Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifisere den cytotoksisitet av staphyloccus aureus mot Human polymorfonukleære leukocytter

Published: January 3, 2020 doi: 10.3791/60681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Montana State University, 2University Communications, Montana State University

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for rensing av polymorfonukleære leukocytter fra hele menneskeblod og to distinkte analyser som kvantifisere cytotoksisitet av Staphylococcus aureus mot disse viktige medfødte immunceller.

Abstract

Staphylococcus aureus er i stand til å sekresjon et bredt spekter av leukocidins som mål og forstyrrer membranen integriteten til polymorfonukleære leukocytter (PMN eller nøytrofile). Denne protokollen beskriver både rensing av menneskelig PMN og kvantifisering av S. aureus cytotoksisitet mot PMN i tre forskjellige seksjoner. § 1 detaljer isolering av PMN og serum fra humant blod ved hjelp av tetthet sentrifugering. § 2 tester cytotoksisitet av ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mot disse renset menneskelige PMN. § 3 måler cytotoksisitet mot menneskelige PMN etter fagocytose av Live S. aureus. Disse prosedyrene måle forstyrrelse av PMN plasma membran integritet av S. aureus leukocidins bruke Flow flowcytometri analyse av PMN behandlet med propidium iodide, en DNA bindende fluoroforen som er celle membran ugjennomtrengelig. Kollektivt, disse metodene har fordelen av hurtigtesting S. aureus cytotoksisitet mot primære menneskelige PMN og kan lett tilpasses til å studere andre aspekter av Host-patogen interaksjoner.

Introduction

Staphylococcus aureus er en gram-positiv bakterie som forårsaker et bredt spekter av sykdommer hos mennesker. Denne fremtredende patogen produserer mange virulens faktorer som bidrar til ulike aspekter av infeksjonen. Disse inkluderer overflate molekyler som tillater S. aureus å følge ulike typer verts vev1, ekstracellulære proteiner som forstyrrer verten immunrespons2, og en rekke utskilles giftstoffer som er rettet mot ulike typer vert celler3. I denne rapporten beskriver vi en metode som kvantifiserer cytotoksisitet av ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mot menneskelige polymorfonukleære leukocytter (PMN eller nøytrofile), primære Effektor celler av verten medfødt immunrespons.

PMN er de mest tallrike leukocytter i pattedyr. Disse sirkulerende immunceller er raskt rekruttert til området av verten vev fornærmelse som svar på faresignaler produsert av fastboende celler eller av forbindelser som er unike for invaderende mikrober. Den ekstracellulære innspill fra disse molekylene og fra direkte kontakter med aktiverte bosatt vert celler under Ekstravasasjon øke aktiverings tilstanden av PMN i en prosess som kalles priming4,5. Primet PMN som har nådd distressed vev deretter utføre viktige medfødte immunresponser utformet for å hindre etablering av smitte. Disse inkluderer bindende og internalisering, eller fagocytose, av invaderende mikroorganismer som utløser en kaskade av intracellulære hendelser cumulating i mikrobe ødeleggelse av et batteri av potente antimikrobielle forbindelser5.

PMN spiller en viktig rolle som beskytter mennesker fra invaderende patogener og er spesielt viktig for å forebygge S. aureus infeksjon4. Denne bakterien produserer imidlertid et bredt spekter av virulens gener som hindrer ulike PMN-funksjoner. Disse inkluderer ekstracellulære proteiner som blokkerer anerkjennelse av signalering molekyler, hindre vedheft til å være vert vev, hemme produksjon av antimikrobielle forbindelser, og kompromiss plasma membran integritet4. S. aureus appartefakter den timelige uttrykk for disse virulens gener gjennom den kollektive innspill fra flere to-komponent sensoriske systemer som gjenkjenner spesifikke miljømessige signaler. Den SaeR/S to-komponent system er en stor opp-regulator av S. aureus virulens gen transkripsjon under smitte6,7,8,9,10,11. Spesielt er dette to-komponent-systemet vist å være avgjørende for produksjon av bi-komponent leukocidins som spesifikt mål menneskelige PMN12.

