Summary
Kärnytan sprider sig är ett oumbärligt verktyg för att studera kromosom händelser under meios. Här demonstrerar vi en metod för att förbereda och visualisera meiotiska kromosomer under profas I från zebrafiskar spermatocyter.
Abstract
Meios is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Modell organismer har varit avgörande för att förstå kromosom händelser som äger rum under meiotiska prophase, inklusive parning, synaps och rekombination händelser som säkerställer korrekt kromosom segregation. Medan musen har varit en viktig modell för att förstå de molekylära mekanismer som ligger till grund för dessa processer, är inte alla meiotiska händelser i detta system analoga med mänsklig meios. Vi visade nyligen zebrafiskens spännande potential som en modell av mänskliga spermatogenes. Här beskriver vi, i detalj, våra metoder för att visualisera meiotiska kromosomer och tillhörande proteiner i kromosom spridning preparat. Dessa preparat har fördelen av att tillåta högupplöst analys av kromosomstrukturer. Först beskriver vi förfarandet för dissekera testiklar från vuxna zebrafiskar, följt av celldissociation, lys och spridning av kromosomerna. Därefter beskriver vi förfarandet för att upptäcka lokalisering av meiotiska kromosomproteiner, genom immunfluorescensdetektion, och nukleinsyra sekvenser, genom fluorescens in situ hybridisering (FISH). Dessa tekniker utgör en användbar uppsättning verktyg för cytologisk analys av meiotisk kromatin arkitektur i zebrafisk systemet. Forskare i zebrafisk samhället bör kunna snabbt behärska dessa tekniker och införliva dem i sina standardanalyser av reproduktiv funktion.
Introduction
Sexuell reproduktion fortsätter genom kombinationen av två haploid gametes, var och en bär hälften av kromosom komplement av en somatisk cell. Meios is a specialized cell division that producerar haploid gametes through one round of DNA replication and two successive rounds of kromosome segregation. I profas I måste homologa kromosomer (homologs) genomgå parning, rekombination och synaps, varav den senare kännetecknas av bildandet av synaptonemal-komplexet som består av två homologa axlar som överbryggas av tvärgående glödtråd, Sycp1(figur 1A,B). Underlåtenhet att korrekt utföra dessa processer kan leda till produktion av aneuploid gametes, som är en ledande orsak till missfall hos människor1. Vår kunskap om samordningen mellan parning, rekombination och synaps har underlättats av studier i ett brett spektrum av organismer, såsom jäst, C. elegans,mus och Drosophila, bland annat2. Medan den allmänna processen för homologk kromosompar följt av segregation är väl bevarad, dess beroende av rekombination och synaps och ordningen på dessa händelser varierar.
Meiotic dubbel-strand break (DSB) formation, som initierar homolog rekombination, sker nära telomerer klustrade i buketten under leptoten och synaps is följer strax efter3,4. Denna konfiguration av DSB bildning och synapsis inledande är också ett kännetecken för manlig meiosis hos människor men inte i mus5,6,7,8, vilket tyder på att zebrafisk kan fungera som en modell för mänskliga spermatogenes. Det finns också flera praktiska fördelar med att studera zebrafisk meiosis. Både män och kvinnor genomgår gametogenesis under hela vuxenålder, deras gonads är lättillgängliga, och hundratals avkommor genereras från ett enda kors. Dessutom är embryona transparenta och utvecklas externt, vilket underlättar tidig upptäckt av avvikelser i embryonal utveckling på grund av aneuploid gametes3,9. Nackdelar med att använda zebrafisk är att de är långsamma med att nå sexuell mognad (~ 60 dagar) och mängden material som behövs för nukleära ytspridningar måste samlas in från ~ 10-20 vuxna djur, beroende på deras storlek.
Meiotic kromosom spridning preparat är ett viktigt verktyg för att studera kromosom dynamik över alla modell organismer, eftersom viktiga signaturer av meiotic kromosom dynamik kan undersökas. I zebrafisk, viktiga aspekter av utvecklingen av meiotic programmet och nukleära organisationen har dissekerats genom sondering nukleära ytspridningar, som här kallas kromosom sprider sig, med antikroppar för immunfluorescens detektion av proteiner och / eller nukleinsyror av FISH3,4,9,10,11,12. I själva verket kan den polariserade lokaliseringen av klustrade telomerer i buketten bevaras i spridningsberedningen (figur 1C). Nyligen har vi använt zebrafisk spermatocyte kromosom sprider sig tillsammans med fluorescens detekteringsmetoder och super-upplösning mikroskopi för att belysa den detaljerade utvecklingen av zebrafisk telomerdynamik, homolog kromosom ihopkoppling, dubbel-strand break lokalisering, och synaps vid viktiga meiotic övergångar3. Här presenterar vi metoder för att förbereda kromosom sprider sig från spermatocyter av zebrafisk testiklar och därefter fläcka dem med fluorescerande peptid nukleinsyra (PNA) sonder till upprepade telomersekvenser och immunfluorescens detektering av kromosom associerade proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som omfattade zebrafiskar utfördes med hjälp av etiska standarder som godkänts av institutionalanimal care and use committee vid UC Davis.
1. Kromosom spridningsförfarande
OBS: Följande protokoll är utformat för att skapa 4-6 bilder, med hundratals spridda meiotic kärnor per bild. Antalet testiklar som används beror på fiskens storlek. Räkna med att använda 20 djur på ~ 60 dagar efter befruktning (dpf) och 15 djur på ~ 6 månader efter befruktning (mpf). För stora zebrafiskar (t.ex. 12 mpf) bör 10 djur vara tillräckliga. Tänk på att testiklar av vissa meiotiska mutanter (t.ex. spo11-/-) kommer att vara något mindre3. I det här protokollet betraktas en testibil som ett enda prov. Det rekommenderas att inte mer än 4 prover bereds parallellt.
- Gör följande lösningar innan spridningsproceduren påbörjas
OBS: Det är bekvämt att förbereda följande lösningar i de kvantiteter som anges för användning i framtida spridningexperiment.- Förbered en 0,1 M sackaroslösning genom upplösning 3,42 g sackaros i 100 ml destillerat vatten. Ta sackaroslösningen till pH 8 med 1 M Tris-HCl som också är på pH 8. Filtrera sedan sterilisera sackaroslösningen. Förvara i rumstemperatur.
- Gör en 10x fosfat-buffrad koks (PBS) lagerlösning till en slutlig koncentration av 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 och 27,6 mM KH2PO4 i 1,8 L av destillerat vatten. Rör om tills upplöst, justera sedan pH till 7,3 med NaOH och autoklav. Förvara i rumstemperatur.
- Gör en 400 μg/ml DNase I-lösning i sterilt destillerat vatten. Förvaras vid -20 °C. Det rekommenderas att förbereda 5 ml av denna lösning och sedan lagra som 100 μL alikvoter.
- Gör följande lösningar på dagen för spridningsprotokollet
OBS: För tideffektivitet är det bäst att göra kollagenlösning omedelbart efter dissekering alla testiklar och sedan göra trypsin och trypsin hämmare lösningar under den tid som proverna behandlas i kollagen.- Lös upp 4 mg kollagen i 200 μL av Dulbeccomodifierade Eagle medium (DMEM) per prov (2% w/v kollagenas slutliga koncentration). Håll på is tills det behövs. Kollagen kommer att separera testiklarna.
- Lös upp 1,4 mg trypsin i 200 μL DMEM per prov (0,7% w/v trypsin slutlig koncentration). Håll på is tills det behövs. Trypsin hjälper till att skilja cellerna.
- Lös upp 10 mg trypsinhämmare i 500 μL DMEM per prov (2% w/v trypsinhämmare slutlig koncentration). Håll på is tills det behövs. Trypsinhämmare förhindrar trypsin från att försämra cellerna.
- Förbered en 1% formaldehydlösning (från en 16% färdig lösning) med 0,15% Triton X-100 i sterilt destillerat vatten. Håll på is tills det behövs. Den 1% formaldehyd kan förberedas medan testiklarna behandlas med trypsin och DNase I (dvs. under steg 1.4.7 av spridningsförfarandet).
VARNING: Formaldehyd är farlig.
- Dissekering av testiklar från vuxna manliga zebrafiskar
- Avliva manliga zebrafiskar (> 60 dpf) genom att nedpulera dem i isvatten. Fisken kan förvaras i isvatten tills den är klar att dissekera, men de bör dissekeras så snart som möjligt.
OBS: Wild-type stam AB används för detta förfarande, men andra vilda stammar bör också vara mottagliga. Den längsta tiden har vi hållit fisk i isvatten innan dissekering är 3 h utan någon märkbar effekt på protokollet. - Halshugga en fisk i taget med liten sax och sedan använda mikrosax för att skära längs den ventrala mittlinjen för att exponera kroppshålan.
- Dissekera testiklarna med hjälp av pincett (se Materialtabell)vid 1.65x förstoring under mikroskop. Utför dissektionerna i en silikonbelagd Petriskål med täckt av en grund pool på 1x PBS.
OBS: Testis en mellan simblåsan och tarmen och kommer att visas lättare än muskelvävnad(figur 2A). Testisen ska ha 2 lober när de tas bort från zebrafisken(figur 2B). - Ta bort så mycket fett och omgivande vävnad från testiklarna som möjligt. Lägg sedan till varje dissekerat testis direkt i ett 5 ml-rör med 2 ml DMEM och håll på is.
OBS: Steg 1.3.3 och 1.3.4 bör bemästras innan du gör några experiment.
- Avliva manliga zebrafiskar (> 60 dpf) genom att nedpulera dem i isvatten. Fisken kan förvaras i isvatten tills den är klar att dissekera, men de bör dissekeras så snart som möjligt.
- Dissociation av testiklar
- Förvarm 100 ml 0,1 M sackaroslösning till 37 °C.
- Tillsätt 200 μl kollagenilösning till 5 ml-röret med testiklarna. Blanda lösningen genom att invertera den flera gånger.
- Skaka försiktigt testiklarna i en inkubatorshaker horisontellt vid 100 rpm vid 32 °C i 50 min till en timme tills DMEM är grumlig och testiklarna är i små bitar. Snabbt invertera röret var 10 min för att underlätta dissociation.
- För att tvätta bort kollagen, tillsätt DMEM till en slutlig 5 ml volym och invertera röret några gånger. Pellet testiklarna vid ~200 x g i 3 min vid rumstemperatur. Ta bort 3 ml av supernatanten så att endast 2 ml återstår.
OBS: Tillsats, avlägsnande och överföring av DMEM görs med plast överföringspipetter för hela kromosomspridningsförfarandet. - Upprepa steg 1.4.4 två gånger mer för totalt 3 DMEM tvättar. Avbryt inte pelleten mellan DMEM-tvättar. Efter den sista DMEM tvätta, ta bort 4 ml av supernatant så att endast 1 ml kvar.
- Tillsätt 1 ml DMEM för en total volym på 2 ml och tillsätt 200 μL av trypsinlösningen och 20 μL DNase I-lösning. Invertera röret några gånger för att blanda lösningen.
- Skaka röret horisontellt vid 32 °C i 5-15 min vid 100 rpm tills DMEM-lösningen innehåller endast några klumpar. Snabbt invertera röret var 5 min för att underlätta dissociation.
OBS: Klumparna ska vara betydligt mindre efter skakningar. - Tillsätt 500 μl av trypsinhämmarelösningen och 50 μL DNase I-lösning. Invertera röret några gånger för att blanda, sedan kort snurra ner på ~ 200 x g i 3 min vid rumstemperatur för att ta bort vätska eller klumpar som kan fastna på röret locket eller sidan av röret.
- Placera röret på is och återsuspend cellfjädringen genom att upprepade gånger pipetta upp och ner med en plastöverföring pipett i 2 min för att underlätta dissociation av eventuella återstående klumpar. Låt inte cellsuspensionen gå in i lampan på överföringspipetten. Efter 2 min, pipette fjädringen tillbaka i 5 ml röret.
- Förvåt en 100 μm cell sil med DMEM och placera den ovanpå en 50 ml rör på is.
- Överför cellfjädringen genom silen ett fall i taget med hjälp av en plastöverföring pipett. Se till att cellfjädringen inte går in i lampan på överföringspipetten.
- Överför filtratet med hjälp av en plastöverföring pipett till en ny 5 mL rör och lägga DMEM till en slutlig volym på 5 ml. Var noga med att samla in de poolade cellerna som är fästa vid undersidan av filtret med en ren plastöverföring pipett. Pellet cellerna på ~ 200 x g för 5 min i rumstemperatur.
- Ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten.
- Tillsätt 5 μL DNase I-lösning direkt i pelleten. Blanda sedan pelleten med DNase I-lösningen genom att försiktigt skrapa rörets ytterbotten 4-5 gånger längs ett tomt 1,5 ml mikrocentrifugrörställ. Skrapning för hårt kan resultera i en minskning av återvunna spreadar.
- Lägg DMEM till en slutlig volym på 5 ml och blanda lösningen genom att invertera röret flera gånger. Det är vanligt att klumpar fortfarande är närvarande efter den första DNase I behandling.
- Pellet cellfjädringen vid ~200 x g i 2 min vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 1.4.13-1.4.16 ytterligare 1-3 gånger tills den resuspenderade pelleten inte klumpar vid tillsats av DMEM. Efter det sista snuten, ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten.
OBS: Förvänta dig en minskning av pelletsstorlek med varje DNase I behandling; överstiger 4 totala DNase I tvättar kan resultera i betydande förlust av celler. Om ingen pellet är synlig efter DNase I behandlingar steg, fortsätt inte med förfarandet. Kasta alla oanvända DNase I. - Tillsätt 1 ml 1 x PBS och resuspend pelleten genom att försiktigt skrapa rörets utsida längs ett tomt 1,5 ml rörställ.
- Pellet cellen suspension på ~ 200 x g för 5 min sedan ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelleten.
- Skär ~3 mm från slutet av en 200 μL pipettspets för att vidga bländaren och återsuspendpelleten i ~80 μL 0,1 M sackaroslösning genom att pipetta upp och ner med den skurna pipettspetsen. Låt cellsuspensionen sitta i rumstemperatur i 3 min.
- Sprida kromosomer på glasrutschbanor
- Coat en bild med 100 μL av 1% formaldehyd med 0,15% Triton X-100 med sidan av en pipett spets. Tillsätt sedan 18 μL av sackaroscellfjädring på mitten av bilden i en rak linje vinkelrät mot långsidan. Luta bilden fram och tillbaka (~60°) för att underlätta spridning av cellfjädringen till alla hörn.
- Placera diabilderna platt ner i en något sprucken öppen fuktkammare (figur 3) för att förhindra att formaldehydlösningen torkar. Placera fuktkammaren i en mörk låda över natten.
- Ta bort locket från fuktkammaren och låt rutschkanorna torka helt.
- Placera rutschkanorna i en Coplin burk och fyll sedan Coplinburken med destillerat vatten och inkubera i 5 min med mild skakning i rumstemperatur.
OBS: Bilderna kan placeras i Coplin burken i ett sicksack mönster för att maximera antalet bilder per Coplin burk. Se till att det finns utrymme för vätska att passera mellan alla diabilder. - Häll ut vattnet och fyll burken med 1:250 vätningsmedel (se Materialbord). Tvätta 2 gånger i 5 min var med mild skakning i rumstemperatur.
- Låt bilderna torka helt och förvaras vid -20 °C tills de är färgade.
OBS: Den längsta vi har lagrat diabilder utan någon märkbar nedbrytning av kromosomerna är ~ 2 månader.
2. Telomere PNA sond färgning
OBS: Telomere upprepar kan färgas med fluoroffors-konjugated telomer PNA sonder som hybridiserar till ledande sträng telomerupprepar (CCCTAA). PNA sonder har en neutral ryggrad, vilket ökar hybridisering affinitet till negativt laddade DNA, vilket resulterar i liten eller ingen bakgrund. Det telomera sonderingssteget är valfritt. För att gå vidare till antikroppsfärgning, rehydrate glider i 1x PBS som anges i steg 2.2.2., fortsätt sedan direkt till "Primär antikroppsfärgning".
-
Gör PNA-sondenreagenser innan telomerfärgning
OBS: Det är bekvämt att förbereda följande lösningar i de kvantiteter som anges för användning i framtida experiment. Lagringsförhållandena noteras nedan.- Förbered 2 L av 20x saltlösning (SSC) lösning med en slutlig koncentration av 3 M NaCl och 0,3 M natriumcitrat. Autoklav och förvara i rumstemperatur.
- Gör 50 ml förhybridiseringslösning som innehåller överföring AV RNA till en slutlig koncentration på 50% formamid, 5x SSC, 50 μg/mL heparin, 500 μg/ml överföring RNA, 0,1% Tween 20 och tillsätt 460 μL 1 M citronsyra för att få lösningen till pH ~6. Förvaras vid -20 °C.
VARNING: Formamid är farligt. Förbered lösningen i en rökhuva. - Gör 50 ml förhybridiseringslösning förberedd på samma sätt som i steg 2.1.2 utan att lägga till transfer RNA. Förvaras vid -20 °C.
- PNA telomere sonder TelC-Cy3 och TelC-Alexa647 är beredda som 50 μM lager i formamid enligt tillverkarens instruktioner. Förvara PNA-sonderna som 8 μL aliquots vid -80 °C.
- Gör minst 1 ml 100 mg/mL-lagerlösning av bovinserumsalbumin (BSA) i sterilt destillerat vatten. Förvaras vid -20 °C. Om du förbereder mer än 1 ml lager BSA, lagra lösningen som 1 ml aliquots.
- Använd ett 2 ml-rör, förbered 2 ml hybridiseringslösning genom att tillsätta 27 μL 100 mg/mL BSA och 8 μL 50 μM PNA-sond till 1,965 ml prehybridiseringslösning som innehåller överföring AV RNA. Förvaras i mörkret vid -20 °C.
-
PNA telomersond färgning
- Värm hybridiseringsugnen till 82 °C.
- Återfukta rutschkanorna med 500 μL 1x PBS per bild i 5 min i en fuktkammare vid rumstemperatur. Ta bort PBS genom att trycka på sidan av bilden på en pappershandduk.
- Värm rutschkanorna och 2 ml-röret som innehåller hybridiseringslösningen direkt på en metallyta i den uppvärmda hybridiseringsugnen i 2 min.
- Medan du håller diabilderna på metallytan, tillsätt 100 μl av hybridiseringslösningen per bild och täck sedan glidbanorna med plasttäcke (~25 mm x 75 mm) skuren för att forma ur en autoklavpå. Låt bilderna sitta vid 82 °C i 10-12 min.
- Placera rutschkanorna i en fuktkammare i mörker vid 37 °C för 16-24 h. Från denna punkt framåt och för den primära och sekundära antikroppsfärgning, måste bilderna hållas i mörkret för att undvika fotoblekning av fluorescenssignalen. Efter inkubationstiden kan reagenser för antikroppsfärgning förberedas under steg 2.2.9.
- Ta bort täcksbacken med en pipettspets.
OBS: För att underlätta avlägsnandet av täckslip, ~ 50-100 μL av hybridiseringslösningen utan överföring RNA kan försiktigt dispenseras mellan glidbanan och täckslip som täckslip lyfts. - Pipett 500 μl förhybridiseringslösning utan överföring RNA på varje glidning och placera rutschkanorna i fuktkammaren i 15 min i rumstemperatur. Ta bort lösningen genom att trycka på sidan av bilden på en pappershandduk.
OBS: Prehybridiseringslösningen utan överföring rna är inte förvärmd innan den läggs till på varje bild. - Pipett 500 μL av 50% prehybridiseringslösning utan överföring RNA i 1x PBS till varje bild och placera rutschkanorna i fuktkammaren i 15 min vid rumstemperatur. Ta bort lösningen genom att trycka på sidan av bilden på en pappershandduk.
- Överför bilderna till en Coplin burk och tvätta 3 gånger i 1x PBS med mild skakning i 15 min per tvätt i rumstemperatur.
- Ta bort bilderna från Coplin burken och ta bort överflödigpbs genom att trycka på sidan av bilden på en pappershandduk. Fortsätt sedan att steg 3,2 "Primär antikroppsfärgning".
3. Antikroppsfärgning
OBS: Antikroppar upp till kända meiotiska proteiner kan användas för immunfluorescens detektion i sprida kromosom preparat. Sekundära antikroppar som konjugeras till olika fluorofforer gör det möjligt att färgas flera proteiner samtidigt, om de primära antikropparna har tagits upp hos olika djur.
-
Gör följande lösningar på dagen för den primära och sekundära antikroppsfärgning
- Gör 1 L av PBT med 1x PBS och 0,1% Triton X-100 utspädd i destillerat vatten. Förvara i rumstemperatur. Detta kan förberedas i förväg och i stora mängder för framtida spridningexperiment.
- Förbered 500 μl antikroppsblock per bild till en slutlig koncentration av 2 mg/ml bSA och 2% getserum i PBT.
- För att göra 100 μl primär eller sekundär antikroppsblandning per bild, tillsätt lämpliga antikroppar vid rätt koncentration (se Materialtabell)i antikroppsblocket.
OBS: Antikroppskoncentration kan behöva bestämmas empiriskt. I diskussionen inkluderar vi en lista över antikroppar som vi har försökt med framgång (med utspädning / koncentrationer) och de vi har försökt utan framgång.
-
Primär antikroppsfärgning
OBS: Kanin anti-mänskliga SCP3 och kyckling anti-zebrafisk Sycp1 används vanligtvis för primära antikroppar färgning.- Efter att ha tagit bort överflödigpbs från bilderna, tillsätt 500 μl antikroppsblock per glidning och placera rutschkanorna i en fuktighetskammare i rumstemperatur i minst 20 min.
- Ta bort antikroppsblocket genom att trycka på sidan av bilden på en pappershandduk.
- Tillsätt 100 μl primär antikroppsblandning i antikroppsblock per glidning och täck glidbanorna med ett plasttäcke gjort av en autoklavpå. Placera rutschkanorna i en fuktkammare över natten vid 4 °C.
- Ta bort täckglidermed en pipettspets och tvätta rutschkanorna 2 gånger i minst 5 minuter vardera med 1x PBS i en Coplin burk med mild skakning i rumstemperatur.
- Ta bort PBS genom att trycka på sidan av bilden på en pappershandduk.
-
Sekundär antikroppsfärgning
OBS: Konjugerade getanti-kanin och anti-kyckling antikroppar mot olika fluorforer används för färgning vid en 1:1000 koncentration.- Tillsätt 500 μl antikroppsblock per glidoch placera rutschkanorna i fuktkammaren vid rumstemperatur i minst 5 min.
- Ta bort antikroppsblocket genom att trycka på sidan av bilden på en pappershandduk.
- Tillsätt 100 μl sekundär antikroppsblandning i antikroppsblock per glidning och täck glidbanorna med ett plasttäcke gjort av en autoklavpå. Placera rutschkanorna i en fuktkammare i 1 h vid 37 °C.
- Ta bort täckglidermed en pipettspets och tvätta rutschkanorna 3 gånger i minst 5 min vardera med 1x PBS i en Coplin burk med mild skakning i rumstemperatur.
- Skölj bilderna en gång i minst 2 min med destillerat vatten i en Coplin burk med mild skakning i rumstemperatur.
- Lufttorka rutschkanorna lutas, för att underlätta torkning.
- Placera 20 μl antifadefäste med eller utan DAPI (se Materialbord)som 3 jämnt fördelade prickar på glasskydd (24 mm x 60 mm).
- Placera rutschkanorna nedåt på glastäcket och försegla sedan täckreglaget med nagellack på kanten som överlappar den frostade änden av bilden.
- Förvara de förberedda bilderna vid 4 °C tills den är klar för bildbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har skisserat en metod för att förbereda och visualisera zebrafiskar spermatocyte sprida preparat. När det utförs korrekt, ger vårt förfarande väl spridning, icke-överlappande kärnor. För att återvinna en sådan kärnor är det viktigt att ha lämplig mängd utgångsmaterial (dvs. testiklar), behandla testiklar na under en tillräckligt lång tid i trypsin och ett tillräckligt antal DNase I-behandlingar. Dessa sprider kan sedan färgas för telomerer och meiotiska proteiner för att studera meiotic progression under profas I. Figur 1 skildrar exempel på spridning preparat färgas för kromosomalfunktioner i olika stadier av profas I. Figur 4 illustrerar ett exempel på dåligt sprida kärnor.
Bild 1: Representativa superupplösningsbilder av kromosomspridningspreparat färgade med PNA och antikroppssonder. (A)Schematisk av synaptonemal komplexet. (B)Ett synapsed par homologs som visar kromosomaxelproteinet Sycp3 (grön), det tvärgående glödtrådsproteinet Sycp1 (röd) och DNA (Blå) avbildad av strukturell belysningmikroskopi (SIM) med ett 100x-mål. Skalan bar = 1 μm. (C) Panelerna till vänster visar tre stadier av meiotic prophase: leptoten (överst), tidig-zygoten (mitten) och pachytene (botten). Skalstången = 5 μm. Höger: representativa bilder som innehåller telomerer (magenta) för varje steg. Fjällstången = 1 μm. Siffrorna är anpassade från Blokhina m.3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på zebrafisktestor (~7 månader efter befruktning). (A) Bilden visar testisens relativa placering inom zebrafisken. Testisen sitter mellan simblåsan och tarmen. (B)Längden på en testis. Yngre zebrafiskar kommer att ha mindre testiklar. För kromosomsprider, ta bort så mycket fett och omgivande vävnad som möjligt från testiklarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Fuktkammare för diabilder. Vår fuktkammare är tillverkad med hjälp av en polystyren skumlåda (21 cm x 19 cm x 6 cm) utformad för att fartyg elektroporation cuvettes. Vi satte in våta tunna vävnadsservetter (se Materialbord)i alla andra spår. Bilderna placeras platt ovanpå åsarna utan att vidröra våtservetterna. En kommersiell fuktkammare finns också (se Materialtabell). Vi föreställer oss att alla polystyren skumlåda förseddmed åsar och spår (t.ex. med hjälp av glaskärnor13)kan användas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på spridning av dålig kvalitet på grund av otillräckliga DNase I-behandlingar. Meiotic kromosomer färgade för Sycp3 avbildas av SIM med hjälp av en 20x mål. Otillräckliga DNase I behandlingar leder till överlappande kärnor på grund av en viskös sackaros cell suspension som hindrar celler från att ordentligt sprida sig på bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Exempel på kromosomspreadar med en alternativ metod11. Meiotic kromosomer färgade för Sycp3 (grön) och Sycp1 (röd). Kromosomsprider utarbetades som beskrivs av Sansam och Pezza11. Denna metod kan utföras med hjälp av enskilda zebrafiskar snarare än de flera zebrafiskar som krävs för vårt protokoll. I våra händer är det vanligt att se kromosomer som inte är väl spridda. Det finns också en märkbar ökning av bakgrundsfärgning som beror på skräp som finns kvar på bilderna under kromosomspridningsproceduren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi metoder för att undersöka platsen för telomerer och kromosom-associerade proteiner i nukleära ytbehandlar sprider från spermatocyter isolerade från zebrafisk testiklar. Vi förväntar oss att dessa metoder kommer att tillämpas för analys av spermatocyter i andra teleostarter med justering till testisens storlek.
Medan endast ett fåtal antikroppar har höjts till zebrafisk meiotiska proteiner, har vi haft framgång med hjälp av följande antikroppar upp till mänskliga (h) eller mus (m) proteiner. Vårt labb har höjt antikroppar mot zebrafiskar Sycp1 protein (zfSycp1) i kyckling som har fungerat som en pålitlig markör för synaptonemal komplexa (SC), men detta protein är närvarande endast från tidig zygoten till sent pachytene, när kromosomer är helt synkroniserade. Kaninen anti-hSYCP3 antikroppar har varit mycket tillförlitliga för att upptäcka meiotiska kromosom yxor från leptoten tills upplösningen av SC i slutet pachytene(figur 1B,C). Noterbart är att vi inte har observerat en klassisk diplotene skede med fullängds axlar definieras av Sycp3 och frånvaron av Sycp1, vilket tyder på att, till skillnad från i musen, axlarna kan försämras efter utgången från pachytene3. Andra kommersiellt tillgängliga antikroppar mot m, h eller zf meiotic proteiner som har gett positiva resultat inkluderar också DNA rekombination / replikering kanin anti-hRAD51 och kanin anti-hRPA. Källan till varje antikropp och den utspädning som används anges i materialförteckningen. De vi har försökt utan framgång med minst tre olika utspädningar inkluderar get anti-hDMC1, mus anti-hMlh1, mus anti-hamster Sycp3, mus anti-hRPA.
Det finns tre kritiska stadier av kromosomspridningsförfarandet. Den första är att samla in rätt mängd material. Femton intakta testiklar bör vara tillräckliga för spridningsprotokollet för ~6 mpf hanar, och detta antal kan justeras upp eller ner beroende på djurens storlek. Tänk på att vissa meiotiska mutanter kommer att ha mindre testiklar, så 2 ytterligare djur bör användas. Det andra viktiga steget är dissociation av celler. Under trypsin matsmältningen, om testiklarna inte separera i små klumpar, är det troligt att för få celler kommer att återvinnas från spridningsförfarandet. Ett tredje viktigt steg är närvaron av en synlig pellet efter DNase I behandlingar. Om en pellet inte syns är det troligt att spridningsförfarandet ger lite eller ingen kärnor. Förlust av en pellet kan uppstå om för få djur används eller om alltför många DNase jag tvättar utförs. Å andra sidan kan för få DNase I-behandlingar resultera i en viscid sackaroscellsuspension, vilket förhindrar att cellerna sprids på bilden(figur 4). Det är viktigt att fortsätta utföra DNase I behandlingar (för högst 4 behandlingar) tills klumpar inte längre finns vid tillägg av DMEM.
Den presenterade kromosomspridningstekniken ger hundratals välspridda kärnor per bild. Med hjälp av detta förfarande har vi kunnat ge en detaljerad analys av viktiga händelser under zebrafisk spermatogenes med super-upplösning mikroskopi3. I våra händer har detta protokoll genererat bättre spridning kromosomer, med mindre skräp på bilden, och mindre bakgrundsfärgning jämfört med snabbare metoder med hjälp av enstaka djur som beskrivs av Moens14 och Sansam och Pezza11 (figur 5). Dessa skillnader beror sannolikt på användningen av kollagen, trypsin och DNase behandlingar i vårt protokoll. Två begränsningar i vår teknik är kravet på att använda 10-20 vuxna zebrafiskar män och mer mödosamma enzymbehandlingar och tvättsteg. Om detektion av superupplösning inte är nödvändigt, om zebrafiskmaterialet är begränsat, eller mer än två förhållanden testas parallellt, kan de snabbare metoderna vara mer lämpliga alternativ14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Trent Newman och Masuda Sharifi för kommentarer om manuskriptet och An Nguyen för att hjälpa till att optimera metoder för spridning och färgning kromosomer från zebrafisk meiocyter. Detta arbete stöddes av NIH R01 GM079115 som tilldelats S.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
