Summary
Een protocol voor de inductie van eryptosis, geprogrammeerde celdood in erytrocyten, met behulp van het calcium ionophore, ionomycine, wordt verstrekt. Succesvolle eryptosis wordt geëvalueerd door het monitoren van de lokalisatie fosfatidylserine in de buitenste bijsluiter van het membraan. Factoren die van invloed zijn op het succes van het protocol zijn onderzocht en optimale omstandigheden geboden.
Abstract
Eryptosis, erytrocyten geprogrammeerde celdood, treedt op in een aantal hematologische ziekten en tijdens letsel aan erytrocyten. Een kenmerk van de eryptotische cellen is het verlies van compositorische asymmetrie van het celmembraan, wat leidt tot de translocatie van fosfatidylserine naar de buitenste bijsluiter van het membraan. Dit proces wordt veroorzaakt door verhoogde intracellulaire concentratie van CA2 +, die activeert scramblase, een enzym dat bidirectionele beweging van fosfolipiden tussen membraan folders vergemakkelijkt. Gezien het belang van eryptosis in verschillende zieke omstandigheden, zijn er inspanningen gedaan om de eryptosis in vitrote induceren. Dergelijke inspanningen hebben zich over het algemeen gebaseerd op het calcium-ionophore, ionomycine, om de intracellulaire CA2 + -concentratie te verbeteren en eryptosis te induceren. Echter, veel discrepanties zijn gemeld in de literatuur met betrekking tot de procedure voor het induceren van eryptosis met behulp van ionomycine. Hierin rapporteren we een stap-voor-stap protocol voor ionomycine-geïnduceerde eryptosis in menselijke erytrocyten. We richten ons op belangrijke stappen in de procedure, waaronder de ionofiele concentratie, incubatietijd en glucose depletie, en geven representatief resultaat. Dit protocol kan worden gebruikt voor het reproduceren van eryptosis in het laboratorium.
Introduction
Geprogrammeerde celdood in erytrocyten, ook bekend als eryptosis, is gebruikelijk in vele klinische aandoeningen en hematologische aandoeningen. Eryptosis wordt geassocieerd met celkrimp en het verlies van fosfolipide asymmetrie in de cel plasma membraan1,2. Verlies van asymmetrie resultaten in de translocatie van fosfatidylserine (PS), een lipide normaal gelokaliseerd in de binnenste bijsluiter3,4, naar de buitenste bijsluiter van de cel, die signalen naar macrofagen aan fagocytose en verwijderen defecte erytrocyten5,6,7,8. Aan het einde van de normale levensduur van erytrocyten zorgt het verwijderen van eryptotische cellen door macrofagen voor het evenwicht van erytrocyten in omloop. Echter, in zieke omstandigheden, zoals sikkelcelziekte en thalassemie9,10,11, verbeterde eryptosis kan resulteren in ernstige anemie2. Vanwege het belang in hematologische ziekten, is er belangrijke belangstelling voor het onderzoeken van de factoren inducerende of remmende eryptosis en de moleculaire mechanismen die aan dit proces ten grondslag liggen.
Het plasma membraan van gezonde erytrocyten is asymmetrisch, met verschillende fosfolipiden lokaliseren op de buitenste en binnenste folders. Membraan asymmetrie wordt voornamelijk gereguleerd door de werking van membraan enzymen. Aminopfosfolipide translocase vergemakkelijkt het transport van aminophospholipiden, PS en fosfatidylethanolamine (PE), door deze lipiden naar de binnenste folder van de cel te sturen. Aan de andere kant, floppase vervoert de choline met fosfolipiden, dunlaag (PC) en sphingomyelinase (SM), van de binnenste naar de buitenste bijsluiter van de cel membraan12. Echter, in tegenstelling tot gezonde cellen, het membraan van eryptotic erytrocyten is vervormd. Dit komt door de werking van een derde enzym, scramblase, dat de fosfolipide asymmetrie verstoort door het bidirectionele transport van aminophospholipiden13,14,15,16te vergemakkelijken. Scramblase wordt geactiveerd door verhoogde intracellulaire niveaus van CA2 +. Daarom zijn calcium-ionoforen, die het transport van CA2 + over het celmembraan12faciliteren, efficiënte inductoren van eryptosis.
Ionomycine, een calcium-ionophore, is op grote schaal gebruikt voor het opwekken van eryptosis in erytrocyten12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycine heeft zowel hydrofiele als hydrofobe groepen, die nodig zijn om ca2 + Ion te binden en te vangen, en deze te transporteren naar de cytosolische ruimte27,28,29. Dit leidt tot de activering van de scramblase en translocatie van PS naar de buitenste bijsluiter, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd met behulp van annexin-V, een cellulair eiwit met een hoge affiniteit voor PS12. Hoewel het triggeren van eryptosis door ionomycine vaak wordt gerapporteerd, is er een aanzienlijke methode discrepantie in de literatuur (tabel 1). De populatie van erytrocyten die eryptosis ondergaan, hangt af van verschillende factoren zoals ionofiele concentratie, behandelingstijd met ionofoor, en het suikergehalte van extracellulaire omgeving (glucose depletie activeert catie kanalen en vergemakkelijkt de intrede van CA2 + in de cytosolische ruimte)30,31. Er is echter weinig consistentie in deze factoren in de literatuur, waardoor het moeilijk is om eryptosis reproductief in vitrouit te voeren.
In dit protocol presenteren we een stapsgewijze procedure voor het opwekken van eryptosis in menselijke erytrocyten. Factoren die van invloed zijn op succesvolle eryptosis, waaronder CA2 + concentratie, ionofiele concentratie, behandelingstijd, en pre-incubatie in glucose-verarmd buffer worden onderzocht en optimale waarden worden gerapporteerd. Deze procedure toont aan dat de pre-incubatie van erytrocyten in een glucose vrije buffer het percentage van de eryptosis aanzienlijk verhoogt in vergelijking met de glucose-bevattende buffer. Dit protocol kan in het laboratorium worden gebruikt om eryptotische erytrocyten te produceren voor verschillende toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menselijke bloedmonsters die in het hieronder beschreven protocol worden gebruikt, werden als niet-geïdentificeerde monsters aangekocht. Voor deze studie waren geen menselijke proefpersonen rechtstreeks betrokken of geworven. De richtsnoeren van de verklaring van Helsinki moeten worden gebruikt wanneer onderzoek betrekking heeft op menselijke proefpersonen.
1. isolatie van erytrocyten uit volbloed
- Voeg 500 μL volbloed in zuurcitraat dextrose (ACD) (opgeslagen bij 4 °C) toe aan een micro centrifugebuis.
Let op: volbloed werd gekocht in ACD. Volgens het bedrijf wordt 1,5 mL ACD toegevoegd aan 7 mL volbloed (8,5 mL totaal volume). - Centrifugeer het hele bloed bij 700 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en verwijder het heldere plasma en de dunne buffy coat met behulp van een pipet om de rode erytrocyten laag te verlaten.
- Bereid 1 L Ringer oplossing met 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mm Hepes, 5 mm glucose en 1 mm CACL2. Pas de pH op 7,4 door 2 μL druppels van 1,0 M NaOH toe te voegen. Om glucose-vrije Ringer-oplossing te bereiden, volg dan hetzelfde protocol, maar neem geen glucose in de oplossing.
- Was de erytrocyten 2x in beltoon oplossing door de celpellet in 1,5 mL Ringoplossing te schorsen, centrifugeren bij 700 x g gedurende 5 minuten bij RT, en het verwijderen van het supernatant.
- Maak een 0,4% hematocriet door 40 μL van de erytrocyten pellet opnieuw op te schorten in 9.960 μL glucose vrije Ringer-oplossing om een eindvolume van 10 mL te bereiken.
