Summary
Un método conveniente, rápido, y rentable de medir la proporción de células de población laterales en variedades de células sólidas del tumor se presenta.
Abstract
Las células madre cancerosas (CSCs) son una causa importante del crecimiento del tumor, de la metástasis, y de la repetición. El aislamiento y la identificación de CSCs son de gran importancia para la investigación del tumor. Actualmente, varias técnicas se utilizan para la identificación y purificación de CSCs de tejidos del tumor y de variedades de células del tumor. La separación y el análisis de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos de uso general. Los métodos se basan en la capacidad de los CSCs para expulsar rápidamente los tintes fluorescentes, como Hoechst 33342. La emanación del tinte se asocia con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC) y puede ser inhibida por inhibidores del transportador ABC. Los métodos para la coloración de las células cultivadas del tumor con Hoechst 33342 y para analizar la proporción de sus células del SP por cytometry de flujo se describen. Este ensayo es conveniente, rápido y rentable. Los datos generados en este ensayo pueden contribuir a una mejor comprensión del efecto de los genes u otras señales extracelulares e intracelulares sobre las propiedades de stemness de las células tumorales.
Introduction
Las células madre cancerosas (CSCs) son subconjuntos de células con capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación múltiple, que desempeñan un papel vital en el crecimiento tumoral, la metástasis y la recurrencia1,2. Actualmente, CSCs se han identificado para existir en una variedad de tumores malos, incluyendo pulmón, cerebro, páncreas, próstata, pecho, y cánceres del hígado3,4,5,6,7,8,9. La identificación de CSCs en estos tumores se basa principalmente en la presencia de proteínas superficiales del marcador, tales como expresión alta y/o baja de CD44, de CD24, de CD133, y deSca-1 9,10,pero un marcador único que pueda distinguir CSCs de no-CSCs no se ha divulgado hasta ahora. Actualmente, varias técnicas se utilizan para identificar y purificar CSCs en tejido del tumor o variedades de células del tumor. Estas técnicas están diseñadas en base a las propiedades específicas de los CSCs. Entre ellos, los ensayos y la clasificación de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos comúnmente utilizados.
Las células SP fueron descubiertas originalmente por Goodell et al.11,cuando caracterizaron células madre hematopoyéticas en células de médula ósea de ratón. Cuando las células de la médula del ratón fueron etiquetadas con el tinte fluorescente Hoechst 33342, un pequeño grupo de células Tenue-manchadas Hoechst 33342 apareció en el diagrama de dos dimensiones del punto de un análisis cytometry de flujo. Hoechst 33342 es un colorante de unión al ADN y tiene al menos dos modos de unión que conducen a diferentes características espectrales. Al ver la emisión de fluorescencia a dos longitudes de onda al mismo tiempo, se pueden revelar múltiples poblaciones12. En su ensayo, el Hoechst 33342 se excitó a 350 nm y la fluorescencia se midió utilizando el filtro de paso de banda (BP) de 450/20 nm y el filtro de borde de 675 nm de paso largo (EFLP)11. En comparación con toda la población de células de médula ósea, este grupo de células se enriqueció con células madre hematopoyéticas llamadas células SP11. Las células SP son capaces de expulsar rápidamente Hoechst 33342. La emanación de este tinte está relacionada con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC)13,que pueden ser inhibidos por algunos agentes como fumitremorgina C14,verapamilo y reserpina15,16. Después de eso, se detectaron diferentes proporciones de células SP en una variedad de tejidos, órganos, tejidos tumorales y líneas celularestumorales 17,18,19. Estas células SP tienen muchas características de las células madre17,19.
Este manuscrito describe el etiquetado y la coloración de Hoechst 33342 de las células cultivadas del tumor y el análisis de las células del SP por cytometry de flujo. Por otra parte, la optimización de la concentración de Hoechst 33342 y la selección apropiada del molde para una variedades de células específica del tumor usando este acercamiento se muestran. Finalmente, se demuestran los efectos de las señales de promoción o inhibición del stemness sobre la proporción de SP en las células tumorales. Los ejemplos experimentales demuestran que el análisis del SP se puede utilizar para explorar los efectos de varias señales, tales como expresión génica, pequeños inhibidores, activadores, cytokines, y chemokines, sobre stemness del tumor. En comparación con otros métodos para el aislamiento y la purificación de CSCs, tales como clasificación de CD44+/ CD24– población, análisis de aldehído deshidrogenasa (ALDH) y ensayos de formación de esfera tumoral, este método es más fácil de manipular y es rentable.
