Summary
提供了一种诱导红斑病的方案，即红细胞中程序化细胞死亡，使用碘化钙，碘霉素。通过监测膜外传单中的局部磷脂酰丝氨酸来评估成功的红斑狼疮。已经审查了影响协议成功的因素，并提供了最佳条件。
Abstract
红细胞病，红细胞程序性细胞死亡，发生在一些血液学疾病和红细胞损伤期间。红斑细胞的一个特征是细胞膜成分不对称的丧失，导致磷脂酰丝氨酸在膜外膜上的易位。这个过程是由Ca2+细胞内浓度的增加触发的，它激活scramblase，一种促进膜传单之间磷脂双向运动的酶。鉴于红斑病在各种疾病条件下的重要性，已经努力在体外诱导红斑狼疮。这些努力通常依靠电离钙，碘霉素，以提高细胞内Ca2+浓度和诱导红斑。然而，在文献中报告了许多关于使用碘霉素诱导红斑狼疮的程序的差异。在此，我们报告人类红细胞中碘霉素引起的红斑狼疮的分步方案。我们专注于该程序的重要步骤，包括电离物浓度、孵育时间和葡萄糖消耗，并提供具有代表性的结果。该协议可用于在实验室中可重复诱导红斑狼疮。
Introduction
红细胞中的程序性细胞死亡，也称为红斑病，在许多临床条件和血液学疾病中很常见。脂质增，与细胞收缩和细胞血浆膜1、2磷脂不对称的丧失有关。不对称性丧失导致磷脂酰丝氨酸（PS）的易位，这种脂质通常位于内侧传单3，4，到细胞外传单，信号到巨噬细胞到噬菌体和去除有缺陷的红细胞5，6，7，8。在红细胞正常寿命结束时，通过巨噬细胞去除红细胞可确保循环中的红细胞平衡。然而，在疾病条件下，如刀状细胞疾病和地中海贫血9，10，11，增强性红斑狼疮可能导致严重的贫血2。由于其在血液病学中的重要性，研究诱导或抑制红斑病的因素以及这一过程背后的分子机制具有极大的兴趣。
健康红细胞的血浆膜是不对称的，不同的磷脂在外部和内侧分布。膜不对称主要受膜酶作用的调节。氨磷脂转氯酶通过将这些脂质引导到细胞内部传单，促进氨磷脂、PS和磷脂酰胺（PE）的运输。另一方面，软体酶将含有磷脂、磷脂酰胆碱（PC）和斯芬戈米林（SM）的胆碱从细胞膜的内侧输送到外膜12。然而，与健康细胞不同，红斑红细胞的膜被搅乱。这是由于第三种酶，scramblase的作用，它通过促进氨磷脂的双向传输13，14，15，16破坏磷脂不对称。斯兰布拉斯由Ca2+细胞内水平升高激活。因此，促进Ca2+在细胞膜12间运输的电泳钙是红斑狼疮的有效诱因。
碘霉素，一种电磷钙，已广泛用于诱导红细胞12，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26的红斑狼疮。碘霉素同时具有亲水性和疏水性组，这些组是结合和捕获Ca2+离子，并将其输送到细胞空间27、28、29所必需的。这导致scramblase的激活和PS的易位到外传单，这可以很容易地检测使用附件-V，一种细胞蛋白与PS12高度亲和力。虽然通常报道用碘霉素引发红斑狼疮，但文献中存在相当大的方法差异（表1）。经历红斑狼疮的红细胞群取决于不同的因素，如电离度浓度、电离磷的治疗时间以及细胞外环境的糖含量（葡萄糖消耗激活阳离子通道，并便利Ca2+进入细胞空间）30，31。然而，这些因素在文献中几乎没有一致性，使得在体外难以进行红斑狼疮的排斥性。
在这个协议中，我们提出了一个分步程序，以诱导红细胞中的红细胞。检查影响成功红斑狼疮的因素，包括Ca2+浓度、电离浓度、治疗时间和葡萄糖耗尽缓冲液的预孵育，并报告最佳值。此过程表明，与含葡萄糖缓冲液相比，无葡萄糖缓冲液中红细胞的预孵育可显著增加红细胞分百分比。该协议可用于实验室生产各种应用的红细胞红细胞。
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Protocol
下文所述协议中使用的所有人体血液样本均作为去身份化样本购买。没有人类受试者直接参与或招募参与这项研究。在涉及人类研究时，应使用《赫尔辛基宣言》的指导方针。
1. 从全血分离的红细胞
- 将500μL全血加入酸锡酸盐Dextrose（ACD）（储存在4°C）到微离心管中。
注：全血是在ACD中购买的。据该公司称，1.5 mL的ACD被添加到7 mL的全血（8.5 mL总体积）。 - 在室温 （RT） 下，将全血在 700 x g下离心 5 分钟，并使用移液器去除透明血浆和薄薄的布漆，离开红红细胞层。
- 准备 1 L 的环塞溶液，包含 125 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO4、32mM HEPES、5 mM 葡萄糖和 1 mM CaCl2。通过添加 2 μL 下降 1.0 M NaOH，将 pH 值调整到 7.4。要制备无葡萄糖环铃溶液，请遵循相同的协议，但解决方案中不包括葡萄糖。
- 通过在 1.5 mL 的环压溶液中悬浮细胞颗粒，在 RT 处在 700 x g下离心 5 分钟，并去除上清液，将红细胞细胞在林格溶液中洗涤 2x。
- 在9，960μL无葡萄糖环压溶液中重新悬浮40μL的红细胞颗粒，使血球达到0.4%的血球，最终体积达到10 mL。
注：血红素是一个术语，用于指悬浮液中红细胞的体积分数。0.4% 血细胞是含有0.4%红细胞的悬浮液。 - 在37°C下孵育细胞悬浮液7天。
2. 用电霉素治疗红细胞和测量溶血
- 在630μL二甲基硫酸盐（DMSO）中溶解1毫克碘霉素钙盐，最终浓度达到2 mM。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
- 从步骤1.5中取取0.4%血液核酸的1 mL，加入0.5 μL的2 mM碘素，最终浓度达到1μM。在37°C下孵育2小时。
- 使用1 mL的造物素，不治疗碘霉素作为阴性对照。
- 在RT处将经700 x g处理的电霉素和未经处理的血球在RT上5分钟离心，并去除其上生子，将细胞颗粒留在管底。
- 将细胞颗粒悬浮在 1.5 mL 的环压溶液中，在 RT 处在 700 x g下离心 5 分钟，并丢弃上发物，用环林格溶液清洗细胞 3x。
- 为了测量溶化，从步骤1.5将未治疗的0.4%造细胞的1 mL添加到微离心管中，并在37°C下孵育2小时，作为溶化（0%）的负对照。
- 在RT处将未处理的0.4%血球从步骤1.5加入微离心管和离心机，在700 x g下5分钟，取出上清液，向细胞颗粒中加入1mlL蒸馏水，在37°C下孵育2小时，作为溶血的正对照（100%）。
- 从步骤2.2将1 mL的电霉素处理0.4%的造细胞添加到微离心管中。
- 在RT处，将未经处理的细胞、处理过的细胞和蒸馏水中的细胞在700 x g下离心5分钟。
- 取取200μL的超生物，并添加到96孔板中。
- 使用微孔板读片测量 541 nm 处的吸光度。
- 使用公式 132计算溶性：
%溶完 =（A T - A0）/（A100 - A 0）=100
其中 A0是林格溶液中红细胞的吸收率，A100是水中红细胞的吸收，AT是电霉素处理过的红细胞的吸收率。
3. 附件五结合测定
- 在8 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释5x附件五结合缓冲液的2 mL，以获得1x结合缓冲液。
- 在1x结合缓冲液的1mL中，从步骤2.4中重新悬浮经电霉素处理和未经处理的细胞颗粒。
- 在结合缓冲液中取取235μL的细胞悬浮液，并加入附件V-Alexa面粉488偶联15μL。
- 在黑暗的地方在RT孵育细胞20分钟。在 RT 下以 700 x g离心 5 分钟，并去除上清液。
- 用1x结合缓冲液清洗细胞2x，将细胞颗粒悬浮在结合缓冲液的1.5 mL中，在RT处在700 x g下离心5分钟，并去除上清液。
- 在 250 μL 的 1x 结合缓冲液中重新悬浮细胞颗粒，用于流式细胞测量。
4. 流式细胞测定
- 将附件-V染色红细胞的200 μL转移到1 mL圆形底部聚苯乙烯管中，与流动细胞学兼容。
- 登录到流式细胞测定软件，然后单击新的实验按钮。单击新的管按钮。选择全局表并选择应用分析以测量激发波长为 488 nm、发射波长为 530 nm 的荧光强度。
- 将要收集的细胞数设置为 20，000，以便进行荧光激活细胞分类 （FACS） 分析。
- 选择所需的管子，然后单击加载按钮。单击记录按钮进行正向散射和侧散射测量。对所有样本重复上述步骤。
- 右键单击试样按钮，然后单击应用批次分析以生成结果文件。
- 右键单击试样按钮，然后单击生成 FSC 文件。
- 将流式细胞测量数据 （FSC 文件） 添加到流式细胞测量软件的工作场所。
- 通过选择感兴趣的细胞群并添加红斑狼疮值的统计信息来分析控制数据。
- 双击控制并选择直方图与荧光强度。
- 单击门按钮在直方图上绘制一个门，指示红斑的百分比。
- 对所有其他实验管应用相同的统计数据，以获得红斑细胞生成值。右键单击控件并选择要分组的副本分析。
- 正确处理所有样本后，通过将分析的数据拖放到布局编辑器中来传输分析的数据。
- 在布局编辑器中使用控件覆盖分析的数据。
- 通过更改叠加图的 x 轴和 y 轴来设置所需的直方图和强度。
- 通过单击导出按钮导出图像文件，并将图形保存在所需位置。
5. 共聚焦显微镜
- 在显微镜幻灯片上转移5μL的附件-V染色细胞，用盖玻片盖住它。保持在黑暗的地方，以防止光漂白。
- 使用共聚焦荧光显微镜的 Argon 激光观察在 488 nm 处激发的细胞，并具有所需的放大倍率。
注：不一定需要共聚焦显微镜，任何具有荧光功能的显微镜都可用于获得显示附件-V结合的荧光图像。 - 获取对照细胞（未处理细胞）和治疗细胞的荧光图像。
注：未经处理的细胞应显示非常弱的荧光信号，而经过处理的细胞在膜上应显示明亮的绿色荧光。
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Representative Results
碘霉素浓度的优化
虽然用碘霉素来诱发红斑狼疮，但增加的碘霉素浓度可导致溶血（即红细胞的溶化和血红蛋白的释放），需要避免。在林格溶液中用1μM电霉素治疗红细胞2小时足以诱发红斑狼疮，通过FACS分析（图1A）成功贴标附件-V Alexa面粉488结合和定量就证明了这一点。碘霉素浓度越高（5和10 μM）会导致红斑狼疮略有增加（图1A-D）。然而，这种浓度也增强了溶酶（图1E），这是不需要的。为了保持低于5%的溶化，应使用1μM电霉素。
碘霉素的治疗时间
在林格溶液中用电霉素孵育红细胞，只需30分钟，就足以诱发红斑狼疮（图2A）。增加的孵育时间增加了红斑狼疮的水平，如附件五结合测定，长达2小时（图2B，C）。然而，进一步的孵育时间导致红斑疮水平略有下降（图2D）。使用1μM电霉素治疗2小时后获得最大红斑狼疮，在所有其他治疗时间，获得下红斑血化（图2E）。具有代表性的流式细胞直方图如图2A-D所示。此外，在1μM碘霉素的各种治疗时间中，红斑和溶血的平均百分比分别出现在图2E和图2F中。180分钟后溶血值较高，说明在相同数量的孵育量（图2E）后，红细胞减少，因为使用碘霉素治疗180分钟后存在不太可行的细胞。
此外，对低浓度的碘霉素（包括0、0.25、0.5和1μM）的细胞进行治疗，治疗时间更长，包括6小时和12小时，并测量了红斑狼疮（图3）。与使用1μM碘霉素治疗的细胞相比，使用1μM碘霉素治疗的细胞（图3）在6和12小时下处理，其浓度低于1μMM，显示红斑狼疮较低。由于降低浓度和增加暴露时间不会增强红斑，1 μM用于触发红细胞增多。
依不上素取决于孵育时间和细胞外葡萄糖浓度
细胞外葡萄糖浓度影响过程的结果。当红细胞在无葡萄糖环合溶液中预孵育时，与含葡萄糖环状溶液相比，在孵育1μM碘霉素2小时之前，观察到较高的红斑化值。在这两种溶液的预孵育7天后，获得最高的红斑狼疮值。然而，在无葡萄糖环状溶液中预孵育后，红斑比正常环状溶液（含有5 mM葡萄糖）更高（参见图4A，说明代表性图，图4B用于全球手段的比较）。此外，正向散射直方图表明葡萄糖消耗对红细胞收缩的影响（图5A-D）。正向散射是基于光折射的细胞大小的度量，光散射水平与细胞大小成正比33。与在含葡萄糖缓冲液中孵育的细胞相比，在无葡萄糖环状溶液中孵育的细胞具有较少的前部散射（图5E），表明无葡萄糖环境中的细胞收缩。
除了流式细胞测量外，在共聚焦荧光显微镜下观察细胞以确认红斑。无治疗（图6A）和碘霉素治疗（图6B）的红细胞被标记为附件-V Alexa面粉488结合，并在显微镜下观察。由于外片中附件-V与PS结合，处理后细胞表现出明亮的荧光信号（图6B）。相比之下，没有治疗的细胞表现出非常弱的荧光信号（图6A），表明红斑狼疮非常低。图6C显示了标有附件-V的红斑红细胞与高荧光信号的进一步示例图像。
图1：各种碘霉素浓度对红斑狼疮和溶血作用的代表性图表。用 （A） 1 μM、 （B） 5 μM 和 （C） 10 μM 碘霉素 （灰色） 在 37°C 下在环状溶液中 0.4% 血球基进行 2 h 治疗的红细胞细胞直方图 2h. 黑线表示未经处理的细胞。每个图中都显示红斑的百分比。使用附件-V结合测量磷脂酰丝氨酸暴露。（D） 算术手段 = 在相同条件下用不同浓度的电霉素处理不同浓度的细胞的百分比促红细胞的百分比，以及 （E） 算术手段 = 不同浓度的碘化细胞的血细胞的 SD （n = 3） 溶血。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：各种碘霉素治疗时间对红斑狼疮的影响的代表性数字。在37°C下用1μM电霉素（灰色）处理的红细胞直方图为（A）30分钟，B）60分钟，（C）120分钟，以及（D）180分钟，在林格溶液中为0.4%血红细胞。黑线表示未经处理的细胞。每个图中都显示红斑的百分比。通过附件-V结合测量磷脂酰丝氨酸暴露。（E） 算术意味着不同时间用 1 μM 碘霉素治疗的细胞的百分比红细胞的 SD （n = 3） 的百分比。最高红斑狼疮是在120分钟治疗后获得的。（F） 算术意味着不同时间使用 1 μM 碘霉素治疗的细胞的百分比溶血率的 SD （n = 3）。进行统计分析时，使用Kruskal-Wallis测试进行了单向非参数方差分析，120分钟处理后的红斑狼疮明显高于面板E.*所示的P<0.05。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：各种碘霉素浓度和治疗时间对红斑狼疮的影响。算法意味着不同浓度的碘霉素治疗的细胞的百分比的SD（n = 3）在不同治疗时间后显示。这些细胞用低浓度的碘霉素进行治疗，包括0、0.25、0.5和1μM，用于较长的接触（6小时和12小时）。较高的浓度和更长的治疗导致更高的红斑细胞生成值。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：能量消耗对红斑狼疮的影响。（A） 在无葡萄糖环合溶液（上图）和环合溶液（下图）中预孵育1至7天后，在37°C下用1μM电霉素（灰色）处理的红细胞细胞直方图为2小时，在0.4%的血红细胞中预孵育，在1至7天内，能量消耗促进红细胞异质症。黑线表示未经处理的细胞。每天的图表中显示了红斑狼疮的百分比。（B） 算术手段 = 在环状溶液（黑条）和无葡萄糖环状溶液（白条）中预孵化后，在 37°C 下用 1 μM 电霉素处理的红细胞的百分比红细胞的百分比，在 0.4% 血红蛋白下进行 2 小时。"请点击此处查看此图的较大版本。
图5：能量消耗对细胞大小的影响。在无葡萄糖环状溶液（灰色）和环状溶液（黑线）中预孵育后，在37°C下用1μM电霉素处理的红细胞的正向散射直方图为2小时，在0.4%血红细胞下，预孵育后为1天，（B）3天，C）5天，和（D）7天。随时间推后散射直方图表明无葡萄糖缓冲液中的红细胞收缩。（E） 算术意味着在环线溶液（黑条）和无葡萄糖环线溶液（白条）中预孵化1至7天后，在37°C下用1μM电霉素处理的红细胞的正向散射强度为2小时，在0.4%血红蛋白下进行2小时。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：用（A）0 μM、（B）和（C）1μM碘霉素在37°C处处理的红细胞共荧光显微镜图像，在0.4%血红素下2小时。40倍物镜放大率用于面板A和B的图像，100倍物镜放大率用于在细胞膜内膜上拍摄健康红细胞中C.PS的面板图像，因此面板A中没有荧光信号。在B组和C细胞中，红细胞被诱导为红斑病，并且由于附件V与PS的结合，其荧光信号被转移至细胞膜的外部。请点击此处查看此图的较大版本。
| 细胞密度/血球 | 碘霉素浓度 | 缓冲区 | 孵化前 | 碘霉素的治疗时间 | 检测方法 | 参考 |
| 1.65 x 108细胞/mL | 0.3 mM | 缓冲区 A* | 缓冲 A 中为 36 小时 | 1 小时 | 附件五 | 12 |
| 0.40% | 1 mM | 环铃器解决方案 | 48 小时在林格 | 1 小时 | 附件五 | 17 |
| 50% | 10 mM | 缓冲区 B* | - | 3 小时 | 梅罗西亚宁 540 | 18 |
| 0.40% | 1 mM | 环铃器解决方案 | 48 小时在林格 | 1 小时 | 附件五 | 19 |
| 0.40% | 1 mM | 环铃器解决方案 | 48 小时在林格 | 1 小时 | 附件五 | 20 |
| 2% | 1 mM | 环铃器解决方案 | - | 4 小时 | 附件五 | 21 |
| 0.40% | 1 mM | 环铃器解决方案 | - | 0.5 小时 | 附件五 | 22 |
| 10% | 1 mM | 环铃器解决方案 | - | 3 小时 | 附件五 | 23 |
| 0.40% | 10 mM | 环铃器解决方案 | - | 0.5 小时 | 附件五 | 24 |
| 0.40% | 1 mM | 环铃器解决方案 | 48 小时在林格 | 0.5 小时 | 附件五 | 25 |
| 2 x 106细胞/mL | 1 mM | HEPES缓冲盐水 （HBS） | - | 0.5 小时 | 附件五 | 26 |
| *缓冲 A： 10 mM HEPES， 150 mM NaCl， 5 mM KCl， 1 mM MgCl2+6H2O， 10 mM 葡萄糖， 和 1.8 mM CaCl2+2H2O | ||||||
| *缓冲液 B：5 mM Tris、100 mM KC1、60 mM NaCl 和 10 mM 葡萄糖 | ||||||
表1：文献中用于诱导使用碘霉素诱发红斑狼疮的各种协议。
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Discussion
此过程的目标是为电离磷浓度、治疗时间和细胞外葡萄糖浓度提供最佳值，这是确保成功诱导红斑气的重要因素。该协议的一个关键步骤是细胞外葡萄糖的耗竭，尽管其重要性，但文献中并未充分强调这一点。正常环状溶液（5 mM）中的糖含量对红斑酶有抑制作用。细胞外环境中的葡萄糖消耗会诱发细胞压力并激活蛋白激酶C（PKC），从而激活钙和钾通道。这导致Ca2+在细胞体空间30，31，34的进入增加，并最终激活scramblase16，这增加了红斑。钾通道的激活也会导致氯化钾从细胞中渗出，从而导致红细胞收缩35。
上述程序需要特别注意溶化。重要的是使用优化的电泳浓度，其浓度足够高，可诱发红斑狼疮，低到足以防止溶血。同样，用电霉素短期孵育红细胞会导致低红斑狼疮，而长时间的孵育可能导致细胞膜紊乱和溶血。还应注意的是，虽然在同一红细胞样本上执行时，所呈现的协议非常可靠，但来自不同个体的细胞对碘霉素的反应不同，并且不同样本之间可能存在受试者间变异。
应特别注意流式细胞学的数据分析。从流动细胞仪获得的红细胞分百分比表示其外部传单上带有PS的细胞群的百分比。然而，不能根据这个数字区分附件-V结合强度不同的细胞。附件-V与细胞表面暴露的PS结合，具有非常高的亲和力和高特异性PS 36，37，38 。然而，如本报告的显微镜图像所示，不同的细胞在附件-V结合强度方面存在差异。膜上PS值低的细胞荧光强度较低，而细胞膜上PS占用率越高，荧光强度越高。
通过增加细胞外Ca2+浓度，可以修改本文提出的方案。在本协议中，碘霉素在1 mM CaCl2存在的情况下用于诱导红斑狼疮;较高的Ca2+浓度可能导致细胞内钙水平升高，并可能诱发更多的红斑狼疮。此外，与碘霉素相比，不同的电泳钙（如选择磷和钙霉素）在增强Ca2+细胞内浓度方面可能具有不同的能力，并可能导致不同的红斑细胞分值。然而，红细胞的一致红斑病可以通过电离霉素与概述的协议来实现，并可用于实验室检查红斑的分子机制，模拟疾病条件39，40体外，并筛选潜在的治疗抑制红斑病，以及其他应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH授予R15ES030140和NSF授予CBET1903568的支持。来自罗斯工程技术学院和俄亥俄州立大学化学和生物分子工程系的财政支持也得到了认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-565-331 | |
| Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit | Fisher Scientific | A10788 | Store at 4 °C |
| BD FACSAria II flow cytometer | BD Biosciences | 643177 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Centrifuge | Millipore Sigma | M7157 | Model Eppendorf 5415C |
| Confocal fluorescence microscopy | Zeiss, LSM Tek Thornwood | Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images | |
| Cover glasses circles | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Disposable round bottom flow cytometry tube | VWR | VWRU47729-566 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-100ML | |
| DPBS | VWR Life Science | SH30028.02 | |
| Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0001745 | |
| HEPES Buffer (1 M) | Fisher Scientific | 50-751-7290 | Store at 4 °C |
| Ionomycin calcium salt | EMD Milipore Corp. | 407952-1MG | Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C |
| KCl | Fisher Scientific | P330-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-5 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Synergy HFM microplate reader | BioTek | ||
| Whole blood in ACD | Zen-Bio | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
References
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