Opmerking: hematocriet is een term die wordt gebruikt om te verwijzen naar de volumefractie van erytrocyten in suspensie. Een 0,4% hematocriet is een suspensie met 0,4% erytrocyten. - Inincuberen van de celsuspensie bij 37 °C gedurende 7 dagen.
2. behandeling van erytrocyten met ionomycine en meting van hemolyse
- Los 1 mg ionomycine calciumzout op in 630 μL dimethylsulfoxide (DMSO) om een eindconcentratie van 2 mM te bereiken. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
- Neem 1 mL van de 0,4% hematocriet uit stap 1,5 en Voeg 0,5 μL van 2 mM ionomycine toe om een eindconcentratie van 1 μM te bereiken. Inbroed voor 2 uur bij 37 °C.
- Gebruik 1 mL van de hematocriet zonder ionomycine behandeling als een negatieve controle.
- Centrifugeer de met ionomycine behandelde en onbehandelde hematocrits op 700 x g gedurende 5 minuten bij RT, en verwijder hun supernatanten om de celpellets aan de onderkant van de buizen te laten.
- Was de cellen 3x met Ringer oplossing door de celpellets op te schorten in 1,5 mL Ringer oplossing, centrifugeren bij 700 x g gedurende 5 minuten bij RT en het verwijderen van de supernatants.
- Voor het meten van hemolyse, voeg 1 mL van de onbehandelde 0,4% hematocriet uit stap 1,5 toe aan een micro centrifugebuis en inincuberen voor 2 uur bij 37 °C als de negatieve controle voor hemolyse (0%).
- Voeg 1 mL van de onbehandelde 0,4% hematocriet van stap 1,5 toe aan een micro centrifugebuis en centrifugeer bij 700 x g gedurende 5 min bij RT. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml gedestilleerd water toe aan de celpellet en inincuberen voor 2 uur bij 37 °c als de positieve controle voor hemolyse (100%).
- Voeg 1 mL van de met ionomycine behandelde 0,4% hematocriet van stap 2,2 toe aan een micro centrifugebuis.
- Centrifugeer de onbehandelde cellen, behandelde cellen en de cellen in gedestilleerd water bij 700 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Neem 200 μL van de supernatanten en voeg toe aan een 96-well plaat.
- Meet de extinctie bij 541 nm met behulp van een microplaat lezer.
- Bereken de hemolyse met behulp van vergelijking 132:
% Hemolyse = (AT -a0)/(a100 -a0) * 100
waar een0 de extinctie is van erytrocyten in beltoon oplossing, is een100 de absorptie van erytrocyten in water, en eenT is de extinctie van behandelde erytrocyten door ionomycine.
3. de bindende bepaling van annexin-V
- Verdun 2 mL van de 5x annexin V-bindings buffer in 8 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om 1x bindings buffer te verkrijgen.
- Rebreng de met ionomycine behandelde en onbehandelde celpellets uit stap 2,4 in 1 mL 1x bindings buffer.
- Neem 235 μL van de celsuspensies in de bindings buffer en voeg 15 μL Annexin V-Alexa meel 488 geconjugeerde toe.
- Inincuberen de cellen op RT gedurende 20 minuten op een donkere plaats. Centrifugeer bij RT 700 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Was de cellen 2x met 1x bindings buffer, door de celpellet in 1,5 mL van de bindings buffer op te schorten, centrifugeren bij 700 x g gedurende 5 minuten bij RT en het verwijderen van het supernatant.
- Respendeer de celpellets in 250 μL van 1x bindings buffer voor Flowcytometrie metingen.
4. stroom cytometrie
- Breng 200 μL van de annexin-V gekleurd erytrocyten naar 1 mL ronde bodem polystyreen buizen compatibel met Flow cytometrie.
- Meld u aan bij de flow flowcytometrieonderzoeken-software en klik op de knop Nieuw experiment . Klik op de knop nieuwe Tube . Selecteer het globale blad en kies de analyse toepassen om de intensiteit van de fluorescentie te meten met een excitatie golflengte van 488 nm en een emissie golflengte van 530 nm.
- Stel het aantal cellen in op 20.000 om te worden verzameld voor analyse van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
- Selecteer de gewenste buis en klik op de knop laden . Klik op de knop opnemen voor forward Scatter en side Scatter metingen. Herhaal dit voor alle samples.
- Klik met de rechtermuisknop op de specimen knop en klik op batchanalyse toepassen om het resultaat bestand te genereren.
- Klik met de rechtermuisknop op specimen knop en klik op Genereer FSC-bestanden.
- Voeg de flow flowcytometrieonderzoeken-gegevens (FSC-bestanden) toe aan de werkplek van flow-cytometrie-software.
- Analyseer de controlegegevens door de celpopulatie van belang te selecteren en statistieken toe te voegen voor de waarde van de eryptosis.
- Dubbelklik op besturing en selecteer histogram versus intensiteit fluorescentie.
- Klik op de knop Gate om een poort op het histogram te tekenen die het percentage van de eryptosis aangeeft.
- Pas dezelfde statistieken toe voor alle andere experimentele buizen om de eryptosis-waarden te verkrijgen. Klik met de rechtermuisknop op Control en selecteer analyse kopiëren naar groep.
- Nadat u alle voorbeelden correct hebt uitgevoerd, zet u de geanalyseerde gegevens over door ze naar de lay-outeditor te slepen en neer te zetten.
- Overlay de geanalyseerde gegevens met Control in layout editor.
- Stel de gewenste histogrammen en intensiteiten in door de x-en y-as van de overlegde grafieken te wijzigen.
- Exporteer afbeeldingsbestanden door op de knop exporteren te klikken en de grafieken op de gewenste locatie op te slaan.
5. confocale microscopie
- Breng 5 μL annexin-V-gekleurd cellen op een Microscoop-dia over en dek deze af met een Afdekstrook. Op een donkere plaats bewaren om fotobleking te voorkomen.
- Gebruik de argon-Laser van de confocale fluorescentiemicroscoop om de cellen te observeren die opgewonden zijn op 488 nm met de gewenste vergroingen.
Opmerking: een confocale Microscoop is niet noodzakelijk nodig en elke microscoop met fluorescentie mogelijkheden kan worden gebruikt om fluorescentie beelden te verkrijgen die annexin-V binding aantonen. - Verkrijgen van fluorescentie beelden van de controle (niet-behandelde cellen) en behandelde cellen.
Opmerking: niet-behandelde cellen worden geacht zeer zwakke fluorescentie signalen te vertonen, terwijl de behandelde cellen naar verwachting helder groene fluorescentie op hun membranen vertonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimalisatie van de ionomycine concentratie
Hoewel ionomycine nodig is om eryptosis te induceren, kunnen verhoogde ionomycine concentraties leiden tot hemolyse (d.w.z. Lysis van erytrocyten en afgifte van hemoglobine), die vermeden moet worden. Behandeling van erytrocyten met 1 μM ionomycine in Ringer-oplossing voor 2 uur volstaat om eryptosis te induceren, zoals blijkt uit succesvolle labeling met annexin-V Alexa Flour 488 geconjugeerde en kwantificering per FACS analyse (Figuur 1A). Hogere concentraties van ionomycine (5 en 10 μM) resulteren in een lichte toename van de eryptosis (Figuur 1a-D). Dergelijke concentraties verbeteren echter ook hemolyse (Figuur 1E), wat niet gewenst is. Om onder de 5% hemolyse te blijven, dient 1 μM ionomycine te worden gebruikt.
Behandelingstijd met ionomycine
Incubatie van erytrocyten met ionomycine in Ringer oplossing voor zo weinig als 30 min is genoeg om eryptosis te induceren (Figuur 2A). Verhoogde incubatietijd verhoogt het niveau van de eryptosis, gemeten door de annexin V-binding Assay, voor maximaal 2 uur (Figuur 2B, C). Verdere incubatietijd resulteert echter in een lichte afname van het niveau van de eryptosis (Figuur 2D). Maximale eryptosis werd verkregen na 2 uur behandeling met 1 μM ionomycine, en voor alle andere behandelingstijden werd een lagere eryptosis verkregen (Figuur 2E). Representatieve flow cytometrie histogrammen worden weergegeven in Figuur 2A-D. Bovendien worden het gemiddelde percentage eryptosis en hemolyse, voor verschillende behandelingstijden met 1 μM ionomycine, weergegeven in Figuur 2E respectievelijk Figuur 2F. De hogere waarde van hemolyse na 180 min verklaart de afname van de eryptosis na dezelfde hoeveelheid incubatie (Figuur 2E) omdat er minder levensvatbare cellen bestaan op 180 min van de behandeling met ionomycine.
Bovendien werden cellen behandeld met lage concentraties ionomycine, waaronder 0, 0,25, 0,5 en 1 μM voor langere behandelingstijden, waaronder 6 en 12 uur, en eryptosis werd gemeten (Figuur 3). Cellen die behandeld werden met ionomycine concentraties lager dan 1 μM voor 6 en 12 uur vertonen een lagere eryptosis vergeleken met de cellen behandeld met 1 μM ionomycine (Figuur 3). Aangezien het verminderen van de concentratie en het verhogen van de blootstellingstijd niet eryptosis vergroot, werd 1 μM gebruikt om de eryptosis te triggeren.
De eryptosis is afhankelijk van de incubatietijd en de extracellulaire glucoseconcentratie
Extracellulaire glucoseconcentratie beïnvloedt de uitkomst van het proces. Hogere eryptosis-waarden worden waargenomen wanneer erytrocyten vooraf worden geïnincubeerd in een glucose vrije Ringer-oplossing in vergelijking met glucose-bevattende beltoon oplossing voorafgaand aan incubatie met 1 μM ionomycine gedurende 2 uur. De hoogste eryptosis waarden worden verkregen na 7 dagen pre-incubatie in beide oplossingen. Echter, eryptosis is hoger na pre-incubatie in glucose-vrije beltoon oplossing in vergelijking met normale Ringer oplossing, die 5 mM glucose bevat (Zie Figuur 4A voor representatieve plots en Figuur 4B voor vergelijking van de mondiale middelen). Bovendien geven voorwaartse Scatter histogrammen het effect van glucose depletie op erytrocyten krimp (Figuur 5A-D). Forward Scatter is een maat voor de Celgrootte op basis van de lichtbreking, en het niveau van licht verstrooid is recht evenredig met de grootte van de cellen33. De cellen in een glucose vrije Ringer-oplossing vertonen minder voorwaartse spreiding in vergelijking met de cellen die in glucose-bevattende buffer (Figuur 5E) zijn geïnineerd, wat aangeeft dat de celkrimp in de glucose vrije omgeving wordt aangegeven.
Naast Flowcytometrie metingen werden cellen onder een confocale fluorescentiemicroscoop waargenomen om de eryptosis te bevestigen. Erytrocyten zonder behandeling (Figuur 6A) en met ionomycine behandeling (Figuur 6B) werden gelabeld met annexin-V Alexa meel 488 geconjugeerde en waargenomen onder Microscoop. De behandelde cellen toonden een helder fluorescentie signaal (Figuur 6B) als gevolg van de binding van annexin-V aan ps in de buitenste bijsluiter. Cellen zonder behandeling vertoonden daarentegen een zeer zwak fluorescentie signaal (Figuur 6a) dat zeer lage eryptosis aangeeft. Verdere voorbeelden van eryptotische erytrocyten gelabeld met annexin-V met een hoog fluorescentie signaal worden weergegeven in Figuur 6C.
Figuur 1: representatieve grafieken van het effect van verschillende ionomycine concentraties op eryptosis en hemolyse. Flowcytometrie histogrammen van erytrocyten behandeld met (A) 1 μm, (B) 5 μM, en (C) 10 μM ionomycine (grijs) bij 37 °c bij 0,4% hematocriet in Ringer oplossing voor 2 h. zwarte lijn geeft niet-behandelde cellen aan. Percentage van de eryptosis is aangegeven in elke figuur. Blootstelling aan fosfatidylserine werd gemeten met behulp van annexin-V binding. D) rekenkundig betekent ± SD (n = 3) van het percentage eryptosis van cellen behandeld met verschillende concentraties van ionomycine na 2 uur behandeling, en (E) rekenkundig betekent ± SD (n = 3) van hemolyse van erytrocyten door verschillende concentraties van ionomycine onder dezelfde omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve cijfers over het effect van verschillende ionomycine behandelingstijden op de eryptosis. Flowcytometrie histogrammen van erytrocyten behandeld met 1 μM ionomycine (grijs) bij 37 °C voor (A) 30 min, (B) 60 min, (C) 120 min, en (D) 180 min bij 0,4% hematocriet in beltoon oplossing. Zwarte lijn geeft niet-behandelde cellen aan. Percentage van de eryptosis is aangegeven in elke figuur. Blootstelling aan fosfatidylserine werd gemeten via annexin-V binding. E) rekenkundig betekent ± SD (n = 3) percentage eryptosis van cellen behandeld met 1 μM ionomycine voor verschillende tijdstippen. De hoogste eryptosis werd verkregen na 120 minuten behandeling. F) rekenkundig betekent ± SD (n = 3) percentage hemolyse van cellen behandeld met 1 μM ionomycine voor verschillende tijdstippen. Voor statistische analyse werd eenrichtings-niet-parametrische ANOVA met Kruskal-Wallis-test uitgevoerd, en eryptosis na 120 minuten behandeling was significant hoger dan de controle zoals aangegeven in panel E. * is voor p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: effect van verschillende ionomycine concentraties en behandelingstijden op de eryptosis. Rekenkundig betekent ± SD (n = 3) van het percentage eryptosis van cellen die met verschillende concentraties van ionomycine worden behandeld, wordt na verschillende behandelingstijden weergegeven. De cellen werden behandeld met lage concentraties ionomycine inclusief 0, 0,25, 0,5 en 1 μM voor langere blootstelling (6 uur en 12 uur). Hogere concentraties en langere behandelingen resulteerden in hogere eryptosis-waarden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: effect van energie depletie op de eryptosis. A) Flowcytometrie histogram voor erytrocyten behandeld met 1 μM ionomycine (grijs) bij 37 °c gedurende 2 uur bij 0,4% hematocriet, na pre-incubatie in glucose vrije Ringer-oplossing (topfiguren) en Ringer-oplossing (onderste cijfers) van 1 tot 7 dagen, onthult dat energie depletie de eryptosis vergemakkelijkt. Zwarte lijn geeft niet-behandelde cellen aan. Percentages van de eryptosis worden aangegeven in de grafieken voor elke dag. B) rekenkundig betekent ± SD (n = 3) van het percentage eryptosis van erytrocyten behandeld met 1 μM ionomycine bij 37 °c gedurende 2 uur bij 0,4% hematocriet, na pre-incubatie in beltoon oplossing (zwarte staven) en glucose vrije beltoon oplossing (witte staven) van 1 tot 7 dagen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: effect van energie depletie op celgrootte. Forward Scatter histogram voor erytrocyten behandeld met 1 μM ionomycine bij 37 °C gedurende 2 uur bij 0,4% hematocriet, na pre-incubatie in glucose-vrije beltoon oplossing (grijs) en Ringer oplossing (zwarte lijn) voor (A) 1 dag, (B) 3 dagen, (C) 5 dagen, en (D) 7 dagen. De voorwaartse spreidings histogram na verloop van tijd geeft aan erytrocyten krimp in glucose-vrije buffer. E) rekenkundig betekent ± SD (n = 3) van voorwaartse spreidings intensiteiten van erytrocyten behandeld met 1 μM ionomycine bij 37 °c gedurende 2 uur bij 0,4% hematocriet, na pre-incubatie in beltoon oplossing (zwarte staven) en glucose vrije beltoon oplossing (witte staven) van 1 tot 7 dagen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: confocale fluorescentiemicroscopie beelden van erytrocyten behandeld met (A) 0 μM, (B) en (C) 1 μM ionomycine bij 37 °c gedurende 2 uur bij 0,4% hematocriet. 40x doelstelling vergroting werd gebruikt voor afbeeldingen in panelen A en B, en 100x objectieve vergroting werd gebruikt om Foto's te nemen voor panel C. PS in gezonde erytrocyten bevindt zich op de binnenste bijsluiter van het celmembraan, daarom is er geen fluorescentie signaal in paneel A. In deelvensters B en C zijn erytrocyten geïnduceerd voor de eryptosis en er is een helder fluorescentie signaal als gevolg van de binding van annexin-V aan PS transgelegen aan de buitenste bijsluiter van het celmembraan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Celdichtheid/hematocriet | Ionomycine concentratie | Buffer | Pre-incubatie | Behandelingstijd met ionomycine | Detectiemethode | Verwijzing |
| 1,65 x 108 cellen/ml | 0,3 mM | Buffer A * | 36 h in buffer A | 1 h | Annexin V | 12 |
| 0,40% | 1 mM | Ringer-oplossing | 48 h in Ringer | 1 h | Annexin V | 17 |
| 50% | 10 mM | Buffer B * * | - | 3 h | Merocyanine 540 | 18 |
| 0,40% | 1 mM | Ringer-oplossing | 48 h in Ringer | 1 h | Annexin V | 19 |
| 0,40% | 1 mM | Ringer-oplossing | 48 h in Ringer | 1 h | Annexin V | 20 |
| 2 | 1 mM | Ringer-oplossing | - | 4 h | Annexin V | 21 |
| 0,40% | 1 mM | Ringer-oplossing | - | 0,5 h | Annexin V | 22 |
| 10 | 1 mM | Ringer-oplossing | - | 3 h | Annexin V | 23 |
| 0,40% | 10 mM | Ringer-oplossing | - | 0,5 h | Annexin V | 24 |
| 0,40% | 1 mM | Ringer-oplossing | 48 h in Ringer | 0,5 h | Annexin V | 25 |
| 2 x 106 cellen/ml | 1 mM | HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) | - | 0,5 h | Annexin V | 26 |
| * Buffer A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2· 6h2O, 10 mM glucose en 1,8 mm CACL2· 2H2O | ||||||
| * * Buffer B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl en 10 mM glucose | ||||||
Tabel 1: verschillende protocollen die in de literatuur worden gebruikt om eryptosis te induceren met ionomycine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze procedure is om optimale waarden te bieden voor ionofiele concentratie, behandelingstijd en extracellulaire glucoseconcentratie, die belangrijke factoren zijn bij het garanderen van een succesvolle inductie van eryptosis. Een cruciale stap in het protocol is de uitputting van extracellulaire glucose, die, ondanks het belang ervan, niet voldoende is benadrukt in de literatuur. Het suikergehalte in normale beltoon oplossing (5 mM) heeft een remmende werking op de eryptosis. Glucose depletie in de extracellulaire omgeving induceert cellulaire stress en activeert proteïne kinase C (PKC), resulterend in de activering van calcium en kalium kanalen. Dit resulteert in een toename van de ingang van CA2 + in de cytosolische ruimte30,31,34 en activeert uiteindelijk de scramblase16, die eryptosis verhoogt. Activering van kalium kanaal resulteert ook in kaliumchloride lekkage uit de cel, wat leidt tot erytrocyten krimp35.
De hierboven beschreven procedure moet worden uitgevoerd met specifieke aandacht voor hemolyse. Het is belangrijk om een geoptimaliseerde ionofiele concentratie te gebruiken, die hoog genoeg is om eryptosis te induceren, en laag genoeg om hemolyse te voorkomen. Evenzo leidt het incuberen van erytrocyten met ionomycine gedurende een korte periode tot lage eryptosis, terwijl een zeer lange incubatie kan leiden tot verstoring van de celmembraan en hemolyse. Er moet ook worden opgemerkt dat, hoewel het gepresenteerde protocol zeer betrouwbaar is wanneer het wordt uitgevoerd op hetzelfde erytrocyten monster, cellen van verschillende personen verschillend reageren op ionomycine en er mogelijk verschillen tussen de onderwerpen zijn tussen verschillende monsters.
Bijzondere aandacht moet worden besteed aan data-analyse van flow cytometrie. Het percentage eryptosis verkregen uit de flow cytometer geeft het percentage van de celpopulatie met PS op de buitenste bijsluiter aan. Cellen met verschillende intensiteiten van annexin-V-binding kunnen echter niet worden onderscheiden op basis van dit aantal. Annexin-V bindt aan de PS blootgesteld aan het celoppervlak, met een zeer hoge affiniteit en hoge specificiteit aan PS36,37,38. Zoals weergegeven in de microscopie afbeeldingen in dit rapport, vertonen verschillende cellen echter verschillen in de bindings intensiteit annexin-V. De cellen met lage PS op hun membranen hebben lage fluorescentie intensiteiten, terwijl hogere PS bezetting op celmembraan resulteert in hogere fluorescentie intensiteiten.
Het protocol in dit document kan worden gewijzigd door het verhogen van de extracellulaire CA2 + concentratie. In dit protocol werd ionomycine gebruikt voor het opwekken van eryptosis in de aanwezigheid van 1 mM CaCl2; hogere CA2 + concentraties kunnen leiden tot verhoogde intracellulaire calciumspiegels en kunnen meer eryptosis veroorzaken. Daarnaast kunnen verschillende calcium-ionoforen, zoals selectophore en calcimycine, verschillende mogelijkheden hebben om de intracellulaire concentratie van CA2 +te verbeteren, vergeleken met ionomycine, en kunnen resulteren in verschillende eryptosis-waarden. Echter, consistente eryptosis van erytrocyten kan worden bereikt met behulp van ionomycine met het uitgestippelde protocol en kan worden gebruikt in het laboratorium om de moleculaire mechanismen van eryptosis te onderzoeken, na te bootsen zieke condities39,40in vitro, en scherm potentiële Therapeutics die eryptosis remmen, onder andere toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door NIH Grant R15ES030140 en NSF Grant CBET1903568. Financiële steun van het Russ College of Engineering and Technology en het Department of chemical and Biomoleular Engineering aan de Ohio University wordt ook erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-565-331 | |
| Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit | Fisher Scientific | A10788 | Store at 4 °C |
| BD FACSAria II flow cytometer | BD Biosciences | 643177 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Centrifuge | Millipore Sigma | M7157 | Model Eppendorf 5415C |
| Confocal fluorescence microscopy | Zeiss, LSM Tek Thornwood | Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images | |
| Cover glasses circles | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Disposable round bottom flow cytometry tube | VWR | VWRU47729-566 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-100ML | |
| DPBS | VWR Life Science | SH30028.02 | |
| Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0001745 | |
| HEPES Buffer (1 M) | Fisher Scientific | 50-751-7290 | Store at 4 °C |
| Ionomycin calcium salt | EMD Milipore Corp. | 407952-1MG | Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C |
| KCl | Fisher Scientific | P330-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-5 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Synergy HFM microplate reader | BioTek | ||
| Whole blood in ACD | Zen-Bio | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
References
- Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
- Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
- Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).
- Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
- de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
- Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
- Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
- Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
- Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
- Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
- Lang, F., Lang, E., Fller, M.
- Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
- Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
- Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
- Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
- Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
- Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
- Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
- Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
- Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
- Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).
- Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
- Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
- Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
- Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
- Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).
- Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
- Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
- Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
- Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
- Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
- Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
- Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
- Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).
- Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).
- Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
- Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
- Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
- Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
- Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).
