليات جديدة، والتي يمكن أن توجه في نهاية المطاف العلاج المستهدف للأورام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد مولت هذا العمل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية 81572599 81773124 81972787؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمدينة تيانجين (الصين) 19JCYBJC27300؛ مستشفى تيانجين الشعبي وجامعة نانكاي منحة البحوث التعاونية 2016rmnk005; صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية، جامعة نانكاي 63191153.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well cell culture plate CORNING 3516 9.5 cm2 (approx.)
Colivelin MCE HY-P1061A Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries (BIOIND) 04-001-1ACS
Flow cytometer BD Biosciences BD LSRFortessa
Flow cytometer software BD Biosciences FACSDiva
Flow cytometry analysis software BD Biosciences FlowJo
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Polystyrene round bottom test tube CORNING 352054 12 x 75 mm, 5 mL
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide
Reserpine Sigma-Aldrich 83580 (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester
SKLB816 Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Verapamil hydrochloride Sigma-Aldrich V4629 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  2. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  3. Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
  4. Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
  5. Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
  6. Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
  7. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  8. Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
  9. Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
  10. Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
  11. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  12. Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
  13. Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
  14. Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
  15. Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
  16. Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
  17. Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
  18. Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
  19. Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
  20. Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
  21. Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
  22. Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
  23. Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
  24. Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
  25. Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
  26. Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
  27. Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
  28. Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
  29. Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
  30. Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
  31. Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
  32. Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
  33. Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
  34. Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
  35. Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
  36. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  37. Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 168، السكان الجانبيون، الخلايا الجذعية السرطانية، Hoechst 33342، خطوط الخلايا السرطانية الصلبة، قياس التدفق الخلوي، أبحاث السرطان
تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dong, X., Wei, Y., Xu, T., Tan, X.,… More

Dong, X., Wei, Y., Xu, T., Tan, X., Li, N. Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines. J. Vis. Exp. (168), e60658, doi:10.3791/60658 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter