Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Induktion av Eryptos i röda blodkroppar med hjälp av en Kalciumionophore

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/60659
Automatic Translation
1, 1,2
1Biomedical Engineering Program, Ohio University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University

Summary

Ett protokoll för induktion av eryptos, programmerad celldöd i erytrocyter, med hjälp av kalciumionophore, ionomycin, tillhandahålls. Framgångsrik eryptos utvärderas genom att övervaka lokalisering fosfatidylserin i membranet yttre broschyren. Faktorer som påverkar protokollets framgång har undersökts och optimala villkor har ställts.

Abstract

Eryptosis, erytrocyt programmerad celldöd, förekommer i ett antal hematologiska sjukdomar och under skador på erytrocyter. Ett kännetecken för eryptotiska celler är förlusten av kompositionella asymmetri i cellmembranet, vilket leder till flyttning av fosfatidylserin till membranet yttre broschyren. Denna process utlöses av ökad intracellulär koncentration av ca2 +, som aktiverar scramblase, ett enzym som underlättar dubbelriktad förflyttning av fosfolipider mellan membran broschyrer. Med tanke på betydelsen av eryptos i olika sjuka förhållanden, det har gjorts ansträngningar för att inducera eryptos in vitro-. Sådana insatser har i allmänhet förlitat sig på kalcium Ionophore, ionomycin, att öka intracellulära ca2 + koncentration och inducera eryptos. Emellertid, många avvikelser har rapporterats i litteraturen om förfarandet för inducera eryptos med ionomycin. Häri rapporterar vi ett steg-för-steg-protokoll för ionomycin-inducerad eryptos i humana erytrocyter. Vi fokuserar på viktiga steg i förfarandet inklusive jonofortoxikos koncentration, inkubationstid, och glukos utarmning, och ge representativa resultat. Detta protokoll kan användas för att reproducerbart inducera eryptos i laboratoriet.

Introduction

Programmerad celldöd i erytrocyter, även känd som eryptos, är vanligt i många kliniska tillstånd och hematologiska sjukdomar. Eryptos är associerat med cell krympning och förlusten av fosfolipid asymmetri i cell plasmamembranet1,2. Förlust av asymmetri resulterar i flyttning av Fosfatidylserin (PS), en lipid normalt lokaliserad i den inre broschyren3,4, till cellen yttre broschyren, som signalerar till makrofager till fagocytos och ta bort defekta erytrocyter5,6,7,8. I slutet av den normala livslängden av erytrocyter, avlägsnande av eryptotiska celler av makrofager säkerställer balansen av erytrocyter i omlopp. Emellertid, i sjuka förhållanden, såsom sicklecellanemi och thalassemi9,10,11, förbättrad eryptos kan resultera i allvarlig anemi2. På grund av dess betydelse i hematologiska sjukdomar, det finns ett betydande intresse för att undersöka de faktorer som inducerar eller hämmar eryptos och de molekylära mekanismerna bakom denna process.

Plasmamembranet av friska erytrocyter är asymmetriskt, med olika fosfolipider lokalisera på den yttre och inre broschyrer. Membran asymmetri regleras främst av effekten av membran enzymer. Aminofosfolipid translocase underlättar transporten av aminofosfolipider, PS och fosfatidyletanolamin (PE), genom att rikta dessa lipider till cellen inre broschyr. Å andra sidan, floppase transporterar kolin som innehåller fosfolipider, fosfatidylkolin (PC) och ceramidas (SM), från insidan till den yttre broschyren av cellmembranet12. Men, till skillnad från friska celler, membranet av eryptotiska erytrocyter är förvrängd. Detta beror på effekten av ett tredje enzym, scramblase, som stör fosfolipid asymmetri genom att underlätta dubbelriktad transport av aminofosfolipider13,14,15,16. Scramblase aktiveras av förhöjda intracellulära nivåer av ca2 +. Därför är kalcium ionophores, som underlättar transporten av ca2 + över cellmembranet12, effektiva inducerare av eryptos.