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Protocol
1. Preparación celular
- Digestión celular y neutralización
- Sembrar células tumorales (como las células MDA-MB-231) en una placa de 6 pozos, y cultivarlas en una incubadora de 37 °C suministrada con 5% de CO2.
- Cosechar células cuando su densidad alcanza alrededor del 90%. Aspirar bien el medio de cultivo y lavar las células 2x con 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: Para examinar los efectos de los inhibidores de la vía de señalización (por ejemplo, inhibidor de FRA1), o activadores (por ejemplo, activador STAT3) sobre las características de stemness de las células tumorales, las células tumorales se siembran en una placa de 6 pozos y se pretratan con inhibidores o activadores durante un cierto período de tiempo antes de la cosecha. - Agregue 500 μL de tripsina-EDTA al 0,25% a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, coloque el plato en una incubadora a 37 °C durante 1-3 minutos (min) y toque suavemente el plato para separar las células.
NOTA: La digestión prolongada afectará el perfil del SP debido a los cambios en viabilidad de la célula. - Agregue 3 mL de PBS suplementado con suero bovino fetal al 2% (FBS) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos para terminar la digestión y pipetear suavemente las células hacia arriba y hacia abajo 3-5x para dispersar los grupos celulares.
- Agregue 0.5 mL de suspensión celular a un pozo de una nueva placa de 6 pozos y examínese bajo un microscopio. Si se observan grupos celulares, pase la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μM.
Nota : se trata de un paso opcional. - Transfiera las células a un tubo centrífugo de 15 mL. Centrífuga de células a 200 x g durante 5 min a células de pellets. Retirar el sobrenadante y resuspend en 3 mL de PBS suplementado con 2% de FBS. Pipetear las células hacia arriba y hacia abajo 3-5x para mezclar a fondo.
- Recuentos de celdas
- Añadir 50 μL de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mezclarlo con una solución de 50 μL de tripano azul. Pipetee 10 μL de la mezcla para contar el número de células vivas utilizando un método estándar, como un hemocitómetro.
- Diluya las células en PBS complementado con FBS del 2% a una concentración final de 1 x 106 cells/mL. Añadir 1 mL de la suspensión celular a un tubo de ensayo redondo de poliestireno de 5 mL y preparar dos tubos de muestra.
2. Tinción celular con Hoechst 33342
- Añadir Hoechst 33342 a un tubo para alcanzar una concentración final adecuada.
NOTA: Por ejemplo, la concentración apropiada de Hoechst 33342 es de 3 μg/mL para las células MDA-MB-231. - Añadir un bloqueador (por ejemplo, Fumitremorgin C, Verapamil o Reserpina) a otro tubo a una concentración final adecuada e incubar el tubo a 37 °C durante 30 min antes de añadir la misma concentración de Hoechst 33342 como se describe en el paso 2.1.
NOTA: Para las células MDA-MB-231, el bloqueador apropiado es la reserpina (40 μM). La reserpina se utiliza como control de bloqueo para verificar la ausencia de células en el área cerrada del SP. - Prepare varios tubos que contengan células y agregue Hoechst 33342 a diferentes gradientes de concentración. Después de un ensayo de citometría de flujo, elija la concentración adecuada de acuerdo con el perfil y la proporción de SP.
Nota : éste es un paso opcional utilizado para definir la concentración adecuada de Hoechst 33342. - Prepare varios tubos que contengan células, agregue el bloqueador a diferentes gradientes de concentración, incube los tubos a 37 °C durante 30 min, luego agregue Hoechst 33342 a una concentración adecuada. Después del ensayo de citometría de flujo, elija la concentración adecuada de acuerdo con la ausencia de células en el área del SP cerrada.
NOTA: Este es un paso opcional utilizado para definir la concentración adecuada de bloqueador. - Coloque los tubos en una incubadora de 37 °C e incubarlos durante 60 min, agitando los tubos cada 10 min.
NOTA: Agitar los tubos a fondo es importante para la tinción, ya que asegura el contacto completo entre las células y el tinte para obtener mejores resultados de tinción. - Después de la incubación, centrifugar las células a 200 x g,4 °C durante 5 min, y aspirar el sobrenadante con cuidado, porque las células forman pellets muy sueltos e inestables.
- Resuspend las células de cada tubo en 1 mL de PBS helado complementado con FBS al 2% y pipetear las células hacia arriba y hacia abajo 3-5x para mezclar a fondo. Añadir 1 μL de 1 mg/mL de yoduro de propidio (PI) a la suspensión de cada tubo para identificar las células muertas.
NOTA: Todos los procedimientos en este paso deben realizarse a 4 °C para inhibir la emanación de Hoechst 33342 de las células tumorales. Los tubos deben estar protegidos de la exposición directa a la luz.
3. Análisis por citometría de flujo
NOTA: Las instrucciones para el uso del software del citómetro de flujo (ver Tabla de Materiales)se describen en esta sección y en las Figuras Suplementarias 1–10.
- En el software del citómetro de flujo, haga clic en el botón CARPETA. Haga clic en el botón Experimento y, a continuación, haga clic en Nuevo experimento (Figura suplementaria 1A,B).
- Haga clic en el botón Aceptar. "Experiment_001" aparecerá en la CARPETA (Figura suplementaria 2A,B).
- Haga clic en el botón Experiment_001 para cambiar el nombre de la carpeta a un nombre específico (por ejemplo, "20191118-SP"). Haga clic en Entrar. El nuevo nombre ("20191118-SP") aparecerá en CARPETA (Figura suplementaria 3A,B).
- Haga clic en el botón Nuevo espécimen para agregar un espécimen a la nueva carpeta del experimento ("20191118-SP"). Haga clic en el botón Nuevo tubo para añadir un tubo a la muestra. Haga clic en el botón Punta de flecha (Figura suplementaria 4A-C).
- Haga clic en el botón Parámetros y configure los parámetros del citómetro de flujo (Figura suplementaria 5).
- Utilice un espejo dicroico de 610 nm de paso corto (DMSP) para separar las longitudes de onda de emisión. Utilice un filtro BP de 450/20 nm para recoger la fluorescencia azul y un EFLP de 675 nm para recoger la fluorescencia roja.
NOTA: Hoechst 33342 se excita con un láser UV a 355 nm y PI se excita a 488 nm.
- Utilice un espejo dicroico de 610 nm de paso corto (DMSP) para separar las longitudes de onda de emisión. Utilice un filtro BP de 450/20 nm para recoger la fluorescencia azul y un EFLP de 675 nm para recoger la fluorescencia roja.
- Ejecute las muestras de células en el citómetro de flujo.
NOTA: Las células SP se pueden clasificar por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en condiciones estériles. Se debe recolectar un total de 100.000 a 500.000 células para los experimentos de seguimiento.- Ejecutar las células teñidas con Hoechst 33342 en el citómetro de flujo.
- Coloque tubos que contengan células teñidas con Hoechst 33342 en el citómetro.
- Haga clic en el botón Gráfica de puntos para mostrar la gráfica de puntos, luego haga clic en el eje X y estadámoslo en "FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "PI-A". Muestra la gráfica de puntos del área de pulsos de dispersión directa (FSC-A, eje X establecido en modo lineal) frente a la fluorescencia PI (eje Y establecido en escala logarítmica). Ajuste los voltajes para mostrar las células vivas en el lado derecho y las células no vivas, que están brillantemente manchadas con PI, en la esquina superior izquierda. Luego, establezca una puerta poligonal para excluir celdas muertas y escombros de celdas(Figura 1A)haciendo clic en el botón Puerta poligonal para bloquear el subconjunto P1, también conocido como subconjunto FSC-A, PI-A(Figura suplementaria 6A,B).
- Haga clic en el botón Gráfica de puntos para mostrar la gráfica de puntos, haga clic en el eje X y estadámoslo en "FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "FSC-W". Muestra la gráfica de puntos de FSC-A (eje X) versus ancho de pulso de dispersión directa (FSC-W, eje Y). Haga clic con el botón derecho en el trazado de puntos, haga clic en el botón P1 debajo del botón Mostrar poblaciones. Haga clic en el botón Puerta rectangular para crear una puerta rectangular para bloquear el subconjunto P2 (también conocido como subconjunto FSC-A, FSC-W). Esto excluirá las células con grandes volúmenes (Figura suplementaria 7A-C y Figura 1A).
- Haga clic en el botón Dot Plot para mostrar el punto plot, haga clic en el eje X y estadámoslo en "SSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "SSC-W". Muestra la gráfica de puntos del área de impulsos de dispersión lateral (SSC-A, eje X) frente al ancho del pulso de dispersión lateral (SSC-W, eje Y). Haga clic con el botón derecho en la gráfica de puntos y haga clic en el botón P2 en el botón Mostrar poblaciones. A continuación, haga clic en el botón Puerta rectangular para crear una puerta rectangular para bloquear el subconjunto P3 (también conocido como subconjunto SSC-A, SSC-W). Para ello se obtendrá una población celular con granularidad uniforme(Figura Suplementaria 8A-C y Figura 1A).
- Haga clic en el botón Dot Plot para mostrar el punto plot, haga clic en el eje X y estadázlo en "Hoechst Red-A"; haga clic en el eje Y y estadázlo en "Hoechst Blue-A". Muestra la gráfica de puntos de Hoechst Red-A (eje X) versus Hoechst Blue-A (eje Y). Haga clic con el botón derecho en el trazado de puntos, haga clic en el botón P3 debajo del botón Mostrar poblaciones. Haga clic en el botón Puerta del polígono para crear una puerta poligonal para bloquear el subconjunto P4 (también conocido como subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). Haga clic con el botón derecho en el diagrama de puntos y haga clic en el botón Mostrar jerarquía de población para mostrar la jerarquía de población.
NOTA: La gráfica de puntos mostrará tres poblaciones diferentes: 1) una población de fase G0-G1 cerca del centro de la gráfica; 2) una población de fase S-G2/M cerca de la esquina superior derecha; 3) el SP. A continuación, se realiza un registro del SP para su posterior análisis(Figura suplementaria 9A-D y Figura 1A). Si la gráfica de puntos de Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A no muestra un perfil SP similar al que se muestra en la Figura 1A,los voltajes deben ajustarse hasta que se vea un perfil similar. Mientras tanto, ajuste todas las puertas anteriores en consecuencia. - Después de determinar la región de la puerta de las celdas sp, haga clic en Adquirir datos para recopilar entre 20.000 y 100.000 eventos de cada muestra para analizar el porcentaje de celdas SP ( Figurasuplementaria 10).
- Ejecute las células teñidas de Hoechst 33342 tratadas con bloqueador en el citómetro de flujo.
- Coloque los tubos que contienen el molde en el citómetro y funcione las células usando los mismos voltajes y puertas para marcar más a fondo si los voltajes y las puertas se seleccionan apropiadamente.
NOTA: En comparación con la tinción hoechst 33342 sola, sólo una proporción muy pequeña de células, si las hay, debe aparecer en el área cerrada del SP (Figura 1B). - Recopile entre 20.000 y 100.000 eventos de cada muestra para analizar el porcentaje de células SP.
- Coloque los tubos que contienen el molde en el citómetro y funcione las células usando los mismos voltajes y puertas para marcar más a fondo si los voltajes y las puertas se seleccionan apropiadamente.
- Ejecutar las células teñidas con Hoechst 33342 en el citómetro de flujo.
4. Análisis de datos
NOTA: Las instrucciones para el uso del software de análisis de citometría de flujo (ver Tabla de Materiales)se describen en esta sección y en las Figuras Suplementarias 11–16.
- Copie los archivos en formato fcs a una computadora, abra el software de análisis de citometría de flujo y arrastre un archivo de muestra al software(Figura suplementaria 11A,B).
- Gate las células y obtener el porcentaje de células SP.
- Haga doble clic en este archivo de ejemplo,haga clic en el eje X y estadámoslo en"FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "PI-A". A continuación, cree una puerta poligonal y haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto FSC-A, PI-A (Figura suplementaria 12A-E).
- Haga doble clic en el archivo de subconjunto FSC-A, PI-A, haga clic en el eje X y estadámoslo en"FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "FSC-W". Luego, cree una puerta rectangular y haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto FSC-A, FSC-W (Figura suplementaria 13A-E).
- Haga doble clic en el archivo de subconjunto FSC-A, FSC-W, haga clic en el eje X y estadámoslo en"SSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "SSC-W". A continuación, cree una puerta rectangular y haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto SSC-A, SSC-W (Figura suplementaria 14A-E).
- Haga doble clic en el archivo de subconjunto SSC-A, SSC-W, haga clic en el eje X y estadázlo en "Hoechst Red-A"; haga clic en el eje Y y estadázlo en "Hoechst Blue-A". A continuación, cree una puerta poligonal y haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A (Figura suplementaria 15A-E).
- Abra el Editor de diseño haciendo clic en el botón Abrir editor de diseño. Arrastre el archivo de subconjunto SSC-A, SSC-W al Editor de diseño y, a continuación, haga clic en el botón Haga clic para guardar la ventana de diseño en archivo para guardar los resultados de la imagen ( Figurasuplementaria 16A-C).
- Guarde el espacio de trabajo para conservar la información de acceso al cerrar el software.
- Realice análisis de prueba t con software de análisis estadístico para comparar la diferencia entre dos grupos. Un valor de P < 0,05 fue definido como estadístico significativo.
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Representative Results
Cuatro análisis experimentales del SP fueron realizados según este método. En el primero, detectamos la proporción de células SP en MDA-MB-231, que es una triple negativa de la línea celular humana del cáncer de seno, en condiciones normales. Después del recuento celular, Hoechst 33342 se añadió en un tubo que contenía 1 x 106 células a una concentración final de 3 μg/mL. Reserpina y Hoechst 33342 se añadieron a otro tubo a concentraciones finales de 40 μM y 3 μg/mL, respectivamente. El PI fue agregado a ambos tubos. La gráfica de puntos de FSC-A (eje X) versus PI-A (eje Y) mostró tres poblaciones: 1) una población de células PI positivas, que representaba las células muertas; 2) restos celulares; y 3) la población principal fueron las células PI negativas, que fueron sometidas a análisis posteriores(Figura 1A,B). Para analizar la proporción de células(Figura 1A,B), se utilizó una población unicelular cerrada a partir de la gráfica de puntos de FSC-A (eje X) versus FSC-W (eje X) versus FSC-W (eje Y) y la gráfica de puntos de SSC-A (ejeY). Las células SP fueron cerradas de la gráfica de puntos de Hoechst Red-A (eje X) versus Hoechst Blue-A (eje Y), y su porcentaje fue de aproximadamente 0,9% en las células MDA-MB-231(Figura 1A). Sin embargo, la reserpina disminuyó en gran medida la proporción de células SP(Figura 1B),lo que apoya que la pintura de la puerta para sp es correcta.
El segundo experimento fue determinar la concentración de tinción adecuada de Hoechst 33342 en células MDA-MB-435. Después del conteo celular, Hoechst 33342 se añadió a 1 x10 6 células, que fueron suspendidas en 1 mL de PBS suplementadas con FBS al 2%, a diferentes gradientes de concentración, incluyendo 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 y 4 μg/mL. Como se muestra en la Figura 2A,cuando la concentración de Hoechst 33342 era demasiado baja (es decir, 0,5, 1, 1,5 μg/mL), era difícil distinguir las células SP de otras poblaciones celulares, porque muchas células estaban en un estado débilmente teñido. Cuando la concentración de Hoechst 33342 era demasiado alta (es decir, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL), la proporción de células SP disminuyó hasta que desapareció. Por lo tanto, 2 μg/mL Hoechst 33342 fue la mejor concentración para el análisis de SP en células MDA-MB-435. Además, para determinar el bloqueador adecuado para esta línea celular, hoechst 33342 y un bloqueador (verapamilo o reserpina) se añadieron a 1 x 106 células, que se suspendieron en 1 mL de PBS suplementados con 2% FBS, a concentraciones finales de 2 μg/mL y 40 μM, respectivamente. Como se muestra en la Figura 2B,alrededor del 0,4% de las células expulsaron el tinte después del tratamiento con verapamilo. Sin embargo, después del tratamiento con reserpina, la proporción disminuyó a aproximadamente 0,1% (Figura 2C). A partir de este experimento, reserpina se consideró un bloqueador más apropiado para esta línea celular.
En el tercer ejemplo, las células A549 (células humanas de la adenocarcinoma del pulmón) fueron pretratadas con el activador-ColivelinSTAT3 20 (100 nanómetro) por 48 horas (h). La vía de señalización STAT3 es importante para promover las características de lecimiento de las células tumorales21. Como se muestra en la Figura 3,la proporción de células SP aumentó tras la estimulación de colivelina.
En el último ejemplo, las células T47D (células de cáncer de mama humano) fueron pretratadas con 0,1 μM inhibidor de FRA1-SKLB816 (también llamado 13an) para 48 h22. FRA1 es un guardián reportado de la transición epitelial-mesenquimal (EMT) e implicado en la regulación de la tallo tumoral23. Como se muestra en la Figura 4,la proporción de células SP disminuyó debido al tratamiento del inhibidor de FRA1.
Figura 1: Estrategia de gating de células MDA-MB-231 en el análisis sp. (A)Estrategia de gating de células MDA-MB-231, que fueron teñidas con Hoechst 33342 (3 μg/mL) y yoduro de propidio (PI, 1 μg/mL). (B)Estrategia de gating de células MDA-MB-231, que fueron tratadas con Reserpina (40 μM) y teñidas con Hoechst 33342 (3 μg/mL) e IP (1 μg/mL). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Optimización de la concentración de Hoechst 33342 y selección del bloqueador en células MDA-MB-435. (A)Los resultados del análisis SP de células MDA-MB-435, que fueron teñidas con Hoechst 33342 (Hoechst) en diferentes gradientes de concentración (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL) junto con PI (1 μg/mL). (B)El resultado del análisis SP de las células MDA-MB-435, que fueron tratadas con verapamilo (40 μM) y teñidas con Hoechst 33342 (2 μg/mL) e IP (1 μg/mL). (C)El resultado del análisis SP de las células MDA-MB-435, que fueron tratadas con Reserpina (40 μM) y teñidas con Hoechst 33342 (2 μg/mL) e IP (1 μg/mL). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: La proporción de células SP fue mejorada por el activador STAT3 en las células A549. (A)Los resultados del análisis SP de células A549 pretratadas con activador STAT3-Colivelina (100 nM) o su control de vehículo (Ctrl)-H2O durante 48 h. Las células A549 tratadas con reserpina (45 μM) se utilizaron como control de bloqueo. Las células A549 se tiñeron con Hoechst 33342 (7 μg/mL) y PI (1 μg/mL). (B)Los resultados estadísticos de la proporción de células SP en células A549 tratadas con Colivelina (100 nM) y su control vehicular. Los datos se presentan como media + error estándar de la media (SEM), n = 3 para cada grupo. "*" indica P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: La proporción de células SP fue inhibida por el inhibidor de FRA1 en las células T47D. (A)Los resultados del análisis SP de células T47D pretratadas con SKLB816 (0,1 μM) o su control de vehículo (Ctrl)-DMSO durante 48 h. Las células T47D tratadas con reserpina (40 μM) se utilizaron como control de bloqueo. Las células T47D se tiñeron con Hoechst 33342 (8 μg/mL) y PI (1 μg/mL). (B)Los resultados estadísticos de la proporción de células SP en células T47D tratadas con SKLB816 (0,1 μM) y su control del vehículo. Los datos se presentan como media + SEM, n = 3 para cada grupo. "*" indica P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura suplementaria 1: Instrucciones para el paso número 3.1 del software del citómetro de flujo. (A) Haga clic en el botón CARPETA. (B) Haga clic en el botón Experimento y, a continuación, haga clic en el botón Nuevo experimento. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Instrucciones para el paso número 3.2 del software del citómetro de flujo. (A) Haga clic en el botón Aceptar. (B ) Experiment_001 aparece en la CARPETA. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 3: Instrucciones para el paso número 3.3 del software del citómetro de flujo. (A) Haga clic en el botón Experiment_001 para cambiar el nombre de Experiment_001 a un nombre específico (por ejemplo, "20191118-SP"). (B) Haga clic en el botón Entrar. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 4: Instrucciones para el paso número 3.4 del software del citómetro de flujo. (A) Haga clic en el botón Nuevo espécimen. (B) Haga clic en el botón Nuevo tubo. (C) Haga clic en el botón Punta de flecha. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 5: Instrucciones para el paso número 3.5 del software del citómetro de flujo. (A) Haga clic en el botón Parámetros para configurar los parámetros. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 6: Instrucciones para el paso de paso del software del citómetro de flujo 3.6.1.2. (A) Haga clic en el botón Gráfica de puntos para mostrar la gráfica de puntos, haga clic en el eje X y estadámoslo en "FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "PI-A". (B) Haga clic en el botón Puerta poligonal para crear una puerta poligonal para bloquear el subconjunto P1 (también conocido como FSC-A, subconjunto PI-A). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 7: Instrucciones para el paso de paso del software del citómetro de flujo 3.6.1.3. (A) Haga clic en el botón Gráfica de puntos para mostrar la gráfica de puntos, haga clic en el eje X y estadámoslo en "FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "FSC-W". (B) Haga clic con el botón derecho en el trazado de puntos y haga clic en el botón P1 en el botón Mostrar poblaciones. (C) Haga clic en el botón Puerta rectangular para crear una puerta rectangular para bloquear el subconjunto P2 (también conocido como subconjunto FSC-A, FSC-W). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 8: Instrucciones para el paso número de paso del software del citómetro de flujo 3.6.1.4. (A) Haga clic en el botón Gráfica de puntos para mostrar la gráfica de puntos, haga clic en el eje X y estadámoslo en "SSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "SSC-W". (B) Haga clic con el botón derecho en la gráfica de puntos y haga clic en el botón P2 debajo del botón Mostrar poblaciones . (C) Haga clic en el botón Puerta rectangular para crear una puerta rectangular para bloquear el subconjunto P3 (también conocido como subconjunto SSC-A, SSC-W). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 9: Instrucciones para el paso de paso del software del citómetro de flujo 3.6.1.5. (A) Haga clic en el botón Trazado de puntos para mostrar el trazado de puntos, haga clic en el eje X y estadázlo en "Hoechst Red-A"; haga clic en el eje Y y estadázlo en "Hoechst Blue-A". (B) Haga clic con el botón derecho en el trazado de puntos y haga clic en el botón P3 debajo del botón Mostrar poblaciones. (C) Haga clic en el botón Puerta poligonal para crear una puerta poligonal para bloquear el subconjunto P4 (también conocido como Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A subconjunto). (D) Haga clic con el botón derecho en la gráfica de puntos y, a continuación, haga clic en el botón Mostrar jerarquía de población para mostrar la jerarquía de población. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 10: Instrucciones para el número de paso del software del citómetro de flujo 3.6.1.6. (A) Haga clic en el botón Adquirir datos y, a continuación, recopile entre 20.000 y 100.000 eventos de cada muestra. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 11: Instrucciones para el software de análisis de citometría de flujo paso número 4.1. (A)Abra el software de análisis de citometría de flujo y arrastre un archivo de muestra en el software. (B) Se importa el archivo de ejemplo. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 12: Instrucciones para el software de análisis de citometría de flujo paso número 4.2.1. (A) Haga doble clic en este archivo de ejemplo. (B) Haga clic en el eje X y estadámoslo en "FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "PI-A". (C) Haga clic en el botón Crear una puerta poligonal para crear una puerta poligonal. (D) Haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto FSC-A, PI-A. (E)Se obtiene el subconjunto FSC-A, PI-A. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 13: Instrucciones para el software de análisis de citometría de flujo paso número 4.2.2. (A) Haga doble clic en el archivo subconjunto FSC-A, PI-A. (B) Haga clic en el eje X y estadárelo en "FSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "FSC-W". (C) Haga clic en el botón Crear una puerta rectangular para crear una puerta rectangular. (D) Haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto FSC-A, FSC-W. (E) Se obtiene el subconjunto FSC-A, FSC-W. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 14: Instrucciones para el software de análisis de citometría de flujo número de paso 4.2.3. (A) Haga doble clic en el archivo de subconjunto FSC-A, FSC-W. (B) Haga clic en el eje X y estadáclo en "SSC-A"; haga clic en el eje Y y estadámoslo en "SSC-W". (C) Haga clic en el botón Crear una puerta rectangular para crear una puerta rectangular. (D) Haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto SSC-A, SSC-W. (E) Se obtiene el subconjunto SSC-A, SSC-W. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 15: Instrucciones para el software de análisis de citometría de flujo paso número 4.2.4. (A) Haga doble clic en el archivo de subconjunto SSC-A, SSC-W. (B) Haga clic en el eje X y estadázlo en "Hoechst Red-A"; haga clic en el eje Y y estadázlo en "Hoechst Blue-A". (C) Haga clic en el botón Crear una puerta poligonal para crear una puerta poligonal. (D) Haga clic en el botón Aceptar para obtener el subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. (E) Se obtiene el subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 16: Instrucciones para el software de análisis de citometría de flujo paso número 4.2.5. (A ) Haga clic en el botón Abrir editor de diseño para abrir el editor de diseño. (B)Arrastre el archivo de ejemplo de subconjunto SSC-A, SSC-W al Editor de diseño. (C) Haga clic en el botón Haga clic para guardar la ventana de diseño en archivo para guardar los resultados de la imagen. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Hay varios puntos clave a tener en cuenta para el ensayo SP. La primera es la selección de un bloqueador adecuado, como verapamilo o reserpina, para cada línea celular, porque la ubicación de la "puerta" de las células SP se determina de acuerdo con la posición en la que un gran número de células SP desaparecen después de la adición del bloqueador. Para la línea celular MDA-MB-231, Reserpine funciona bien. Sin embargo, para otras líneas celulares, diferentes bloqueadores podrían funcionar mejor.