Denne protokollen er delt inn i tre forskjellige seksjoner. Den første delen beskriver rensing av PMN fra humant blod ved hjelp av tetthet gradient sentrifugering ved hjelp av en protokoll som er tilpasset fra metoder etablert av Bøyum13 og Nauseef14. Den andre og tredje delen detalj to forskjellige teknikker for å undersøke S. aureus cytotoksisitet; en forgifter sjelen PMN med ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mens den andre undersøker evnen til levende bakterier for å skade PMN følgende fagocytose. Disse prosedyrene bruker propidium iodide for å måle tapet av PMN plasma membran integritet forårsaket av S. aureus pore-forming giftstoffer. Propidium iodide er en DNA-bindende fluoroforen som normalt er celle membran ugjennomtrengelig men kan krysse plasma membraner som har blitt forstyrret av S. aureus giftstoffer. Flow flowcytometri analyse tillater rask kvantifisering av propidium iodide-positive PMN å måle den relative cytotoksisitet av S. aureus stammer. Meticillinresistente S. aureus (MRSA) identifisert som pulserende-feltet gel ELEKTROFORESE type USA300 og en isogenic sletting mutant av saeR/S i denne belastningen (USA300ΔsaeR/s) har blitt brukt som modeller for å demonstrere hvordan disse prosedyrene kan kvantifisere cytotoksisitet av S. aureus mot menneskelig PMN.

Protocol

Heparinisert venøs blod fra friske donorer ble samlet i samsvar med protokollen godkjent av institusjonelle Review Board for Human ved Montana State University. Alle givere gitt skriftlig samtykke til å delta i denne studien.

1. rensing av humant polymorfonukleære leukocytter og isolering av humant serum

Merk: alle reagenser bør rutinemessig sjekkes for tilstedeværelsen av endotoksin ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig endotoksin gjenkjennings sett og bør inneholde < 25.0 PG/mL endotoksin for å hindre uønsket priming av PMN.

  1. Bring 50 mL på 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 mL 0,9% NaCl (w/v), 20 mL 1,8% NaCl (w/v), 12 mL 1,077 g/mL tetthet gradient løsning, og 20 mL injeksjon-eller vanning-grade vann til romtemperatur.
  2. For å isolere humant serum, ruge 4 mL ferskt trukket humant blod uten anti-koagulere ved 37 ° c i et 15 mL glass rør i 30 min. Etter inkubasjons, sentrifuge prøve ved 2000 – 3000 × g i 10 min ved romtemperatur. Overfør det øvre serum laget inn i et friskt 15 mL konisk sentrifugerør og plasser på is.
  3. Kombiner 25 mL ferskt trukket heparinisert (1000 enheter/mL) hele menneskeblod med 25 mL romtemperatur 3% dextran-0,9% NaCl (1:1 ratio) i to replikere 50 mL koniske sentrifugerør (50 mL totalt volum per rør). Bland ved å forsiktig rocking hver 50 mL konisk rør og la stå ved romtemperatur i 30 min.
  4. Etter inkubasjons ved romtemperatur, vil to separate lag vises. Overfør det øverste laget av hver dextran-blandingen til nye 50 mL koniske rør og sentrifuger ved 450 x g i 10 min ved romtemperatur med lav eller ingen bremser.
  5. Nøye aspirer både supernatanter og forkaste uten å forstyrre celle pellets. Resuspend forsiktig hver celle pellet i 2 mL romtemperatur 0,9% NaCl, kombinere resuspendert pellets i en enkelt 50 mL konisk rør, legg deretter til de resterende 0,9% NaCl (endelig volum på 35 mL).
  6. Forsiktig underlag 10 mL romtemperatur på 1,077 g/mL tetthet gradient løsning under celle suspensjonen ved hjelp av en hånd pipette. Spin på 450 x g i 30 min ved romtemperatur med lav eller ingen bremser. Aspirer forsiktig supernatanten uten å forstyrre celle pellet. Supernatanten vil inneholde perifere blod mononukleære celler som kan samles som tidligere beskrevet14.
  7. Lyse opp de røde blodcellene ved å blanding celle pellet i 20 mL romtemperatur vann. Bland forsiktig ved å gynge røret for 30 s. Den lyse av røde blodlegemer vil bli ledsaget av en tydelig nedgang i turbiditet.
  8. Tilsett umiddelbart 20 mL 1,8% NaCl (ved romtemperatur [RT]) og sentrifuger prøve ved 450 × g i 10 min ved romtemperatur.
    Merk: det er viktig å minimere tiden at PMN er igjen i vann alene etter røde blodlegemer lyse for å maksimere PMN yield og forhindre PMN lyse og/eller aktivering.
  9. Forsiktig aspirer supernatanten uten å forstyrre celle pellet. Resuspend forsiktig celle pellet i 2 mL RT RPMI 1640 medium og plasser på isen.
  10. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Resuspend renset PMN ved en konsentrasjon på 1 x 107 celler/ml med iskald RPMI og holde på isen.
  11. Kombiner 100 μL av renset PMN (1 x 106 celler) med 300 μL av iskald Dulbecco saltvann (DPBS) inneholdende 1 μL propidium iodide beis i to replikere flowcytometri rør. For en positiv kontroll for skade på plasma membran, tilsett 40 μL av 0,5% Triton X-100 løsning i en av flyten flowcytometri rør og bland godt.
  12. Bruk strømnings flowcytometri til å måle frem spredningen, side spredningen og propidium iodide farging (eksitasjon/emisjon Maxima ved 535/617 NM) av renset celler (figur 1).
    Merk: Forward og side scatter analyse vil identifisere uønskede populasjoner av lymfocytter og monocytter. Propidium iodide vil bare beis celler med en kompromittert plasma membran og renset PMN som har uttalt bestander av Propidium iodide positive celler bør ikke brukes. For disse studiene ble renset PMN bare brukt hvis de omfattet > 98% av renset celler og < 5% farget positiv for propidium iodide.
  13. Forbered en 96 brønn plate for PMN cytotoksisitet analyser ved å dekke individuelle brønner som skal brukes i denne analysen med 100 μL 20% isolert humant serum som er fortynnet med DPBS.
    Merk: plating PMN direkte på plast eller glass vil føre til aktivering av cellene. Sørg for å inkludere minst én negativ kontroll godt som bare vil motta Media og minst én positiv kontroll godt som vil motta 0,05% Triton X-100.
  14. Ruge platen ved 37 ° c i 30 min. Etter inkubasjons, vask de belagte brønnene to ganger med iskald DPBS for å fjerne overflødig serum. Trykk forsiktig på platen opp ned for å fjerne eventuelle gjenværende DPBS og plasser på isen.
  15. Tilsett forsiktig 100 μL av renset humant PMN ved 1 x 107 celler/ml til hver belagt brønn (1 x 106 PMN/brønn). Tillat PMN å bosette seg i brønner ved incubating platen på isen i minst 5 min. Hold platen nivå for å tillate jevn fordeling av celler i hver brønn og la på isen for å unngå uønsket aktivering av PMN.

2. cytotoksisitet analysen av S. aureus ekstracellulære proteiner mot humant polymorfonukleære leukocytter

  1. Kultur S. aureus overnight i tryptic soya BULJONG (TSB) ved hjelp av en risting inkubator satt ved 37 ° c. For disse studiene ble 20 mL av TSB i separate 150 mL Erlenmeyer flasker inokulert med frosne kulturer av S. aureus stammer USA300 eller USA300ΔsaeR/S og vokst for ca 14 timer med risting ved 250 RPM.
  2. Under kultur S. aureus ved å utføre en 1:100 fortynning av overnight bakteriell kultur med ferske medier. Ruge ved 37 ° c med risting til bakteriene nå tidlig stasjonær vekstfase.
    Merk: for disse eksperimentene, 20 mL tryptic soya buljong i 150 mL Erlenmeyer flasker ble inokulert med 200 μL av overnight kultivert USA300 eller USA300ΔsaeR/S og inkubert ved 37 ° c med risting ved 250 RPM for 5 t.
  3. Når bakteriene har nådd tidlig stasjonær vekstfase, overføring 1 mL subcultured S. aureus i en 1,5 ml mikrosentrifugen rør og sentrifuger ved 5 000 × g i 5 min ved romtemperatur.
  4. Etter sentrifugering, Overfør supernatanten til en 3 mL sprøyte. Pass supernatanter gjennom et 0,22 μm filter og inn i et nytt 1,5 mL mikrosentrifugen rør på isen.
  5. Utfør seriell fortynninger av supernatanter med iskald Media brukes til kultur S. aureus.
    Merk: for eksperimentene som vises, supernatanter fra USA300 og USA300ΔsaeR/S gjennomgikk fire påfølgende 1/2 Logg fortynninger med iskald tsb.
  6. Forsiktig legge supernatanten prøver eller Media alene (for negative og positive kontroller) til individuelle brønner på 96-brønn plate som inneholder PMN på isen fra trinn 1,15. For disse eksperimentene ble 10 μL av USA300 eller USA300ΔsaeR/S supernatanten prøver lagt til hver brønn. Forsiktig rock plate for å fordele supernatanter i brønner og ruge ved 37 ° c.
  7. Til ønsket tid, fjerne platen fra inkubator og plass på isen. Legg 40 μL av 0,5% Triton X-100 til positiv kontroll godt.
  8. Pipette prøvene forsiktig opp og ned i hver brønn for å helt trekke av alle PMN levd opp til plate, og deretter overføre prøvene å flyte flowcytometri rør på is som inneholder 300 μL av iskald DPBS med 1 μL av propidium iodide.
  9. Mål andelen propidium iodide-positive PMN ved hjelp av strømnings flowcytometri (figur 2A). Når bundet til DNA, propidium iodide har eksitasjon/utslipp ved 535/617 NM.

3. S. aureus cytotoksisitet analysen mot menneskelige polymorfonukleære leukocytter etter fagocytose

Merk: vekst kurver definert av den optiske tettheten ved 600 NM (OD600) og konsentrasjonen av bakterier må fastsettes empirisk for S. aureus stammer som skal testes før du starter denne analysen. Suksessen til disse eksperimentene krever konsekvent høsting av like konsentrasjoner av hver S. aureus- stamme testet i midten av eksponentiell vekstfase ved hjelp av OD600 av sub-kultivert bakterier.

  1. Start over natten kulturer av S. aureus stammer og under kultur bakterier som beskrevet i trinn 2.1.1 og 2.1.2.
  2. Harvest subcultured S. aureus når den har nådd middels eksponentiell vekst ved å overføre 1 ml kultivert bakterier til en 1,5 ml mikrosentrifugen rør og sentrifugering ved 5 000 × g i 5 min ved romtemperatur.
    Merk: under våre vekstforhold, USA300 og USA300ΔsaeR/S nådde midt-eksponentiell vekstfase etter ca 135 min av inkubasjons6.
  3. Vask S. aureus etter sentrifugering ved aspirating supernatanten, blanding pelleted bakterier i 1 ml DPBS, virvlingen prøven for 30 S, og sentrifugering ved 5 000 × g i 5 min ved romtemperatur.
  4. Opsonize S. aureus ved blanding av bakterie pellet i 1 ml 20% humant serum FORTYNNET med DPBS og incubating ved 37 ° c med omrøring i 15 min.
  5. Sentrifuger opsoniserte bakterier ved 5 000 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Vask S. aureus etter sentrifugering ved aspirating supernatanten, blanding de pelleted bakteriene i 1 ml DPBS, deretter Vortex prøven til bakteriell pellet er helt ødelagt fra hverandre pluss ytterligere 30 sekunder. Sentrifuger bakterier ved 5 000 × g i 5 min ved romtemperatur.
  6. Resuspend opsoniserte S. aureus stammer i 1 ml RPMI, Vortex prøven til bakteriell pellet er helt ødelagt fra hverandre, og deretter for ytterligere 30 S. Legg bakterier på isen.
  7. Fortynne opsoniserte S. aureus stammer til ønsket konsentrasjon med iskald RPMI. Vortex for 30 s og plass på isen.
  8. Bekreft konsentrasjonen av opsoniserte S. aureus av plating 1:10 seriell fortynninger av bakterier på tryptic soya agar.
    Merk: fordi forskjeller i konsentrasjonen av bakterier som brukes i denne analysen kan ha en stor innvirkning på påfølgende PMN plasma membran permeabilitet (Figur 3a), er det svært viktig at konsentrasjonen av hver belastning testet er bestemt for hvert eksperiment og er ekvivalent mellom stammer.
  9. Forsiktig legge 100 μL/brønn av hver S. aureus STAMME eller RPMI (for positive og negative kontroller) til pmn i 96-brønn plate på is fra trinn 1,14. Forsiktig rock plate for å fordele S. aureus i brønner.
  10. Synkroniser fagocytose ved å sentrifugering platen ved 500 × g i 8 min ved 4 ° c15. Ruge plate ved 37 ° c umiddelbart etter sentrifugering (T = 0).
  11. Til ønsket tid, fjerne plate fra inkubator og plass på isen. Legg 40 μL av 0,5% Triton X-100 til positiv kontroll godt.
  12. Pipette prøvene forsiktig opp og ned i hver brønn for å helt trekke av alle PMN levd opp til plate, og deretter overføre prøvene å flyte flowcytometri rør på isen som inneholder 200 μL av iskald DPBS med 1 μL av propidium iodide.
  13. Analyser prøver for propidium iodide farging ved hjelp av strømnings flowcytometri som beskrevet i trinn 2,9.

Representative Results

Vi har demonstrert hvordan prosedyrene beskrevet ovenfor kan brukes til å relativt kvantifisere cytotoksisitet av S. aureus mot menneskelige PMN bruker MRSA PFGE-type USA300 og en isogenic sletting mutant av saeR/S i denne belastningen (USA300ΔsaeR/s) generert i tidligere studier6. PMN isolert ved hjelp av prosedyrene beskrevet i del 1 av denne protokollen ble farget med propidium iodide og undersøkt ved hjelp av flyt flowcytometri. Forward og side scatter tomter ble brukt for å illustrere forurensning av renset PMN av monocytter eller lymfocytter (figur 1A, B) og PMN integritet ble bestemt ved hjelp Propidium iodide farging (figur 1C). Den beskrevne metoden for menneskelig PMN rensing kan konsekvent gi 0,5 x 107 til 1 x 108 PMN som er > 98% Pure og er > 95% propidium iodide negative.

Cytotoksisitet av ekstracellulære proteiner produsert av USA300 og USA300ΔsaeR/S ble testet mot renset PMN (figur 2) etter prosedyrene beskrevet i punkt 2 i denne protokollen. Disse eksperimentene viser en konsentrasjon avhengig økning i propidium iodide farging av renset PMN følgende 30 min av forgiftning med ekstracellulære proteiner produsert av USA300 (figur 2B). Tidligere studier har vist at SaeR/S to-komponent-systemet er viktig for uttrykk for mange bi-komponent leukocidins som mål Human PMN6,10,11,16. Sammenfallende med disse tidligere funn, svært få propidium iodide-positive PMN ble oppdaget følgende eksponering for ekstracellulære proteiner produsert av USA300ΔsaeR/S (figur 2B). Ytterligere eksperimenter viste en jevn økning i andelen lysert PMN etter forgiftning av USA300 ekstracellulære proteiner som plateaued etter ca 30 min (figur 2C). Minimal lyse av menneskelig PMN ble notert på alle tidspunkter etter eksponering for ekstracellulære proteiner produsert av USA300ΔsaeR/S. Disse resultatene illustrerer nytten av denne analysen for den relative kvantifisering av cytotoksisitet av ekstracellulære S. aureus proteiner mot menneskelig PMN.

Vi testet USA300 og USA300ΔsaeR/S ved hjelp av s. aureus cytotoksisitet analysen mot Human PMN følgende fagocytose som er beskrevet i punkt 3 i denne protokollen (Figur 3). En konsentrasjon avhengig økning i andelen av propidium iodide positive PMN ble observert 90 min etter fagocytose av USA300 (Figur 3A). En signifikant nedgang ble observert i andelen av PMN som var propidium iodide positive etter fagocytose av USA300ΔsaeR/s (Figur 3A), som støtter andre resultater som indikerer saeR/s to-komponent system er viktig for cytotoksisitet av S. aureus mot Human PMN (figur 2)7,11. Som tidligere nevnt og demonstrert i Figur 3A, forskjeller i S. aureus konsentrasjon har en uttalt effekt på PMN lyse Rings fagocytose. Opplisting av USA300 og USA300ΔsaeR/S inokulum brukes i hvert av disse eksperimentene viste at kontrasten i cytotoksisitet mellom disse stammene var ikke på grunn av forskjeller i konsentrasjonen av bakterier som brukes (Figur 3B). Disse funnene viser hvordan S. aureus cytotoksisitet analysen mot menneskelige PMN følgende fagocytose kan brukes til å vurdere evnen til ulike S. aureus stammer til kompromiss menneskelig PMN plasma membran integritet.

Figure 1
Figur 1: Flow flowcytometri analyse av renset PMN. Representative flyt flowcytometri prikk plott av (A) renset menneskelige PMN og (B) PMN som er med hensikt forurenset med perifert blod mononukleære celler. (C) representative flyt flowcytometri histogram som demonstrerer minimale propidium iodide farging (< 1%) av renset PMN (fargede grå) i forhold til PMN behandlet med 0,05% Triton X-100 (skyggelagt rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Flow flowcytometri analyse av PMN beruset med ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus. (A) representant flyt flowcytometri histogram av PMN beiset med propidium iodide etter 30 min av inkubasjons med Media kontroll (skyggelagt blå), filtrert USA300 supernatanten ved en endelig konsentrasjon av 1:110 (grå skygge), eller 0,05% Triton X-100 (skyggelagt rød). (B) andelen propidium iodide positive PMN etter 30 min av inkubasjons med ulike KONSENTRASJONER av USA300 eller USA300 ∆saeR/S supernatanter. (C) andelen propidium iodide positive PMN over tid etter INKUBASJONS med USA300 eller USA300 ∆saeR/S supernatanten ved en endelig konsentrasjon på 1:110. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM av minst 3 separate eksperimenter med * p ≤ 0,05 og * * p ≤ 0,005, som bestemt av den tosidige t-testen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Flow flowcytometri analyse av PMN etter fagocytose av S. aureus. (A) andelen propidium iodide positive PMN 90 min etter fagocytose av ulike KONSENTRASJONER av USA300 eller USA300 ∆saeR/S. (B) konsentrasjon av opsoniserte S. aureus -belastninger som brukes for eksperimentene som vises i panel A. data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM av 4 separate eksperimenter med * p ≤ 0,01 som bestemt av tosidig t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver rensing av PMN fra humant blod og to distinkte analyser som bruker propidium iodide for kvantifisere den cytotoksisitet av S. aureus mot disse viktige medfødte immunceller. Suksessen til disse prosedyrene vil avhenge av kvaliteten på renset PMN og riktig utarbeidelse av S. aureus og ekstracellulære proteiner produsert av denne patogen. For isolering av PMN, er det viktig å minimere PMN aktivering under og etter rensing ved hjelp av reagenser fri for endotoksin forurensning, behandling av celle preparater forsiktig, og holde cellene i riktig temperatur. Tegn som indikerer aktivering av PMN inkluderer klumper av celler under rensing og når mer enn 5% av isolerte celler flekken positiv for propidium iodide. På grunn av den relativt korte levetiden til PMN, må disse cellene isoleres fra humant blod og testes på samme dag. PMN vil begynne å vise tegn på spontan apoptose hvis igjen på isen for mer enn 3 h etter rensing. Som nevnt tidligere, er det svært viktig at hver PMN forberedelse er nøye vurdert ved hjelp av Flow flowcytometri analyse av fremover og side scatter samt propidium iodide flekker for å sikre renhet og integritet av isolerte celler.

Uttrykket av bi-komponent leukocidins av S. aureus er ansvarlig for flertallet av kompromittert PMN plasma membran integritet som er observert ved hjelp av analysene som er beskrevet i denne protokollen. Variasjon i uttrykk for disse giftstoffene og andre pore-forming peptider, slik som fenol-løselig modulins, mellom stammer av S. aureus vil produsere forskjeller i cytotoksisitet mot menneskelig PMN. betydelige avvik under in vitro-veksten mellom S. aureus -stammer vil også påvirke uttrykk for giftstoffer som dannes pore og påfølgende cytotoksisitet. I tillegg er forholdet mellom s. aureus til PMN i fagocytose analysene har en stor innvirkning på påfølgende PMN plasma membran permeabilitet (Figur 3a) og disse eksperimentene krever konsekvent innhøsting av like konsentrasjoner av hver S. aureus- stamme testet i MIDTEN av eksponentiell vekstfase ved hjelp av OD600 av subcultured bakterier. Gitt disse hensyn, er det svært viktig å definere vekst kurver for alle stammer som vil bli undersøkt før du begynner cytotoksisitet analyser. Vi anbefaler ikke disse metodene for å analysere S. aureus cytotoksisitet med stammer som viser betydelige vekst forskjeller in vitro.

USA300 er en ondartet MRSA isolat som er kjent for å være svært cytotoksisk mot menneskelige PMN15 og tap av SaeR/S i denne belastningen dramatisk reduserer transkripsjon av mange bi-komponent leukocidins som mål menneskelige PMN6,12, noe som gjør disse belastninger ideelle modeller for å sammenligne cytotoksisitet bruker analysene beskrevet. Det er imidlertid omfattende genetisk variasjon mellom ulike s. aureus isolerer og parametrene beskrevet i disse protokollene kan ikke føre til vesentlige endringer i cytotoksisitet mot menneskelige PMN når testing andre S. aureus stammer. Skreddersy vekstforhold, volumer av supernatanter lagt til, eller forholdet mellom bakterier til PMN kan være nødvendig for å lykkes med disse metodene ved hjelp av andre stammer av S. aureus.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health Grants NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 samt midler fra Montana State University landbruk Experiment Station, og et utstyr stipend fra Murdock veldedige Trust .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container Baxter 2B1323Q PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps VWR 89000-044 Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution Sigma-Aldrich S5150 PMN purification
12x75mm Culture tubes VWR 60818-430 Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran Sigma-Aldrich D8802 PMN purification
3125 Hand Tally Counter Traceable Products 3125CC For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes VWR 89039-656 For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium FischerScientific 211823 For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL FischerScientific BD 309657 For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629 Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium Corning 21-030-CV Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02 PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets FischerScientific 13-678-11E For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates Millipore Sigma M0687 Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters Omicron Scientific SFPV13R For filtering supernatants
Propidium iodide ThermoFisher Scientific P3566 Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks Cole-Parmer EW-34503-24 For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red Corning 17-105-CV Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP Baxter 2F7113 PMN purification
The Pipette Pump Bel-Art Products F37898 For aspirating liquid
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Membrane integrity positive control

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., Höök, M. Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nature Reviews Microbiology. , (2014).
  2. Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcal manipulation of host immune responses. Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).
  3. Otto, M. Staphylococcus aureus toxins. Current Opinion in Microbiology. , (2014).
  4. Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).
  5. Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. Phagocytes. Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).
  6. Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).
  7. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  9. Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).
  10. Zurek, O. W., et al. The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus. J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).
  11. Nygaard, T. K., et al. Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence. Frontiers in Microbiology. 9, at https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2018.03085 3085 (2018).
  12. Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors. Nature Reviews Microbiology. , (2017).
  13. Bøyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).
  14. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  15. Voyich, J. M., et al. Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).
  16. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).

Tags

Immunologi og infeksjon Staphylococcus aureus MRSA polymorfonukleære leukocytter nøytrofile giftstoffer cytotoksisitet virulens

Erratum

Formal Correction: Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
Posted by JoVE Editors on 06/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. The title was updated.

The title was updated from:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

to:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Kvantifisere den cytotoksisitet av <em>staphyloccus aureus</em> mot Human polymorfonukleære leukocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dankoff, J. G., Pallister, K. B.,… More

Dankoff, J. G., Pallister, K. B., Guerra, F. E., Parks, A. J., Gorham, K., Mastandrea, S., Voyich, J. M., Nygaard, T. K. Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. J. Vis. Exp. (155), e60681, doi:10.3791/60681 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter