Summary
우리는 막 단백질 정제 및 재구성을 단일 크로마토그래피 단계에서 펩티디스크로 결합하는 방법을 제시합니다. 생체 측량 스캐폴드는 생체층 간섭측정을 통해 단백질-리간드 상호 작용의 직접 표면 부착 및 측정에 사용됩니다.
Abstract
수송기, 채널 및 수용체를 포함하여 막 단백질은, 세포 단백질의 거의 1/4및 현재 약 표적의 반 이상을 구성합니다. 그러나, 학문적 또는 산업 적 환경에서 그들의 특성화 그리고 착취에 중요한 장벽은 대부분의 생화학적, 생물물리학적 및 약물 스크리닝 전략이 수용성 상태에 있는 이 단백질을 요구한다는 것입니다. 우리의 실험실은 최근에 막 단백질 용해도의 문제에 "일크기에 맞는" 접근을 제안하는 막 모방인 펩티디스크를 개발했습니다. 우리는 여기에서 단 하나 크로마토그래피 단계에서 단백질 정화 및 펩티디스크 재구성을 결합하는 능률적인 프로토콜을 제시합니다. PeptiQuick이라고 불리는 이 워크플로우는 폴리스티렌 구슬로 투석 및 배양을 우회하여 세제, 단백질 변성 및 시료 손실에 대한 노출을 크게 줄입니다. PeptiQuick이 생체 용 스캐폴드로 수행 될 때, 준비는 스트렙 타비딘 코팅 표면에 직접 부착 될 수있다. 막 단백질 표적을 biotinylate 하거나 수정할 필요가 없습니다. PeptiQuick은 생체층 간섭측정을 사용하여 상호 작용의 정확한 역학을 결정하는 막 수용체 FhuA 및 항균 리간드 복리신 M과 함께 여기에 전시됩니다. PeptiQuick은 세제없는 환경에서 하루 이내에 막 단백질 리간드 상호 작용을 준비하고 분석 할 수있는 편리한 방법입니다.
Introduction
막 단백질은 종종 약물 또는 항체 발견 연구 프로그램에서 배제되기 때문에 막 단백질이 지질 이중층 환경 의 외부로 응집되는 성향, 특히 세제의 존재1. 따라서, 최근에는, 몇몇 막 모방 (불리된 스캐폴드)는 완전히 세제없는 환경에서 막 단백질의 분리 및 심문을 용이하게하기 위해 개발되었습니다 (즉, 나노 디스크, SMALPs, amphipols, 등). 2,3,4,5,6. 그러나, 이러한 모방에서 막 단백질의 재구성은 종종 광범위한 최적화가 필요하며, 이는 시간이 많이 걸리고 일반적으로 단백질 회수의 손실을동반하는 7,8. 이러한 한계를 극복하기 위해 당사의 실험실은 최근 펩티디스크9로알려진 "일형-적합" 제형을 개발했습니다. 펩티디스크는 설계자 4.5 kDa 양파성 바이헬릭 펩티드의 다중 카피를 표적 막 단백질의 소수성 표면에 결합할 때 형성된다. 펩티디스크의 안정적인 재구성은 세제를 제거할 때 발생하며, 내인성 지질과 용해성 막 단백질을 수용성 입자에 포획합니다. 이러한 안정화된 입자는 이제 수많은 다운스트림 애플리케이션에 적합합니다.
펩티디스크 방법은 몇 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 펩티디스크 스캐폴드를 표적에 결합하기 때문에 재구성은 간단하며, 단백질 템플릿 자체에 의해 유도되는9,10. 펩티드 족치량계는 또한 자가 결정되며 외인성 지질을 첨가할 필요가 없다. 펩티디스크 형성은 단순한 세제 희석에 의해 발생하며, 폴리스티렌 비드에 투석 또는 흡착에 비해 중요한 이점으로, 비특이적 표면 결집 및 응집으로 인한 단백질 수율이 낮아지는 경우가 많다11,12 ,13. 최종 펩티디스크 어셈블리는 매우 열안정적이며 상이한 완충제 또는 이완 양이온(예를 들어, Ni2+)의 존재 하에 항상 용해된다. 스캐폴드의 순도 및 구조적 균질성은 또한 높다(예를 들어, 내독소-무), 펩티드는 상이한 위치에 배치된 작용기로 맞춤화될 수 있다.
우리는 여기에 PeptiQuick라는 실험실 워크플로우를 제시, 또한 온 - 비드 재구성으로 알려진9. 이 프로토콜은 막 단백질 정제 및 펩티디스크 재구성을 단일 단계와 동일한 크로마토그래피 지지체로 결합합니다. 이름에서 볼 수 있듯이, PeptiQuick은 다른 재구성 방법에 비해 빠르며 세제노출 시간도 심각하게 줄여줍니다. 단백질 전개 및 응집과 같은 부정적인 세제 효과는 종종 시간에 의존하는 방식으로 발생합니다. 따라서, 세제 노출을 최소화하는 것은 네이티브 단백질 형태14,15를유지하는 데 중요합니다. 이것은 단백질 상호 작용 및 리간드 결합 친화성에 보고하는 방법의 정확성을 위해 중요합니다.
이 프로토콜을 개발하는 동안, 우리는 펩티디스크 스캐폴드의 새로운 생체 동화 버전을 제시, 바이오 펩티디스크라고. 비오틴 작용기는 스트렙타비딘 코팅 표면에 표적 막 단백질을 부착할 수 있게 한다. 비오틴 라벨링은 스캐폴드로 제한되기 때문에, 표적 막 단백질의 결합 부위는 변하지 않은 채로 남아 있다. 바이오 펩티디스크를 사용하여, 세균막 수용체 FhuA 및 항균 펩티드 코카인 M(ColM)의 결합 역학이16결정된다. 이 친화성은 센서 팁에서 반사되는 백색광 간섭 패턴을 기반으로 실시간으로 상호 작용을 분석하는 생체층 간섭측정(BLI)을 통해 측정됩니다.
이 프로토콜을 사용하면 BLI 분석 중에 세제의 필요성이 제거되고, 이는 세제가 상호 작용을 방해할 수 있기 때문에 중요한 개발입니다. 결합 친화도는 이 방법으로 빠르게 측정될 수 있으며, 결과는 나노디스크 및 등온적 적정 열량계(ITC)16을사용하여 이전에 보고된 것과 비교할 수 있다. PeptiQuick 워크플로우의 중요한 단계는 단백질 제제, 세제 희석, 펩타이드 첨가 및 재구성과 같은 BLI 분석에서 리간드 및 분석물 결합문제를 해결하는 팁과 같은 설명및 논의됩니다. PeptiQuick 워크플로우를 사용하여, 막 단백질은 펩티디스크와 그 상호 작용에서 하루 안에 측정될 수 있다는 것을 발견되었습니다.
Protocol
1. 막 수용체 FhuA의 준비 및 용해
- 에스케리치아 대장균 균주 AW740에서 자신의6-태그 FhuA를 표현하십시오. M9 용지에서 37°C에서 18시간 동안 세포를 성장시다(표1). 자세한 발현 프로토콜은 Mills 외16을 참조하십시오.
- 세포를 원심분리(5,000 x g,10분, 4°C)로 수확하고 트리스-염글리세롤(TSG) 완충액 50 mL에서 다시 중단한다(표1). 다시 부유 한 세포를 훈구하고 페닐 메탄 설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 포염 직전에 1 mM의 최종 농도에 추가합니다.
주의: PMSF는 독성및 부식성입니다. - 8,000 psi에서 15,000 psi 또는 프랑스 프레스 (3 개의 대구)에서 미세 유체 (3 개의 대구)를 사용하여 세포를 라이즈. 저속 원심분리 (5,000 x g,10 분, 4 °C)에 의해 비용해 세포 및 기타 불용성 물질을 펠렛.
- 초원심분리체는 조막 분획을 분리하기 위해 상각체(200,000 x g,40분, 4°C)를 분리한다. 상급체를 버리고, 최소한의 TSG 버퍼로 멤브레인 펠릿을 재중단하고, 균질성을 보장하기 위해 유리 또는 금속 douncer 장치를 사용하여 dounce.
- 브래드포드 검정을 수행하여 재중단된 조막의 단백질 농도를 확인한다. 용해되기 전에 TSG 버퍼를 사용하여 원유 멤브레인을 최종 농도 3 mg/mL로 희석합니다.
- 세제 트리톤 X-100을 최종 농도 1% (v/v)에 추가하여 부드러운 흔들림으로 4°C에서 1시간 동안 세균 내부 막을 선택적으로 용해시킵니다. 초원심분리에 의한 불용성 물질(외부 막 분획)을 펠렛(200,000 x g,40분, 4°C).
- 용해된 멤브레인을 함유한 상급물질을 버리고 TSG의 펠릿을 3 mg/mL의 최종 농도로 다시 중단시킵니다. lauryldimethylamine 산화물 (LDAO)을 1 % (v / v)의 농도에 재 중단 된 외부 막 분획에 추가하고 부드러운 흔들림으로 4 °C에서 1 시간 동안 용해시킵니다.
- 모든 불용성 물질(200,000 x g,40분, 4°C)을 펠렛에 최종 원심분리 단계를 수행합니다.
참고: 결과 상급제는 그의 태그된 FhuA 표적을 포함하는 용해화된 외부 막 단백질을 함유한다.
2. PeptiQuick 워크플로우를 사용하여 FhuA의 정화 및 재구성
- 사전 포장된 Ni-NTA 컬럼(5 mL 수지 부피)을 2개의 컬럼 부피의 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 워시버퍼(표 1)를사전 보정한다.
- TSG를 사용하여 용해된 외부 막을 1% LDAO에서 0.04% LDAO로 희석합니다. 이어서, 5 mM의 최종 농도에 이미다졸을 첨가한다.
주의: 이미다졸은 독성이 있고 부식성이 있습니다. - 용해된 외부 막 단백질을 Ni-NTA 수지에 적재하고 유동을 수집합니다. 흐름스루를 수지 에 다시 로드하여 FhuA의 수지 결합을 증가시키고 보조 흐름을 수집합니다.
참고: 20 μL 의 용해물질 별칭을 후기 나트륨 도데실 설페이트 폴리아클레아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석에 대한 기준으로 서있다. - 250 mL의 IMAC 워시 버퍼로 수지와 세척하고 용출액의 첫 번째 50 mL를 수집합니다. 세척 버퍼를 수지 침대 부피의 높이로 배수하고 컬럼의 스톱콕을 닫습니다.
- 1 mL의 농축 된 10 mg / mL 바이오 펩티디스크 펩티드 펩티드 용액(표 1)을열에 추가합니다. TSG에 희석 1 mg / mL 바이오 펩티디스크 펩티드 용액 50 mL을 추가하고 TSG에서 구슬을 다시 중단하기 위해 유리 막대로 수지저어줍니다.
- 펩티디스크 트래핑 후, 수지가 수지에서 1 mg/mL의 과잉 바이오 펩티디스크 용액을 침전시키고 배출할 수 있도록 한다.
- TSG의 50 mL로 Ni-NTA 부착 펩티디스크 입자를 세척합니다. TSG에서 600 mM imidazole를 함유하는 IMAC 용출 완충제(표1)의15 mL로 펩티디스크 입자를 용출한다. 1 mL 분획을 수집하고 즉시 0.5 M EDTA의 10 μL을 추가하여 침출 된 니켈 이온을 킬레이트하십시오.
주의: EDTA는 자극제입니다.
3. 펩티퀵 재구성평가
- SDS-PAGE 분석
- 시작 물질의 10 μL aliquots를 로드, 흐름 통과, 세척 (es), 및 60 mA의 일정한 전류에서 30 분 동안 12 % SDS 분해 겔 및 전기 포어에 PeptiQuick 재구성에서 용출 분획.
- 쿠마시 블루 염료로 젤을 염색하고 젤을 염색한 다음 스캐너에서 시각화합니다.
- 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
- PeptiQuick 재구성의 12% SDS-PAGE 분석을 기반으로 관련 분획을 분리 및 풀화하고 30 kDa 컷오프 원심 농축기를 사용하여 집중합니다.
참고 : 함께 제공되는 비디오에서 분획 F3-F7은 함께 풀화되고 1 mL (SEC 계측기의 사출 루프 볼륨) 아래에 집중됩니다. - 풀링된 IMAC 용출 분획의 ~1 mL을 TSG 버퍼에서 0.25 mL/min의 유량으로 겔 여과 S200(300/10) 컬럼에 주입합니다. 1 mL 분획을 수집하고 12 % SDS 젤로 실행하여 어떤 SEC 분획을 풀앤 농축할지 결정합니다.
참고 : 용출 PeptiQuick 분획은 농도없이 풀러 질 수 있으며, aliquot는 재구성의 품질을 확인하기 위해 SEC에 주입 될 수있다. 이것은 원심 농도 도중 응고에 잠재적으로 과민한 막 단백질을 위한 중요한 통제입니다.
- PeptiQuick 재구성의 12% SDS-PAGE 분석을 기반으로 관련 분획을 분리 및 풀화하고 30 kDa 컷오프 원심 농축기를 사용하여 집중합니다.
4. 생체층 간섭측정
- BLI 실험 설정
- 손으로 96 웰 플레이트를 설정합니다.
참고: 모든 웰은 최종 부피 200 μL로 채워져 있습니다. - 열 1에서 A-E 행은 팁이 기준 신호를 일치시키고 형성할 수 있도록 200 μL의 역학 버퍼를 로드합니다.
- 리간드(바이오 펩티디스크의 FhuA)를 운동용 완충액에서 2.5 μg/mL의 농도로 희석한다(표1). 열 2의 행 A-D에 이 희석의 200 μL을 로드합니다.
- E2(기준 센서)에만 200 μL의 역학 버퍼를 추가합니다.
- 열 3에 200 μl의 역학 버퍼를 추가하고 A-E행을 사용하여 팁에서 과도한 FhuA를 세척합니다.
- 열 4에서 A4에서 D4까지 플레이트 아래로 2배 의 연속 희석을 수행합니다. D4에서 A4에서 28 nM(8*Kd)에서 3.5nM(1*Kd)로 시작합니다.
- E4에 28 nM ColM을 추가하여 비특이적 결합(사용된 가장 높은 ColM 농도)을 측정합니다.
- 열 5, 행 A−E에 200 μL의 역학 버퍼를 추가합니다.
참고: 여기서 ColM은 팁에서 해리되고 해리가 측정됩니다. - 설정 플레이트를 BLI 계측기의 위치에 놓습니다.
- 센서 팁 트레이를 BLI 기기에 놓습니다.
- BLI 데이터 수집 소프트웨어를 열고 소프트웨어 마법사에서 새 역학 실험을 선택합니다.
- 플레이트 정의 탭을 사용하여 96 웰 플레이트의 레이아웃을 소프트웨어에 입력합니다.
참고: 리간드, FhuA를 포함하는 웰이 "로드"로 입력됩니다. 버퍼만 포함하는 웰은 "버퍼"로 입력됩니다. Aalyte, ColM을 포함하는 웰은 "샘플"로 입력됩니다. - 분석 정의 탭을 사용하여 실험의 각 단계에 대한 시간 및 플레이트 회전 속도를 정의합니다.
참고 : 실험 단계는 다음과 같이 설정됩니다 : 1) 기준선 : 60 s; 2) 로딩: 250s; 3) 기준선2: 300s; 4) 협회 : 450 s; 및 5) 해리 : 900 s. 기본 (1,000 rpm)로 흔들림 속도를 둡니다. 위의 단계는 원하는 단계를 선택하여 96 웰 플레이트의 각 열에 개별적으로 할당되고 각 열에 분석 단계 추가를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. - 첫 번째 열을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 첫 번째 단계를 할당하고 새 분석 시작을 선택합니다. 오른쪽 아래 창을 사용하여 기준 단계가 올바르게 할당되었는지 확인하고 필요에 따라 드롭다운 메뉴를 사용하여 변경합니다.
- 플레이트를 따라 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 분석 단계 추가를선택하여 각 열에 후속 단계를 할당합니다. 4.1.13 단계에서 설정한 대로 적절한 열에 할당합니다.
- 센서 할당 탭을 사용하여 옥텟 계측기에서 센서 트레이의 올바른 위치에서 BLI 핀을 가져가고 있는지 확인합니다.
참고: 센서 할당 탭에서는 A1−E1만 파란색으로 강조 표시되어야 합니다. 센서 트레이의 이러한 위치에 센서 팁이 있는지 확인하고 F1−H1이 비어 있는지 확인합니다. - 화면에서 F1-H1을 강조 표시한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 제거를 선택하여 빈 것으로 표시합니다. 사용 후 용지함의 센서를 교체하여 사용한 센서를 유지합니다.
- 실행 하기 전에 실험의 최종 개요를 제공 하는 검토 실험 탭에서 전체 설정이 올바른지 확인 하려면 실험 단계를 이동 합니다.
- 실험 실행 탭에서 메서드 파일을 저장할 파일 위치를 선택합니다.
- 플레이트 온도를 실온으로 변경합니다.
- 실험을 실행하려면 GO를 선택합니다.
- 손으로 96 웰 플레이트를 설정합니다.
- BLI 데이터 분석
- Octet BLI 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다.
- 데이터 선택 탭을 사용하여 실험을 찾고 실험 요약을 확인합니다. 4.1.19 단계에서 정의된 저장 위치에서 프로젝트 파일을 가져옵니다.
- 각 실험에 대한 센서 정보를 선택하여 분석물의 농도(여기, ColM)를 입력합니다.
- E1의 팁을 참조 팁으로 지정합니다.
- 처리 탭을 사용하여 실험 데이터에서 참조 신호(E1)를 뺍니다. 비특이적 분석데이터 바인딩이 참조 팁에서 원시 데이터를 확인합니다. 아무 것도 관찰되지 않으면 계속진행합니다.
참고 : 이것은 중요한 부정적인 제어입니다. 비특이적 결합이 관찰되는 경우, 이것은 4.2.7 단계에서 설명될 것이다. - y축을 두 번째 기준선 단계에 정렬합니다. 계단 간 연결을 체크하지 마십시오. 사비츠키 골레이 필터링을 선택합니다. 프로세스 데이터를 선택합니다!.
- 분석 탭에서 플롯 아래표에서 실험 데이터를 선택하여 기준 센서의 신호가 빼진 연결 및 해리 곡선을 확인합니다.
- 1:1 바인딩 모델을 선택하고 부분 곡선 맞춤을 선택합니다. 커브 맞춤을 선택합니다!.
- 잔류 뷰 플롯을 분석하여 곡선 피팅을 확인합니다.
- 테이블을 스크롤하여 계산된 Kd.
- 보고서 저장을 선택하여 설정, 원시 및 분석 된 데이터의 플롯 및 계산된 해리 상수를 자세히 설명하는 스프레드시트 문서를 저장합니다.
Representative Results
막 수용체 FhuA는 실험실 대장균 균주에서 발현된다. 외부 막 분획은 원심 분리에 의해 수확되고, 단백질은 2 단계 세제 추출을 사용하여 용해됩니다. 용해막 단백질은 플라스틱 컬럼에 포장된 Ni-NTA 아가로즈 비드에 적재되고, 프로토콜에 제시된 PeptiQuick 워크플로우가 뒤따릅니다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 품질 관리를 마친 후, 바이오 펩티디스크 입자는 스트렙타비딘 코팅 핀에 고정됩니다. BLI 분석은 FhuA와 ColM 사이의 상호 작용의 역학을 측정하기 위해 수행됩니다. 이 실험의 개략적 개요는 그림 1에제시되어 있습니다.
SDS 겔은 IMAC 컬럼으로부터 FhuA 바이오 펩티디스크 입자를 용출한 후 재구성의 품질을 결정하기 위해 실행된다(그림2). 시작, 흐름, 세차 및 용출 분획에 해당하는 분획의 Aliquots는 PeptiQuick 방법의 성공을 평가하기 위해 SDS-겔상에 로딩됩니다. 유동 분획에서 FhuA의 고갈은 용출 분획의 농축과 상관관계가 있으며, 이는 단백질의 정제가 효과적이었다는 것을 나타낸다. 경미한 오염 물질 단백질 밴드는 용출 분획에서 관찰됩니다. SDS 겔 분석은 SEC 분석 전에 어떤 분획을 풀려야 하는지 결정하는 데 사용됩니다. 용출된 FhuA 바이오 펩티디스크 입자의 네이티브 겔은 또한 FhuA 용해도를 확인하기 위해실행된다(보충도 도 1). 재구성된 단백질을 기본 겔로 의이동은 세제 없는 환경에서 단백질 용해도를 나타낸다.
SEC 분석은 펩티디스크 입자의 용해도를 평가하기 위해 수행됩니다. 도 3A에 제시된 크로마토그램은 약 14 mL에서 단일 대칭 피크 용출을 나타낸다(겔 여과 S200 10/300 컬럼상 8.0 mL의 공극 부피를 지나 6 mL). 공극 부피를 지나이 피크의 위치는 FhuA 바이오 펩티디스크 입자의 용해도를 확인합니다. 참고로, 도 3B는 이론적인 최적이 아닌 펩티디스크 제제를 도시한다. 이 경우, 크로마토그램은 공극 부피에서 용출되는 더 큰 단백질 피크를 나타내며, 단백질 응집체의 존재를 나타낸다. 주요 펩티디스크 피크를 지나면 더 작은 피크용루는 과잉 펩티디스크 펩티드 펩티드에 해당한다.
FhuA와 Aa의 어말리액 ColM의 상호 작용은 펩티디스크를 스트렙타비딘 코팅 센서에 부착한 후에 결정됩니다. 센서 팁은 먼저 역학 버퍼에서 평형화된 다음 FhuA Bio-Peptidiscs를 포함하는 버퍼로 전달됩니다. FhuA 바이오 펩티디스크의 농도 및 팁으로 배양되는 시간의 길이는 본 실험 이전에최적화된다(보충도 1). 적재 및 세척 단계에 따라, 연관 단계는 로드된 팁과 4개의 상이한 농도의 배합된 알린산 M 사이의 상호작용을 측정한다. 팁의 후속 이동은 다시 버퍼로 해리를 초래하며, 이는 팁에서 반사되는 백색광의 파장 이동에 의해 측정됩니다.
그림 4A는 이 실험에서 원시 데이터 센서그램 출력을 표시합니다. 모든 트레이스는 참조 추적을 제외한 로딩 및 기준선 단계에서 노란색으로 균일하게 표시됩니다. 상기 기준 팁에는 리간드가 로드되지 않았지만 비특이적 결합에 대한 분석분석서에 노출되어 중요한 네거티브 컨트롤이다. 결과에 대한 보다 상세한 분석을 위해, 비특이적 결합을 설명하기 위해 실험 팁에 대한 추적에서 기준 팁의 신호가 차감된다. 도 4B와같이 직접 시각적 비교를 허용하도록 데이터가 연결 단계의 시작부분에 정렬됩니다. 이 비교는 배리틴 M의 농도증가를 위한 파장 이동의 증가를 나타낸다. 곡선은 데이터에 적합하며 클래식 1:1 바인딩 모델을 나타냅니다.
피팅과 실험 데이터의 차이를 설명하는 잔류 도측도플롯(도 4B,하단)은, 3개의 낮은 농도에 비해 가장 높은 농도의 ColM(28 nM)에 대한 피팅이 불량하다는 것을 나타낸다. 곡선 자체의 프로파일은 일반적인 결합 실험에서 결합 부위 포화의 특징인 결합 곡선 고원이 부족합니다. 고원의 부족은 높은 ColM 농도의 유물 일 가능성이 있는 이기종 결합을 시사한다. 따라서 이러한 가장 높은 ColM 농도는 분석으로부터 할인되고, 다른 3개의 농도는 해리 상수를 결정하는 데 사용된다(도4C,D). 2꼬리 학생의 t-test는, 95% 신뢰수준에서, 본 실험으로부터 관찰된 해리상수와 다른 기술을 사용하여 얻은 값과 유의하게 다르지 않다는 것을 발견하였다(도4E) 16.
그림 1: 바이오 펩티디스크 및 BLI 분석을 사용한 PeptiQuick 워크플로우에 대한 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SDS 겔 분석 (12%) PeptiQuick 워크플로우를 통해 수집된 시작, 흐름, 세척 및 용출 분획을 지원합니다. 약 10 μL의 샘플을 각 차선에 적재하고 60 mA의 일정한 전류에서 30 분 동안 달렸다. 젤을 쿠마시 블루로 염색하고, 얼룩을 염색하고, 젤 스캐너에 시각화시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 각각 최적 및 최적이 아닌 재구성을 나타내는 실험 및 이론적 SEC 프로파일입니다. (A)펩티퀵의 실험SEC 프로필은 바이오 펩티디스크에서 FhuA(~82kDa)를 재구성하였다. IMAC 용출 분획F3-F7을 30 kDa 컷오프 원심 농축기를 ~1 mL로 이용하여 풀레이션및 농축시켰다. 이러한 농축 시료를 0.25 mL/min에서 TSG 완충액의 겔 여과 S200(10/300) 컬럼에 주입하였다. (B)최적이 아닌 PeptiQuick 재구성의 이론적 SEC 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 바이오 펩티디스크에서 재구성된 FhuA와의 ColM 상호 작용을 조사합니다. (A)참조 센서 추적이 있는 원시 데이터 센서그램이 노란색입니다. (B, C) 맨 위: 부분 1:1 바인딩 곡선 피팅이 있는 연결 및 해리 단계입니다. 아래쪽: 실험 데이터와 계산 피팅의 차이를 묘사한 잔차 뷰입니다. (C)ColM의 농도가 가장 높은 것을 제외한(B)의다시 플로팅. (D)관찰된 연관 및 해리율(kon 및 koff각각) 및 해리 상수(Kd). (e)펩티디스크 및 BLI(본 실험에서), 펩티디스크 및 마이크로스케일 열영열영열영염(Saville, 미공개 데이터), 나노디스크 및 등온적 적정 열량계(16)에의해 얻어진 FhuA-ColM 해리상수의 비교. 오차 막대는 불확실성의 SD 를 나타내며 n.s.는 95% 신뢰 수준에서 유의한 차이를 나타내지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| M9 미디어(리터당) |
| 200 mL M9 소금 |
| 800 mL dH2O |
| 10 mL 40% 포도당 |
| 80 μL 1 M CaCl2 |
| 2.5 mL 1 M MgSO4 |
| 300 μL 15 mg/mL 티아민 |
| TSG 버퍼 |
| 50 mM 트리스-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM 나클 |
| 글리세롤 10% |
| IMAC 워시 버퍼 |
| 50 mM 트리스-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM 나클 |
| 글리세롤 10% |
| 0.04% LDAO |
| 5 mM 이미다졸 |
| 바이오 펩티디스크 솔루션 |
| 즉시 사용할 수 있는 바이오 펩티디스크(>95% 순도)를 멸균 dH2O에녹입니다. 펩티드 용액의 농도 및 부피는 재구성 공정의 단계에 의존한다. |
| 50 mM 트리스-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM 나클 |
| 참고 : 이 바이오 펩티디스크 펩티드 스톡은 한 달 이상 4 °C에서 안정적입니다. |
| IMAC 용출 버퍼 |
| 50 mM 트리스-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM 나클 |
| 글리세롤 10% |
| 600 mM 이미다졸 |
| 역학 버퍼 |
| 50 mM 트리스-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM 나클 |
| 0.002% 트웬-20 |
| 0.1% BSA |
표 1: 미디어 및 솔루션 준비를 위한 레시피.
보충 도 1: PeptiQuick 워크플로우로부터 수집된 용출 분획의 4%-16% 명확한 네이티브 겔 분석. 약 10 μL의 샘플을 각 차선에 적재하고 30 mA의 일정한 전류에서 40 분 동안 달렸다. 젤은 쿠마시 블루로 염색하고, 얼룩을 더하고, 스캐너에 시각화했습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 2: 단일 핀을 사용하여 리간드 농도 최적화. (A)바이오 펩티디스크에서 FhuA의 6가지 농도는 단일 스트렙타비딘 코팅 핀에 결합하기 위해 시험되었다. 이것은 리간드 농도 사이의 웰에 버퍼가있는 96 웰 플레이트에 설정되었습니다 (설치 프로토콜에 대한 보충 파일 1 참조). (B)리간드 최적화 실험을 위한 원시 데이터 센서그램. 핀은 가장 큰 응답을 제공하며 농도 번호 4 (또는 2.5 μg / mL)에서 포화 상태에 추가합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
세제는 막 단백질을 추출하고 정화하는 가장 간단한 방법으로 남아 있지만, 이러한 계면활성제는 단백질 안정성, 기능 및 다운스트림 분석1,2,3에많은 원치 않는 영향을 미칠 수있습니다. 4,5,6,7,8,9. 이러한 어려움은 세제의 존재를 최소화하고 가능한 한 네이티브 멤브레인 환경을 복제하기 위해 노력하는 멤브레인 모방제의 개발에 동기를부여했습니다2,3,4 ,5,6. 그러나 대부분의 재구성 방법은 재구성 조건의 상당한 최적화가 필요하며 종종 최종 수율7,8을감소시키는 추가 적인 정제 단계가 필요합니다. 펩티디스크는 자발적으로 표적막 단백질에 적응하고 비교적, 최적화 및 하류정제가거의 필요하지 않으며9,10. 이 프로토콜에서 PeptiQuick은 다운스트림 단백질 상호 작용 분석을 위한 재구성 프로토콜을 간소화하는 간단한 수단으로 제시됩니다.
간단하지만, 실패한 재구성으로 이어질 수있는 몇 가지 실험주의 사항이 있습니다. 이들 중가장 일반적인 것은 단백질 응집 때문입니다. 따라서 재구성 프로세스를 모니터링하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 보이드 부피에서용해되는 크기 배제 피크는 단백질 응집체를나타낸다(도 3B)17,18. 막 단백질 응집체는 일반적으로 재구성하기 전에 최적 이하 세제 조건에 장기간 노출될 때 형성됩니다. 특히, 세제내 막 단백질은 원심장치에 초여과하여 농축될 때 응집체를 형성하는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 이 경우, 민감한 막 단백질은 필터에 단백질의 흡착이 감소되기 때문에 진공 초여과, 보다 부드럽고 보다 균일한 농도 방법을 사용하여 농축될 수 있다.
일반적으로, 단백질 농도를 피하기 위해, 용출 된 IMAC 분획을 풀아야하며, 그 재구성 품질을 확인하기 위해 크기 배제 컬럼에 주입 된 aliquot. 주요 펩티디스크 피크 직후에 통합되지 않은 자유 펩티드용적(도 3B)에유의해야 한다. 자유 스캐폴드가 반드시 다운스트림 실험을 방해하지는 않습니다. 그러나, 필요한 경우, 이 과잉은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 재구성 시 세척 부피를 증가시키고, IMAC 수지로부터용출되기 전에, 대부분의 자유 펩티디스크 펩티드 펩티드를 효과적으로 제거하기에 충분하다. 따라서 크기 배제 크로마토그래피는 재구성 품질을 확인하는 빠르고 간단한 방법으로 권장됩니다.
BLI 실험은 리간드 및 해석문자 농도를 신중하게 최적화해야 합니다. 리간드 결합은 명확한 신호를 얻기에 충분해야 하지만 과부하로 인해 신호 포화가 발생하여 과밀화로 인한 데이터 아티팩트와 팁 표면의 스테릭 장애가 발생합니다. 따라서, 리간드의 농도와 팁이 리간드 용액에서 소비하는 시간의 길이 는 각각의 단백질 샘플에 대해 최적화되어야한다(보충도 2). 또한 해석액 농도도 최적화되어야 합니다. 해리 상수가 알려진 경우, 농도 범위가 근사화 될 수 있기 때문에,이 단계는 쉽게된다. 이 분석을 위한 좋은 출발점은 예상된 Kd19의0.1-20배 사이 단백질 농도를 이용하는 것입니다.
BLI 데이터 수집 후 잘못된 해석을 방지하기 위해 신중한 데이터 분석을 수행해야 합니다. 해리 상수의 계산은 바인딩 곡선의 적합에 따라 달라집니다. 결합 성 포이치오metry가 이미 알려져 있는 경우가 아니면, 초기 피팅에 고전 1:1 이중 분자 상호작용 모델을 사용해야 합니다. 이기종 결합 곡선은 종종 복잡한 결합 모델로 잘못 해석 될 수있는 높은 해석물 농도로 인한 유물 및 비 이상적인 행동의 결과입니다. 따라서 센서그램 프로파일이 1:1 결합 을 표시할 때까지 분석체 농도를 낮추면 보다 복잡한 상호 작용과 이기종 결합을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 모든 잔류 이질 바인딩 데이터는 그림 420에나타낸 대로 할인됩니다.
이 보고서에서, FhuA-ColM 상호작용에 대한 2.28±0.74 nM의 해리 상수가 측정된다. 이러한 값은 각각 ITC 또는 MST를 사용하여 나노디스크 또는 펩티디스크를 이용한 우리 그룹에서 이전에 결정된 해리상수와 일치한다(도4E)16. 이러한 일관성은 상호 작용 역학을 결정하는 수단으로 펩티디스크 재구성 및 BLI 분석에 대한 자신감을 제공한다. 중요한 것은, 단백질은 일반적으로 대장균 비오틴 리가제 BirA21을사용하여 비오틴 화학 적 가교 또는 부위 별 첨가를 통해 스트렙타비딘 바이오 센서에 고정된다는 점에 유의해야 한다. 분명히, 펩티디스크 스캐폴드를 표적 막 단백질 대신에 생체면역화하는 것은 많은 장점이 있다. 스캐폴드 바이오티닐화는 시간을 절약하고 중요한 단백질 결합 부위를 방해할 가능성을 최소화합니다. 우리는 또한 PeptiQuick이 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs), 이온 채널 및 β 배럴 막 단백질을 포함하여 광범위한 단백질 표적 클래스에 적용 가능하다는 것을 발견했습니다. 일반적으로, 막 단백질의 초기 세제 추출물이 골재가 없는 상태로 들어가는 것이 중요하며 펩티디스크의 즉각적인 재구성은 하류 응집 문제를 감소시킵니다. 단순성을 감안할 때, PeptiQuick은 표면 플라스몬 공명 (SPR), ELISA assays 및 스트렙타비딘 구슬을 사용하여 친화도 풀다운과 같은 다른 스트렙타비딘 기반 결합 성 어설슬로 확장 될 것으로 구상됩니다.
Disclosures
FD는 펩티디스크 펩타이드를 학계에 배포하는 펩티디스크 생명공학의 창시자입니다. Peptidisc 생명 공학은 또한 그들의 발견 워크플로우에서 펩티디스크를 구현하기 위하여 산업 생명 공학 및 제약 회사와 협력하고 있습니다. 이 문서의 오픈 액세스 게시는 FortéBio에 의해 후원되었다.
Acknowledgments
우리는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회에 감사드립니다. JS는 CGS-M CIHR 장학금을 보유하고 있습니다. LT는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 자금 사우스 웨스트 생명 과학 박사 교육 파트너십 [교육 보조금 참조 BB / M009122/1]에 의해 지원되었다. FD는 계층 II 캐나다 연구 의자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | - |
| Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
| Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
| CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
| EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
| Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | - |
| Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
| Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
| Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
| MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
| Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
| Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | - |
| Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
| Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | - |
| Protein Assay Dye - Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration |
| Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
| Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
| Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | - |
| Thiamine | Merck | 69271 | - |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
| Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
| Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
| Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | - |
References
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