Ionomycin, en kalciumionophore, har använts i stor utsträckning för att inducera eryptos i erytrocyter12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin har både hydrofila och hydrofoba grupper, som är nödvändiga för att binda och fånga ca2 + Jon, och transportera den till cytosoliska utrymme27,28,29. Detta leder till aktivering av scramblase och flyttning av PS till den yttre broschyren, som lätt kan upptäckas med Annexin-V, ett cellulärt protein med hög affinitet till PS12. Även om utlösande eryptos av ionomycin rapporteras vanligen, det finns betydande metod avvikelse i litteraturen (tabell 1). Populationen av erytrocyter som genomgår eryptos beror på olika faktorer såsom jonofortoxikos koncentration, behandlingstid med jonofortoxikos, och sockerhalt i extracellulära miljön (glukos utarmning aktiverar cation kanaler och underlättar införsel av ca2 + in i cytosoliska rymden)30,31. Emellertid, det finns lite konsekvens i dessa faktorer i litteraturen, vilket gör det svårt att utföra eryptosis reproducerbart in vitro-.

I detta protokoll presenterar vi ett steg-för-steg-förfarande för att inducera eryptos i humana erytrocyter. Faktorer som påverkar framgångsrik eryptos inklusive ca2 + koncentration, jonofortoxikos koncentration, behandlingstid, och pre-inkubation i glukos-utarmat buffert undersöks och optimala värden rapporteras. Detta förfarande visar att pre-inkubation av erytrocyter i en glukos-fri buffert avsevärt ökar andelen eryptos jämfört med glukos-innehållande buffert. Detta protokoll kan användas i laboratoriet för att producera eryptotiska erytrocyter för olika tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla humanblod prov som används i protokollet som beskrivs nedan köptes som avidentifierade prover. Inga försökspersoner var direkt involverade eller rekryterade för denna studie. Riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen bör användas när forskningen involverar försökspersoner.

1. erytrocytisolering från helblod

  1. Tillsätt 500 μL helblod i surt citrat dextros (ACD) (förvaras vid 4 ° c) till ett microcentrifugerör.
    Obs: helblod köptes i ACD. Enligt företaget, 1,5 mL av ACD tillsätts till 7 mL helblod (8,5 mL total volym).
  2. Centrifugera hela blodet vid 700 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT) och ta bort det klara plasma och det tunna Buffy Coat med hjälp av en pipett för att lämna det röda erytrocytskiktet.
  3. Förbered 1 L ringsignal lösning som innehåller 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mm Hepes, 5 mm glukos, och 1 mm CaCl2. Justera pH till 7,4 genom att tillsätta 2 μL droppar 1,0 M NaOH. För att förbereda glukos fri ringsignal lösning, följ samma protokoll, men inkludera inte glukos i lösningen.
  4. Tvätta erytrocyter 2x i ringsignal lösning genom att suspendera cellpelleten i 1,5 mL ringsignal lösning, centrifugering vid 700 x g i 5 min vid RT och ta bort supernatanten.
  5. Gör en 0,4% hematokrit genom att rekyl 40 μL av erytrocytpelleten i 9 960 μL glukos fri ringsignal lösning för att nå en slutlig volym av 10 mL.
    Anmärkning: hematokrit är en term som används för att hänvisa till volymen fraktion av erytrocyter i suspensionen. En 0,4% hematokrit är en suspension som innehåller 0,4% erytrocyter.
  6. Inkubera cellsuspensionen vid 37 ° c i 7 dagar.

2. behandling av erytrocyter med ionomycin och mätning av hemolys

  1. Lös upp 1 mg ionomycin kalciumsalt i 630 μL dimetylsulfoxid (DMSO) för att nå en slutlig koncentration på 2 mM. Och förvara vid-20 ° c.
  2. Ta 1 mL av 0,4% hematokrit från steg 1,5 och tillsätt 0,5 μL av 2 mM ionomycin för att nå en slutlig koncentration på 1 μM. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° c.
    1. Använd 1 mL av hematokrit utan ionomycin-behandling som en negativ kontroll.
  3. Centrifugera den ionomycin-behandlade och obehandlade hematokrit vid 700 x g i 5 min vid RT, och ta bort deras samman supernatanterna att lämna cellen pellets på botten av rören.
  4. Tvätta cellerna 3x med ring Signals lösning genom att suspendera cell pellets i 1,5 mL ringsignal lösning, centrifugering vid 700 x g i 5 minuter vid RT och kassera supernatanterna.
  5. För att mäta hemolys, tillsätt 1 mL obehandlad 0,4% hematokrit från steg 1,5 till ett microcentrifugerör och inkubera i 2 h vid 37 ° c som den negativa kontrollen för hemolys (0%).
  6. Tillsätt 1 mL obehandlad 0,4% hematokrit från steg 1,5 till ett microcentrifugerör och centrifugera vid 700 x g i 5 minuter vid RT. ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml destillerat vatten till cellpelleten och inkubera i 2 timmar vid 37 ° c som positiv kontroll för hemolys (100%).
  7. Tillsätt 1 mL av den ionomycin-behandlade 0,4% hematokrit från steg 2,2 till ett microcentrifugerör.
  8. Centrifugera de obehandlade cellerna, de behandlade cellerna och cellerna i destillerat vatten vid 700 x g i 5 minuter vid RT.
  9. Ta 200 μl av samman supernatanterna och tillsätt till en 96-brunn tallrik.
  10. Mät absorbansen vid 541 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
  11. Beräkna hemolys med hjälp av ekvation 132:

    % Hemolys = (AT -a0)/(a100 -a0) * 100

    där en0 är absorbans av erytrocyter i ringsignal lösning, en100 är absorbans av erytrocyter i vatten, och enT är absorbans av behandlade erytrocyter av ionomycin.

3. bilagin-V bindande analys

  1. Späd 2 mL av den 5x bilagda bindnings bufferten i 8 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att erhålla 1x bindningsbuffert.
  2. Omsuspendera de ionomycin-behandlade och obehandlade cell pelletarna från steg 2,4 i 1 mL 1x bindningsbuffert.
  3. Ta 235 μL av cell suspensionerna i bindningsbufferten och tillsätt 15 μL Annexin V-Alexa Flour 488 konjugat.
  4. Inkubera cellerna vid RT i 20 minuter på en mörk plats. Centrifugera vid 700 x g i 5 minuter vid RT och ta bort supernatanten.
  5. Tvätta cellerna 2x med 1x bindningsbuffert genom att suspendera cellpelleten i 1,5 mL av bindningsbufferten, centrifugering vid 700 x g i 5 min vid RT och ta bort supernatanten.
  6. Omsuspendera cell pellets i 250 μL 1x bindningsbuffert för mätningar av flödescytometri.

4. flödescytometri

  1. Överför 200 μL av Annexin-V-färgade erytrocyter till 1 mL runda botten polystyrenrör kompatibla med flödescytometri.
  2. Logga in på Flow flödescytometrianalys-programvaran och klicka på knappen nytt experiment . Klicka på knappen ny slang . Välj det globala arket och välj tillämpa analys för att mäta fluorescensintensiteten med en exciteringvåglängd på 488 nm och en emissionsvåglängd på 530 nm.
  3. Ställ in antalet celler till 20 000 som ska samlas in för analys av fluorescensaktiverad cell sortering (FACS).
  4. Välj önskad tub och klicka på load -knappen. Klicka på spela in knappen för framåt scatter och Side scatter mätningar. Upprepa för alla prover.
  5. Rätt klick på prov knapp och klick på applicera baken analys till generera resultaten arkivera.
  6. Högerklicka på specimen knappen och klicka på generera FSC-filer.
  7. Lägg till flödescytometridata (FSC-filer) på arbetsplatsen för flödescytometri programvara.
  8. Analysera kontrolldata genom att välja den cellpopulation av intresse och lägga till statistik för eryptosis värde.
    1. Dubbelklicka på kontroll och välj histogram kontra fluorescensintensitet.
    2. Klicka på Gate-knappen för att rita en grind på histogrammet som indikerar andelen eryptos.
  9. Tillämpa samma statistik för alla andra experimentella rör för att få eryptosis värden. Rätt klick på kontroll och välja kopia analys till grupp.
  10. Efter korrekt gating alla prover, överföra analyserade data genom att dra och släppa dem i layoutredigeraren.
    1. Överlagra analyserade data med kontroll i layoutredigeraren.
    2. Ställ in de önskade histogrammen och intensiteterna genom att ändra x-och y-axeln för de överlagda diagrammen.
    3. Exportera bildfiler genom att klicka på knappen Exportera och spara diagrammen på önskad plats.

5. konfokalmikroskopi

  1. Överför 5 μL av Annexin-V-färgade celler på en Mikroskop bild och täck den med en täckslip. Förvara på en mörk plats för att förhindra foto blekning.
  2. Använd argon laser av konfokalmikroskopi fluorescens Mikroskop för att observera cellerna upphetsad vid 488 nm med önskade förstoringar.
    Anmärkning: ett konfokalmikroskop behövs inte nödvändigtvis och Mikroskop med fluorescensförmåga kan användas för att få fluorescensbilder som demonstrerar Annexin-V-bindning.
  3. Få fluorescensbilder av kontrollen (icke-behandlade celler) och behandlade celler.
    Obs: icke-behandlade celler förväntas Visa mycket svaga fluorescenssignaler, medan behandlade celler förväntas uppvisa ljusgrön fluorescens på membranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optimering av ionomycin koncentration

Medan ionomycin krävs för att inducera eryptos, ökade ionomycin koncentrationer kan leda till hemolys (dvs. lys av erytrocyter och frisättning av hemoglobin), som måste undvikas. Behandling av erytrocyter med 1 μM ionomycin i ringsignal lösning för 2 h är tillräckligt för att inducera eryptos, vilket framgår av framgångsrik märkning med Annexin-V Alexa Flour 488 konjugat och kvantifiering med FACS-analys (figur 1A). Högre koncentrationer av ionomycin (5 och 10 μM) resulterar i en liten ökning av eryptos (figur 1a-D). Emellertid, sådana koncentrationer ökar också hemolys (figur 1E), som inte önskas. För att hålla sig under 5% hemolys ska 1 μM ionomycin användas.

Behandlingstid med ionomycin

Inkubation av erytrocyter med ionomycin i ringsignal lösning för så lite som 30 min är tillräckligt för att inducera eryptos (figur 2A). Ökad inkubationstid ökar nivån av eryptos, mätt med Annexin V-bindande analys, för upp till 2 h (figur 2B, C). Ytterligare inkubationstid resulterar dock i en liten sänkning av eryptos (figur 2D). Maximal eryptos erhölls efter 2 timmar behandling med 1 μM ionomycin, och för alla andra behandlingstider erhölls lägre eryptos (figur 2E). Representativa flödescytometrihistogram presenteras i figur 2A-D. Dessutom, genomsnittlig procentuell eryptos och hemolys, för olika behandlingstider med 1 μM ionomycin, presenteras i figur 2E och figur 2F, respektive. Det högre värdet av hemolys efter 180 min förklarar minskningen av eryptos efter samma mängd inkubation (figur 2E) som mindre livskraftiga celler finns på 180 min av behandling med ionomycin.

Dessutom behandlades celler med låga koncentrationer av ionomycin, inklusive 0, 0,25, 0,5 och 1 μM för längre behandlingstider, inklusive 6 och 12 timmar, och eryptos mättes (figur 3). Celler som behandlats med ionomycinkoncentrationer av lägre än 1 μM i 6 och 12 timmar visar lägre eryptos jämfört med de celler som behandlades med 1 μM ionomycin (figur 3). Eftersom minska koncentrationen och öka exponeringstiden inte förbättra eryptos, 1 μM användes för att utlösa eryptos.

