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Biochemistry

Indução de eryptose em glóbulos vermelhos usando um ionóforo de cálcio

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/60659
Automatic Translation
1, 1,2
1Biomedical Engineering Program, Ohio University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University

Summary

Um protocolo para a indução da eritupse, a morte celular programada em eritrócitos, usando o ionóforo de cálcio, ionomicina, é fornecido. A eittose bem-sucedida é avaliada monitorando a fosfateina da localização no folheto exterior da membrana. Foram examinados fatores que afetam o sucesso do protocolo e condições ideais fornecidas.

Abstract

Eritrose, morte celular programada de eritrócito, ocorre em uma série de doenças hematológicas e durante a lesão aos eritrócitos. Uma marca registrada das células eryptoticas é a perda da assimetria composicional da membrana celular, levando à translocação de fósforoarfrino para o folheto externo da membrana. Este processo é desencadeado pelo aumento da concentração intracelular de Ca2+, que ativa a scramblase, uma enzima que facilita o movimento bidirecional de fosfolípidos entre folhetos de membrana. Dada a importância da eryptose em várias condições doentes, tem havido esforços para induzir a erytose in vitro. Tais esforços têm geralmente invocado o ionóforo de cálcio, ionomicina, para melhorar a concentração intracelular Ca2 + e induzir a eryptose. Entretanto, muitas discrepâncias foram relatadas na literatura a respeito do procedimento para induzir a eryptose usando o ionomycin. Aqui, relatamos um protocolo passo a passo para eritptose induzida pela ionomicina em eritrócitos humanos. Nós nos concentramos em etapas importantes no procedimento, incluindo a concentração de ionóforo, tempo de incubação e esgotamento da glicose, e fornecer resultado representativo. Este protocolo pode ser usado para induzir reproduzivelmente a eryptose em laboratório.

Introduction

A morte celular programada em eritrócitos, também conhecida como eritrose, é comum em muitas condições clínicas e distúrbios hematológicos. A eryptose está associada ao encolhimento celular e à perda de assimetria fosfolípida na membrana plasmática celular1,2. A perda de assimetria resulta na translocação de fosfatidylserine (PS), um lipídio normalmente localizado no folheto interno3,4, para o folheto exterior celular, que sinaliza para macrófagos para phagocitose e remover eritrócitos defeituosos5,6,7,8. No final da vida útil normal dos eritrócitos, a remoção de células eritptoticas por macrófagos garante o equilíbrio dos eritrócitos em circulação. No entanto, em condições doentes, como doença falciforme e talassemia9,10,11,eritrese reforçada pode resultar em anemia grave2. Devido à sua importância em doenças hematológicas, há um interesse significativo em examinar os fatores que induzem ou inibem a eryptose e os mecanismos moleculares subjacentes a este processo.

A membrana plasmática de eritrócitos saudáveis é assimétrica, com diferentes fosfolípidos localizando-se nos folhetos externos e internos. A assimetria da membrana é regulada principalmente pela ação das enzimas da membrana. O translocase aminofosfosfórico facilita o transporte de aminofosfípidos, PS e fosfatidylethanolamina (PE), direcionando esses lipídios para o folheto interno celular. Por outro lado, o floppase transporta a colina contendo fosfolípidos, fosfatatidylcholine (PC) e esfingomielina (SM), do interior ao folheto externo da membrana celular12. No entanto, ao contrário das células saudáveis, a membrana dos eritrócitos eritptoticos é embaralhada. Isto é devido à ação de uma terceira enzima, scramblase, que interrompe a assimetria fosfolípido, facilitando o transporte bidirecional de aminofosfosfípidos13,14,15,16. Scramblase é ativado por níveis intracelulares elevados de Ca2+. Portanto, os ionóforos de cálcio, que facilitam o transporte de Ca2+ através da membrana celular12,são indutores eficientes de eitosse.

Ionomicina, um ionóforo de cálcio, tem sido amplamente utilizado para induzir erittose em eritrócitos12,17,18,19,20,22,23,24,25,26. Ionomicina tem grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, que são necessários para ligar e capturar íon Ca2 +, e transportá-lo para o espaço citosólico27,28,29. Isso leva à ativação de scramblase e translocação de PS para o folheto externo, que pode ser facilmente detectado usando annexin-V, uma proteína celular com uma alta afinidade com PS12. Embora provocar a eryptose por ionomicina seja relatado geralmente, há uma discrepância considerável do método na literatura(tabela 1). A população de eritrócitos submetidos à eritrose depende de diferentes fatores, como concentração de ionóforo, tempo de tratamento com ionóforo e o teor de açúcar do ambiente extracelular (esgotamento da glicose ativa canais de caation e facilita a entrada de Ca2+ no espaço citosólico)30,31. No entanto, há pouca consistência nesses fatores na literatura, dificultando o desempenho da eritose reproduzivelmente in vitro.

Neste protocolo, apresentamos um procedimento passo a passo para induzir eritrose em eritrócitos humanos. Os fatores que afetam a eryptose bem-sucedida que inclui a concentração de Ca2+, concentração do ionophore, tempo do tratamento, e pre-incubação no amortecedor glicose-esgotado são examinados e os valores óptimos são relatados. Este procedimento demonstra que a pré-incubação de eritrócitos em um amortecedor livre de glicose aumenta significativamente a porcentagem de eritrose em comparação com tampão contendo glicose. Este protocolo pode ser usado em laboratório para produzir eritrócitos eritptoticos para várias aplicações.

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Protocol

Todas as amostras de sangue humanas utilizadas no protocolo descrito abaixo foram compradas como amostras desidentificadas. Nenhum sujeito humano foi diretamente envolvido ou recrutado para este estudo. As orientações da Declaração de Helsínquia devem ser utilizadas quando a investigação envolve seres humanos.

1. Isolamento eritrócito de sangue inteiro

  1. Adicione 500 μL de sangue inteiro em dextrose citrato ácido (ACD) (armazenado a 4 °C) a um tubo de microcentrífuga.
    NOTA: Sangue inteiro foi comprado em ACD. De acordo com a empresa, 1,5 mL de ACD é adicionado a 7 mL de sangue inteiro (8,5 mL volume total).
  2. Centrífuga todo o sangue a 700 x g para 5 min à temperatura ambiente (RT) e remover o plasma claro eo casaco buffy fina usando uma pipeta para deixar a camada de eritrócito vermelho.
  3. Prepare 1 L de solução Ringer contendo 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM glicose, e 1 mM CaCl2. Ajuste o pH para 7,4 adicionando 2 μL gotas de 1,0 M NaOH. Para preparar a solução Ringer sem glicose, siga o mesmo protocolo, mas não inclua glicose na solução.
  4. Lave os eritrócitos 2x na solução Ringer suspendendo a pelota de celular em 1,5 mL da solução Ringer, centrífuga a 700 x g por 5 min na RT e removendo o supernatant.
  5. Faça um hematocrit de 0,4% resuspendendo 40 μL da pelota de eritrócito em 9.960 μL de solução Ringer sem glicose para atingir um volume final de 10 mL.
    NOTA: Hematocrit é um termo usado para se referir à fração de volume de eritrócitos em suspensão. Um hematocrita de 0,4%.
  6. Incubar a suspensão celular a 37 °C por 7 dias.

2. Tratamento de eritrócitos com ionomicina e medição de hemolíse

  1. Dissolva 1 mg de sal de cálcio de ionomicina em 630 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) para alcançar uma concentração final de 2 mM. Aliquot e armazenar a -20 °C.
  2. Tome 1 mL do hematocrit de 0,4% do passo 1.5 e adicione 0,5 μL de ionomicina de 2 mm para alcançar uma concentração final de 1 μM. Incubate por 2 h a 37 °C.
    1. Use 1 mL do hematocrito sem tratamento de ionomicina como controle negativo.
  3. Centrífuga a ionomicina tratada e hematocrits tratados em 700 x g para 5 min em RT, e remover suas supernatants para deixar as pelotas celulares na parte inferior dos tubos.
  4. Lave as células 3x com a solução Ringer suspendendo as pelotas celulares em 1,5 mL da solução Ringer, centrífuga a 700 x g por 5 min na RT e descartando as supernatantes.
  5. Para medir a hemolíse, adicione 1 mL do hematocrit não tratado de 0,4% do passo 1.5 a um tubo de microcentrífuga e incubar por 2 h a 37 °C como o controle negativo para a hemolíse (0%).
  6. Adicione 1 mL do hematocrit não tratado de 0,4% do passo 1.5 a um tubo de microcentrífuga e centrífuga a 700 x g por 5 min na RT. Remova o supernatant e adicione 1 mL de água destilada e incubada por 2 h a 37 °C como o controle positivo para a hemolíse (100%).
  7. Adicione 1 mL do hematocrit o tratado de ionomicina 0,4% do passo 2.2 para um tubo de microcentrífuga.
  8. Centrífugaas as células não tratadas, células tratadas e as células em água destilada a 700 x g por 5 min no RT.
  9. Pegue 200 μL das supernatantes e adicione a uma placa de 96 poços.
  10. Medir a absorção em 541 nm usando um leitor de microplaca.
  11. Calcule a hemotimese usando a Equação 132:

    %Hemolysis = (AT - A 0)/(A100 - A0)*100

    onde A0 é a absorção de eritrócitos na solução Ringer, A100 é a absorção de eritrócitos na água, e AT é a absorção de eritrócitos tratados por ionomicina.

3. Ensaio obrigatório anexo-V

  1. Diluir 2 mL do buffer de ligação 5x annexin V em 8 mL de soline tampão de fosfato (PBS) para obter buffer de ligação 1x.
  2. Resuspenda as pelotas celulares tratadas e não tratadas com ionomicina do passo 2.4 em 1 mL de buffer de ligação 1x.
  3. Tome 235 μL das suspensões de células no tampão de ligação e adicione 15 μL de Annexin V-Alexa Farinha 488 conjugado.
  4. Incubar as células em RT por 20 min em um lugar escuro. Centrífuga a 700 x g por 5 min em RT e remover o supernatant.
  5. Lave as células 2x com tampão de ligação 1x, suspendendo a pelota de célula em 1,5 mL do tampão de ligação, centrífuga a 700 x g por 5 minutos em RT e removendo o supernatant.
  6. Resuspenda as pelotas celulares em 250 μL de buffer de ligação 1x para medições de citometria de fluxo.

4. Citometria flow

  1. Transfira 200 μL dos eritrócitos manchados annexin-V para tubos de poliestireno de fundo redondo de 1 mL compatíveis com citometria de fluxo.
  2. Faça login no software de citometria de fluxo e clique no novo botão experimento. Clique no novo botão do tubo. Selecione a folha global e escolha a análise de aplicar para medir a intensidade da fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm.
  3. Definir o número de células para 20.000 a serem coletadas para análise de classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
  4. Selecione o tubo desejado e clique no botão de carga. Clique no botão de registro para a dispersão para a frente e medições de dispersão lateral. Repita para todas as amostras.
  5. Clique direito no botão do espécime e clique na análise de lote de aplicar para gerar o arquivo de resultado.
  6. Clique direito no botão do espécime e clique em gerar arquivos FSC.
  7. Adicione os dados de citometria de fluxo (arquivos FSC) no local de trabalho do software de citometria de fluxo.
  8. Analise os dados de controle selecionando a população celular de interesse e adicionando estatísticas para o valor da erytose.
    1. Clique duas vezes no controle e selecione histograma versus intensidade de fluorescência.
    2. Clique no botão do portão para desenhar um portão no histograma que indica a porcentagem de erídose.
  9. Aplique as mesmas estatísticas para todos os outros tubos experimentais para obter os valores de erytose. Clique direito no controle e selecione a análise de cópia para o grupo.
  10. Depois de devidamente gating todas as amostras, transferir os dados analisados, arrastando-os e deixá-los cair no editor layout.
    1. Sobreponha os dados analisados com controle no editor de layout.
    2. Defina os histogramas e intensidades desejados alterando o eixo x e y dos gráficos sobrepostos.
    3. Exportar arquivos de imagem clicando no botão de exportação e salvar os gráficos no local desejado.

5. Microscopia confocal

  1. Transfira 5 μL de células manchadas de anexo-V em um slide de microscópio e cubra-a com um deslizamento de cobertura. Mantenha-se em um lugar escuro para evitar o clareamento fotográfico.
  2. Use laser argônio do microscópio de fluorescência confocal para observar as células animadas em 488 nm com ampliações desejadas.
    NOTA: Um microscópio confocal não é necessariamente necessário e qualquer microscópio com capacidades de fluorescência pode ser usado para obter imagens de fluorescência que demonstram ligação annexin-V.
  3. Obtenha imagens de fluorescência do controle (células não tratadas) e células tratadas.
    NOTA: As células não tratadas são esperados para mostrar sinais de fluorescência muito fraco, enquanto as células tratadas são esperados para mostrar fluorescência verde brilhante em suas membranas.

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Representative Results

Otimização da concentração de ionomicina

Enquanto a ionomicina é necessária para induzir eritrose, o aumento das concentrações de ionomicina pode levar à hemolíse (ou seja, lise de eritrócitos e liberação de hemoglobina), que precisa ser evitada. O tratamento dos eritrócitos com 1 μM ionomicina na solução Ringer para 2 h é suficiente para induzir eritptose, como evidenciado pela rotulagem bem sucedida com annexin-V Alexa Farinha 488 conjugado e quantificação pela análise FACS (Figura 1A). Concentrações mais elevadas de ionomicina (5 e 10 μM) resultam em um ligeiro aumento na eryptose (Figura 1A-D). No entanto, tais concentrações também aumentam a hemotime(Figura 1E),que não é desejada. Para ficar abaixo de 5% de hemolíse, 1 μM ionomicina deve ser usado.

Tempo de tratamento com ionomicina

Incubação de eritrócitos com ionomicina na solução Ringer por apenas 30 min é suficiente para induzir eritptose (Figura 2A). O aumento do tempo de incubação aumenta o nível de eryptose, medido pelo ensaio anexo de ligação v, para até 2 h (Figura 2B,C). No entanto, o tempo de incubação ainda mais resulta em uma ligeira diminuição no nível de eryptose (Figura 2D). A eryptose máxima foi obtida após 2 h de tratamento com ionomicina de 1 μM, e para todos os outros tempos de tratamento, foi obtida menor eryptose(Figura 2E). Os histogramas representativos da citometria do fluxo são apresentados na figura 2A-D. Além disso, a erituse percentual média e a hemolíse, para vários tempos de tratamento com ionomicina de 1 μM, são apresentadas na Figura 2E e na Figura 2F,respectivamente. O maior valor da hemolíse após 180 min explica a redução da erídose após a mesma quantidade de incubação (Figura 2E)como células menos viáveis existem sobre 180 min de tratamento com ionomicina.

Além disso, as células foram tratadas com baixas concentrações de ionomicina, incluindo 0, 0,25, 0,5 e 1 μM para tempos de tratamento mais longos, incluindo 6 e 12 h, e a eryptose foi medida(Figura 3). As células tratadas com concentrações de ionomicina inferiores aos 1 μM para 6 e 12 h mostram menor eryptose em comparação com as células tratadas com 1 μM ionomicina (Figura 3). Desde que diminuiu a concentração e o aumento do tempo de exposição não aumentou a eryptose, 1 μM foi usado para provocar a erytose.

A eryptose depende do tempo de incubação e da concentração extracelular de glicose

A concentração extracelular da glicose afeta o resultado do processo. Valores mais elevados de eritptose são observados quando eritrócitos são pré-incubados na solução ringer sem glicose em comparação com a solução Ringer contendo glicose antes da incubação com 1 μM ionomicina por 2 h. Os valores os mais elevados da eriporse são obtidos após 7 dias da pre-incubação em ambas as soluções. No entanto, a eryptose é maior após a pré-incubação na solução ringer sem glicose em comparação com a solução ringer normal, que contém 5 mM de glicose (ver Figura 4A para parcelas representativas e Figura 4B para comparação de meios globais). Além disso, histogramas de dispersão para a frente indicam o efeito do esgotamento da glicose no encolhimento de eritrócitos (Figura 5A-D). A dispersão para diante é uma medida para o tamanho da pilha baseada na refração clara, e o nível de luz dispersado é diretamente proporcional ao tamanho das pilhas33. As células incubadas na solução ringer sem glicose mostram menos dispersão para a frente em comparação com as células incubadas no tampão contendo glicose (Figura 5E), indicando encolhimento celular no ambiente livre de glicose.

Além das medições de citometria de fluxo, as células foram observadas um microscópio de fluorescência confocal para confirmar a eritose. Eritrócitos sem tratamento (Figura 6A)e com tratamento de ionomicina(Figura 6B)foram rotulados com annexin-V Alexa Farinha 488 conjugado e observado microscópio. As células tratadas apresentaram um sinal de fluorescência brilhante(Figura 6B)devido à ligação do anexo-V ao PS no folheto externo. Em contraste, células sem tratamento apresentaram um sinal de fluorescência muito fraco (Figura 6A),indicando erído muito baixa. Outras imagens de exemplo de eritrócitos eritptoticos rotulados com annexin-V com alto sinal de fluorescência são mostrados na Figura 6C.

Figure 1
Figura 1: Gráficos representativos do efeito de várias concentrações de ionomicina na erídose e hemolíse. Histogramas de citometria fluícola de eritrócitos tratados com (A) 1 μM, (B) 5 μM, e (C)10 μM ionomicina (cinza) a 37 °C a 0,4% hematocrita na solução ringer para 2 h. Linha preta indica células não tratadas. A porcentagem de eryptose é indicada em cada valor. A exposição ao fósforo foi medida por meio da ligação anexo-V. (D)Aritmética significa ± SD (n = 3) da eritrose percentual de células tratadas com diferentes concentrações de ionomicina após o tratamento de 2 h, e (E) meios aritméticas ± SD (n = 3) de hemolícina de eritrócitos por diferentes concentrações de ionomicina as mesmas condições. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Números representativos sobre o efeito de vários tempos de tratamento de ionomicina na eryptose. Histogramas de citometria de fluxo de eritrócitos tratados com 1 μM ionomicina (cinza) a 37 °C para (A) 30 min, (B) 60 min, (C) 120 min, e (D) 180 min em 0,4% hematocrit na solução Ringer. A linha preta indica células não tratadas. A porcentagem de eryptose é indicada em cada valor. A exposição ao fósforo foi medida por meio da ligação anexo-V. (E)Aritmética significa ± SD (n = 3) de eritptose percentual de células tratadas com ionomicina de 1 μM por momentos diferentes. A maior eryptose foi obtida após o tratamento de 120 min. (F)Aritmética significa ± SD (n = 3) de hemolíse percentual de células tratadas com ionomicina de 1 μM por momentos diferentes. Para análise estatística, a ANOVA não paramétrica de sentido único com teste de Kruskal-Wallis foi realizada, e a eryptose após o tratamento de 120 mins foi significativamente maior do que o controle, conforme indicado no painel E. * é para p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Efeito de várias concentrações de ionomicina e tempos de tratamento na eryptose. A aritmética significa ± SD (n = 3) da eritrese percentual das células tratadas com diferentes concentrações de ionomicina é mostrada após vários tempos de tratamento. As células foram tratadas com baixas concentrações de ionomicina, incluindo 0, 0,25, 0,5 e 1 μM para maior exposição (6 h e 12 h). Concentrações mais altas e tratamentos mais longos resultaram em maiores valores de erytose. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Efeito do esgotamento energético na eryptose. (A) Histograma de citometria de fluxo para eritrócitos tratados com ionomicina de 1 μM (cinza) a 37 °C para 2 h a 0,4% hematocrita, após pré-incubação na solução ringer livre de glicose (figuras superiores) e solução Ringer (figuras inferiores) de 1 a 7 dias, revela que o esgotamento energético facilita a eitriose. A linha preta indica células não tratadas. Porcentagens de erytose são indicadas nos gráficos para cada dia. (B) Aritmética significa ± SD (n = 3) da eritrose percentual de eritrócitos tratados com 1 μM ionomicina em 37 °C para 2 h a 0,4% hematocrita, após pré-incubação na solução Ringer (barras pretas) e solução ringer sem glicose (barras brancas) de 1 a 7 dias. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Efeito do esgotamento energético no tamanho da célula. Histograma de dispersão para a frente para eritrócitos tratados com 1 μM ionomicina em 37 °C para 2 h em 0,4% hematocrit, após pré-incubação na solução ringer sem glicose (cinza) e solução Ringer (linha preta) para (A) 1 dia, (B) 3 dias, (C) 5 dias, e (D) 7 dias. O histograma de dispersão para a frente ao longo do tempo indica encolhimento eritrócito no tampão livre de glicose. (E) Aritmética significa ± SD (n = 3) de intensidades de dispersão para a frente de eritrócitos tratados com 1 μM ionomicina em 37 °C para 2 h a 0,4% hematocrita, após pré-incubação na solução Ringer (barras pretas) e solução Ringer livre de glicose (barras brancas) de 1 a 7 dias. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Imagens confocal de microscopia de fluorescência de eritrócitos tratados com (A) 0 μM, (B) e (C) 1 μM ionomicina a 37 °C para 2 h a 0,4% hematócrito. A ampliação objetiva 40x foi usada para imagens nos painéis A e B, e a ampliação objetiva 100x foi usada para tomar imagens para o painel C. PS em eritrócitos saudáveis é ficado situado no folheto interno da membrana de pilha, conseqüentemente não há nenhum sinal da fluorescência no painel A. Nos painéis B e C eritrócitos foram induzidos para eryptose e há um sinal de fluorescência brilhante resultante da ligação de annexin-V para PS translocado para o folheto externo da membrana celular. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Densidade celular /hematócrita Concentração de ionomicina Buffer Pré-incubação Tempo de tratamento com ionomicina Método de detecção Referência
1,65 x 108 células/mL 0,3 mM Buffer A* 36 h no amortecedor A 1 h Anexo em V 12
0.40% 1 mM Solução ringer 48 h em Ringer 1 h Anexo em V 17
50% 10 mM Buffer B** - 3 h Merocianina 540 18
0.40% 1 mM Solução ringer 48 h em Ringer 1 h Anexo em V 19
0.40% 1 mM Solução ringer 48 h em Ringer 1 h Anexo em V 20
2% 1 mM Solução ringer - 4 h Anexo em V 21
0.40% 1 mM Solução ringer - 0,5 h Anexo em V 22
10% 1 mM Solução ringer - 3 h Anexo em V 23
0.40% 10 mM Solução ringer - 0,5 h Anexo em V 24
0.40% 1 mM Solução ringer 48 h em Ringer 0,5 h Anexo em V 25
2 x 106 células/mL 1 mM Soline amorteceu-de-HEPES (HBS) - 0,5 h Anexo em V 26
*Buffer A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2·6H2O, 10 mM glicose e 1,8 mM CaCl2·2H2O
**Buffer B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl e 10 mM de glicose

Tabela 1: Vários protocolos utilizados na literatura para induzir a eryptose usando ionomicina.

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Discussion

O objetivo deste procedimento é fornecer valores ideais para a concentração de ionóforo, tempo de tratamento e concentração de glicose extracelular, que são fatores importantes para garantir a indução bem-sucedida da eryptose. Um passo crítico no protocolo é o esgotamento da glicose extracelular, que, apesar de sua importância, não tem sido suficientemente enfatizada na literatura. O teor de açúcar na solução ringer normal (5 mM) tem um efeito inibitório sobre a eryptose. O esgotamento da glicose no ambiente extracelular induz o estresse celular e ativa a proteína kinase C (PKC), resultando na ativação dos canais de cálcio e potássio. Isso resulta em um aumento na entrada de Ca2 + no espaço citosólico30,31,34 e, finalmente, ativa a scramblase16, o que aumenta a eryptose. Ativação do canal de potássio também resulta em vazamento de cloreto de potássio para fora dacélula, o que leva ao encolhimento de eritrócito35 .

O procedimento delineado acima precisa ser realizado com atenção específica à hemotimese. É importante usar uma concentração otimizada de ionóforo, que é alta o suficiente para induzir eritupse, e baixa o suficiente para evitar a hemolise. Da mesma forma, a incubação de eritrócitos com ionomicina por um curto período de tempo resulta em baixa erídose, enquanto a incubação muito longa pode levar à ruptura da membrana celular e hemolíse. Também deve ser notado que, embora o protocolo apresentado seja altamente confiável quando realizado na mesma amostra de eritrócito, células de diferentes indivíduos respondem de forma diferente à ionomicina e pode haver variabilidade inter-sujeita entre diferentes amostras.

Deve ser dada especial atenção à análise de dados da citometria do fluxo. A eryptose percentual obtida a partir do citometro de fluxo indica a porcentagem da população celular com PS em seu folheto externo. No entanto, as células com diferentes intensidades de ligação annexin-V não podem ser distinguidas com base neste número. Annexin-V liga-se ao PS exposto na superfície celular, com uma afinidade muito alta e alta especificidade para PS36,37,38. No entanto, como mostra as imagens de microscopia neste relatório, diferentes células mostram diferenças na intensidade de ligação annexin-V. As células com baixo PS em suas membranas têm baixas intensidades de fluorescência, enquanto maior ocupação ps na membrana celular resulta em maiores intensidades de fluorescência.

O protocolo apresentado neste artigo pode ser modificado aumentando a concentração extracelular Ca2+. Neste protocolo, a ionomicina foi utilizada para induzir a erytose na presença de 1 mM CaCl2; concentrações mais elevadas de Ca2+ podem levar a níveis de cálcio intracelular aprimorados e podem induzir mais erytose. Além disso, diferentes ionóforos de cálcio, como selectofifos e calcimicina, podem ter diferentes capacidade de aumentar a concentração intracelular de Ca2+,em comparação com a ionomicina, e podem resultar em diferentes valores de eryptose. No entanto, eritrose consistente de eritrócitos pode ser alcançada usando ionomicina com o protocolo delineado e pode ser usada em laboratório para examinar os mecanismos moleculares da eritrose, condições doentes imitadas39,40in vitro,e potenciais terapêuticas de tela que inibem a eritrose, entre outras aplicações.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NIH grant R15ES030140 e NSF concessão CBET1903568. O apoio financeiro da Russ College of Engineering and Technology e do Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade de Ohio também é reconhecido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

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References

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Indução de eryptose em glóbulos vermelhos usando um ionóforo de cálcio
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Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

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