El segundo es la concentración de Hoechst 33342. El porcentaje de células SP aumentó a medida que la concentración de tinción de Hoechst 33342 disminuyó, como mostraron los datos representativos. Este fenómeno puede ser explicado por la cinética de absorción del tinte24. Los cambios en la concentración del tinte afectan el enriquecimiento de Hoechst 33342 en células. Por lo tanto, la concentración de tinción de Hoechst 33342 está estrechamente relacionada con los resultados del ensayo SP. Además, la absorción y expulsión de Hoechst 33342 varían entre los tipos de células. Por lo tanto, las concentraciones adecuadas de Hoechst 33342 deben explorarse para diferentes líneas celulares antes del análisis del SP.
El tercero es un buen coeficiente de variación (CV) del citómetro de flujo, que también es crítico para el análisis sp25. La potencia del láser UV es un criterio importante para mejorar los CV12. Este protocolo utiliza un citómetro de flujo comercial (ver Tabla de Materiales)para realizar el ensayo SP. En este instrumento de celda de flujo de cubeta, utilizamos el láser UV con una potencia de 15 mW para obtener los mejores CVs. En general, una potencia láser UV relativamente alta proporciona los CV óptimos. Por ejemplo, 50–100 mW proporcionan la señal óptima de Hoechst en instrumentos jet-in-air12. Algunos láseres proporcionan menor potencia UV, lo que puede reducir los CV. En estos casos, una buena alineación láser es crítica.
El último es la influencia de otros factores durante el experimento. El estado de la célula, la temperatura, el tiempo de tinción, el funcionamiento de la citometría de flujo y otros factores también pueden afectar la proporción y la calidad del ensayo sp. Por ejemplo, los cambios en la viabilidad celular durante la preparación de suspensiones celulares afectarán la proporción de células SP. Por lo tanto, es necesario explorar las mejores condiciones experimentales antes de realizar el análisis del SP. Teniendo en cuenta los factores anteriores, la relación SP de la misma línea celular medida por diferentes laboratorios puede ser diferente. Por ejemplo, se informó que las proporciones de células MDA-MB-231 y A549 eran ~0,1%–4,8%26,27,28,29 y ~0,8%–18%30,31,32,33,34,respectivamente.
Los investigadores pueden modificar este ensayo para diferentes aplicaciones, como el estudio de otras líneas celulares tumorales o células tumorales primarias derivadas de pacientes. Si el protocolo no funciona bien para las células que se están probando, los investigadores pueden utilizar las células MDA-MB-231 como control positivo y manchar las células siguiendo las especificaciones dadas. Debido a que este protocolo es muy sensible a la concentración de Hoechst 33342, la temperatura y el tiempo de tinción, etc., los investigadores deben verificar todas estas condiciones de cerca. El porcentaje de SP en muchos tipos de líneas celulares tumorales humanas es relativamente bajo (~ 0%–37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Si se observa un porcentaje excesivamente alto o bajo de SP, puede deberse a concentraciones inadecuadas de Hoechst 33342 o bloqueador utilizado. Si el problema parece estar relacionado con el citómetro de flujo, se debe obtener apoyo técnico.
Aunque el uso de SP para analizar y separar CSCs es altamente eficiente, todavía tiene ciertas limitaciones. La primera es su alta sensibilidad a las condiciones de tinción12. Muchos factores, como la concentración de Hoechst 33342, el estado de la célula, la temperatura, el tiempo de tinción, el funcionamiento de la citometría de flujo y la selección del bloqueador, pueden afectar la calidad del análisis de SP. El segundo es el efecto citotóxico de Hoechst 33342. Hoechst 33342 es un colorante de unión al ADN, pero es tóxico para las células cuando alcanza altas concentraciones y, por lo tanto, reduce la actividad celular37.
En resumen, el análisis del SP es uno de los métodos más de uso general estos últimos años para identificar y para purificar CSCs en variedades de células del tumor. Aunque el método tiene algunas limitaciones, en ausencia de marcadores de superficie específicos de CSCs, sigue siendo un método para el enriquecimiento conveniente, rápido y rentable de CSCs. Este método es beneficioso para el estudio de las funciones biológicas de las CSCs y para la identificación de marcadores superficiales específicos. Por otra parte, detectando los efectos de varias señales sobre el ratio del SP de células del tumor, puede proporcionar pistas al efecto regulador de estos caminos de la señal sobre características de CSCs, y facilitar el descubrimiento de los nuevos mecanismos, que pueden dirigir en última instancia la terapia apuntada de tumores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de China 81572599, 81773124 y 81972787; Natural Science Foundation of Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundamental Research Funds for the Central Universities, Nankai University 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