Eryptos är beroende av inkuberingstid och extracellulär glukoskoncentration

Extracellulära glukos koncentrationen påverkar resultatet av processen. Högre eryptosvärden observeras när erytrocyter förinkuberas i glukos fri ringsignal lösning jämfört med glukos-innehållande Ringlösning före inkubering med 1 μM ionomycin för 2 h. Den högsta eryptosis värden erhålls efter 7 dagar före inkubering i båda lösningarna. Eryptos är dock högre efter pre-inkubering i glukos fri ringsignal lösning jämfört med normal ringsignal lösning, som innehåller 5 mM glukos (se figur 4A för representativa tomter och figur 4B för jämförelse av globala medel). Dessutom, framåt scatter histogram indikerar effekten av glukos utarmning på erytrocyt krympning (figur 5A-D). Forward scatter är ett mått för Cellstorlek baserat på ljus refraktion, och graden av ljus spridda är direkt proportionell mot storleken på cellerna33. De celler som inkuberas i glukos fri ringsignal lösning visar mindre framåt scatter jämfört med de celler som inkuberas i glukos-innehållande buffert (figur 5E), vilket indikerar cell krympning i den glukos fria miljön.

Förutom flödescytometrimätningar observerades celler i ett konfokalfluorescens-Mikroskop för att bekräfta eryptos. Erytrocyter utan behandling (figur 6A) och med ionomycin behandling (figur 6B) märktes med Annexin-V Alexa Flour 488 konjugatet och observerades under mikroskop. Behandlade celler uppvisade en ljus fluorescens-signal (figur 6B) på grund av bindningen av ANNEXIN-V till PS i den yttre broschyren. Däremot visade celler utan behandling en mycket svag fluorescenssignal (figur 6a) som indikerar mycket låg eryptos. Ytterligare exempel bilder av eryptotiska erytrocyter märkta med Annexin-V med hög fluorescens-signal visas i figur 6C.

Figure 1
Figur 1: representativa grafer över effekten av olika ionomycinkoncentrationer på eryptos och hemolys. Flödescytometri histogram av erytrocyter behandlade med (a) 1 μm, (B) 5 μm, och (C) 10 μm ionomycin (grått) vid 37 ° c vid 0,4% hematokrit i ringsignal lösning för 2 h. svart linje indikerar icke-behandlade celler. Procentandel eryptos anges i varje figur. Fosfatidylserin exponeringen mättes med hjälp av Annexin-V bindning. (D) aritmetiska medel ± SD (n = 3) av den procentuella eryptos av celler som behandlats med olika koncentrationer av ionomycin efter 2 h behandling, och (E) aritmetiska medel ± SD (n = 3) hemolys av erytrocyter med olika koncentrationer av ionomycin under samma betingelser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa siffror om effekten av olika behandlingstider för ionomycin på eryptos. Flödescytometri histogram av erytrocyter behandlade med 1 μM ionomycin (grått) vid 37 ° c för (a) 30 min, (B) 60 min, (C) 120 min, och (D) 180 min vid 0,4% hematokrit i ringsignalen lösning. Svart linje indikerar icke-behandlade celler. Procentandel eryptos anges i varje figur. Fosfatidylserin exponeringen mättes genom Annexin-V bindning. (E) aritmetiska medel ± SD (n = 3) av procentuell eryptos av celler behandlade med 1 μm ionomycin för olika tidpunkter. Den högsta eryptos erhölls efter 120 min behandling. Faritmetiska medel ± SD (n = 3) av procentuell hemolys av celler behandlade med 1 μm ionomycin för olika tidpunkter. För statistisk analys utfördes enkelriktad icke-parametrisk ANOVA med Kruskal-Wallis-test, och eryptos efter 120 min behandling var signifikant högre än kontroll som anges i panel E. * är för p < 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: effekten av olika ionomycinkoncentrationer och behandlingstider på eryptos. Aritmetiska medel ± SD (n = 3) av den procentuella eryptos av celler som behandlats med olika koncentrationer av ionomycin visas efter olika behandlingstider. Cellerna behandlades med låga koncentrationer av ionomycin inklusive 0, 0,25, 0,5 och 1 μM för längre exponering (6 h och 12 h). Högre koncentrationer och längre behandlingar resulterade i högre eryptos värden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: effekt av energi utarmning på eryptos. (A) flödescytometri histogram för erytrocyter som behandlats med 1 μm ionomycin (grå) vid 37 ° c för 2 h vid 0,4% hematokrit, efter pre-inkubation i glukos-fri ringsignal lösning (topp siffror) och ringsignal lösning (botten siffror) från 1 till 7 dagar, avslöjar att energi utarmning underlättar eryptos. Svart linje indikerar icke-behandlade celler. Procentsatser av eryptos anges i diagrammen för varje dag. (B) aritmetiska medel ± SD (n = 3) av den procentuella eryptos av erytrocyter som behandlats med 1 μm ionomycin vid 37 ° c i 2 timmar vid 0,4% hematokrit, efter pre-inkubering i ring Signals lösning (svarta staplar) och glukos fri ringsignal lösning (vita staplar) från 1 till 7 dagar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: effekt av energi utarmning på Cellstorlek. Forward scatter histogram för erytrocyter som behandlats med 1 μM ionomycin vid 37 ° c för 2 h vid 0,4% hematokrit, efter pre-inkubation i glukos-fri ringsignal lösning (grå) och ringsignal lösning (svart linje) för (a) 1 dag, (B) 3 dagar, (C) 5 dagar, och (D) 7 dagar. Det framåtspridda histogrammet över tiden indikerar att erytrocytkrympning i glukos fri buffert. (E) aritmetiska medel ± SD (n = 3) av främre scatter-intensiteter av erytrocyter som behandlats med 1 μm ionomycin vid 37 ° c i 2 timmar vid 0,4% hematokrit, efter pre-inkubering i ring Signals lösning (svarta staplar) och glukos fri ringsignal lösning (vita staplar) från 1 till 7 dagar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: mikroskopi av Konfokal fluorescens bilder av erytrocyter som behandlats med (a) 0 μm, (B) och (C) 1 μm ionomycin vid 37 ° c för 2 h vid 0,4% hematokrit. 40x objektiv förstoring användes för bilder i paneler A och B, och 100x objektiv förstoring användes för att ta bilder för panel C. PS i friska erytrocyter ligger på den inre broschyren av cellmembranet, därför finns det ingen fluorescens signal i panel A. I panelerna B och C erytrocyter har inducerats för eryptos och det finns en ljus fluorescens signal som härrör från bindningen av Annexin-V till PS transplacerad till den yttre broschyren av cellmembranet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Cell täthet/hematokrit Ionomycin koncentration Buffert Före inkubering Behandlingstid med ionomycin Detektionsmetod Referens
1,65 x 108 celler/ml 0,3 mM Buffert A * 36 h i buffert A 1 h Annexin V 12
0,40% 1 mM Ringsignal lösning 48 h i ringsignal 1 h Annexin V 17
50% 10 mM Buffert B * * - 3 h Merocyanine 540 18
0,40% 1 mM Ringsignal lösning 48 h i ringsignal 1 h Annexin V 19
0,40% 1 mM Ringsignal lösning 48 h i ringsignal 1 h Annexin V 20
2 1 mM Ringsignal lösning - 4 h Annexin V 21
0,40% 1 mM Ringsignal lösning - 0,5 h Annexin V 22
10 1 mM Ringsignal lösning - 3 h Annexin V 23
0,40% 10 mM Ringsignal lösning - 0,5 h Annexin V 24
0,40% 1 mM Ringsignal lösning 48 h i ringsignal 0,5 h Annexin V 25
2 x 106 celler/ml 1 mM HEPES-buffrad saltlösning (HBS) - 0,5 h Annexin V 26
* Buffert A: 10 mM HEPER, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2· 6H2O, 10 mM glukos, och 1,8 mm CaCl2· 2H2O
* * Buffert B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl och 10 mM glukos

Tabell 1: olika protokoll som används i litteraturen för att inducera eryptos med ionomycin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med detta förfarande är att ge optimala värden för jonofortoxikos koncentration, behandlingstid, och extracellulära glukoskoncentration, som är viktiga faktorer för att säkerställa en framgångsrik induktion av eryptos. Ett kritiskt steg i protokollet är utarmningen av extracellulära glukos, som, trots dess betydelse, inte har tillräckligt betonats i litteraturen. Sockerhalten i normal ring lösning (5 mM) har en hämmande effekt på eryptos. Glukos utarmning i den extracellulära miljön inducerar cellulära stress och aktiverar proteinkinas C (PKC), vilket resulterar i aktivering av kalcium och kalium kanaler. Detta resulterar i en ökning av inträde ca2 + i cytosoliska utrymme30,31,34 och slutligen aktiverar scramblase16, vilket ökar eryptos. Aktivering av kalium kanal resulterar också i kaliumklorid läckage ur cellen, vilket leder till erytrocytkrympning35.

Det förfarande som beskrivs ovan måste utföras med särskild uppmärksamhet på hemolys. Det är viktigt att använda en optimerad jonofortoxikos koncentration, som är tillräckligt hög för att inducera eryptos, och tillräckligt låg för att förhindra hemolys. På samma sätt, inkuberande erytrocyter med ionomycin under en kort tidsperiod resulterar i låg eryptos medan mycket lång inkubation kan leda till cellmembran störningar och hemolys. Det bör också noteras att även om det presenterade protokollet är mycket tillförlitlig när de utförs på samma erytrocytprov, celler från olika individer reagerar olika på ionomycin och det kan finnas Inter-ämne variation mellan olika prover.

Särskild uppmärksamhet bör ägnas dataanalys från flödescytometri. Den procentuella eryptos som erhålls från flödescytometern indikerar procentandelen cellpopulation med PS på deras yttre bipacksedel. Det går dock inte att särskilja celler med olika intensitet för Annexin-V-bindning baserat på det här talet. Annexin-V binder till PS exponeras på cellytan, med en mycket hög affinitet och hög specificitet till PS36,37,38. Men, som visas i mikroskopi bilder i denna rapport, olika celler visar skillnader i bilagin-V bindning intensitet. Cellerna med låga PS på membranen har låg fluorescensintensitet, medan högre PS beläggning på cellmembranet resulterar i högre fluorescens-intensiteter.

Det protokoll som presenteras i detta dokument kan ändras genom att öka den extracellulära ca2 + koncentration. I detta protokoll användes ionomycin för att inducera eryptos i närvaro av 1 mM CaCl2. högre ca2 + koncentrationer kan leda till förbättrade intracellulära kalciumnivåer och kan inducera mer eryptos. Dessutom kan olika kalcium ionophores, såsom selectophore och calcimycin, har olika förmåga att öka den intracellulära koncentrationen av ca2 +, jämfört med ionomycin, och kan resultera i olika eryptosis värden. Emellertid, konsekvent eryptos av erytrocyter kan uppnås med hjälp av ionomycin med skisserat protokoll och kan användas i laboratoriet för att undersöka de molekylära mekanismerna för eryptos, efterlikna sjuka villkor39,40in vitro, och Screen potentiella Therapeutics som hämmar eryptos, bland andra applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH Grant R15ES030140 och NSF Grant CBET1903568. Ekonomiskt stöd från Russ College of Engineering och teknik och Institutionen för kemisk och Biomolekylär teknik vid Ohio University är också erkänt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).

Tags

Biokemi erytrocyt eryptos fosfatidylserin Annexin V ionomycin cellmembran
Induktion av Eryptos i röda blodkroppar med hjälp av en Kalciumionophore
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bigdelou, P., Farnoud, A. M.… More

Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter