Summary
يصف هذا البروتوكول تقنيه لتصور السلوك الضام والموت في الاجنه الجنينية اثناء العدوى المتفطره المردية . يتم تضمين خطوات لاعداد البكتيريا ، والعدوى من الاجنه ، والمجهر الانترافيتال. ويمكن تطبيق هذه التقنية علي مراقبه السلوك الخلوي والموت في سيناريوهات مماثله تنطوي علي عدوي أو التهاب معقم.
Abstract
Zebrafish هو كائن نموذجي ممتاز لدراسة سلوك الخلايا المناعية الفطرية نظرا لطبيعته الشفافة والاعتماد فقط علي نظامه المناعي الفطري اثناء التطور المبكر. وقد تم إنشاء نموذج العدوى المتفطره الفطرية من زبراافيش (m. مارنوم) في دراسة الاستجابة المناعية المضيفة ضد العدوى المتفطرات. وقد اقترح ان مختلف أنواع الموت خليه الضامة سوف يؤدي إلى النتائج المتنوعة للعدوى المتفطرات. هنا نحن وصف بروتوكول باستخدام المجهر انترافيتال لمراقبه وفاه الخلية الضامة في الاجنه الزرد بعد العدوى m. مارنوم . الخطوط المحورة وراثيا zebrafish التي تسمي علي وجه التحديد الضامة والعدلات هي المصابة عن طريق الحقن المجهري العضلي من فلوريسسينتلي المسمي m. مارنوم في اما الدماغ الأوسط أو الجذع. وفي وقت لاحق ، يتم تركيب الاجنه المصابة بالزبرد علي ذوبان منخفض ويلاحظها المجهر البؤري في ابعاد X-Y-Z-T. لان التصوير الحي علي المدى الطويل يتطلب استخدام طاقة الليزر المنخفضة لتجنب الرشح الضوئي والسمية الضوئية ، ينصح بشده بالتعبير المعدل وراثيا. يسهل هذا البروتوكول تصور العمليات الديناميكية في الجسم الحي ، بما في ذلك هجره الخلايا المناعية ، وتفاعل الممرض المضيف ، وموت الخلايا.
Introduction
وقد ثبت ان العدوى المتفطرات تسبب وفاه الخلية المناعية المضيف1. علي سبيل المثال ، فان سلاله موهنه تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج في الضامة وتحتوي علي العدوى. ومع ذلك ، فان سلاله خبيثه تؤدي إلى موت الخلايا الليتيك ، مما تسبب في نشر البكتيريا1،2. النظر إلى تاثير هذه الأنواع المختلفة من موت الخلايا لديها علي المضيف المضادة للمتفطرات الاستجابة ، وهناك حاجه إلى ملاحظه مفصله من وفاه الخلايا الضامة اثناء العدوى المتفطرات في الجسم المجري.
الطرق التقليدية لقياس موت الخلايا هي لاستخدام البقع الخلية الميتة ، مثل الخامس annnexin ، tunel ، أو اكريدين اورانج/بروبيديوم يوديد تلطيخ3،4،5. ومع ذلك ، هذه الطرق غير قادره علي تسليط الضوء علي عمليه ديناميكية من موت الخلايا في الجسم الحي. وقد تيسرت بالفعل مراقبه موت الخلايا في المختبر عن طريق التصوير الحي6. ومع ذلك ، ما إذا كانت النتائج تحاكي بدقه الظروف الفسيولوجية لا يزال غير واضح.
وكانت zebrafish نموذجا ممتازا لدراسة المضيفين مكافحه المتفطره الاستجابات. لديها جهاز المناعة المحمية للغاية مماثله لتلك التي من البشر ، والجينوم التلاعب بها بسهوله ، والاجنه في وقت مبكر شفافة ، والذي يسمح للتصوير الحي7،8،9. بعد العدوى مع m. مارنوم ، الكبار الزرد شكل نموذجي البنيات الحبيبية ناضجه ، وشكل الزرد الجنينية الحبيبية في وقت مبكر مثلالهياكل 9 ،10. وقد تم استكشاف العملية الديناميكية للخلايا المناعية الفطرية التفاعل البكتيريا في السابق في النموذج العدوى م. مارنوم 11,12. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع متطلبات الدقة المكانية والزمانيه ، تظل التفاصيل المحيطة بوفاة الخلايا المناعية الفطرية غير معرفه إلى حد كبير.
هنا نحن وصف كيفيه تصور عمليه الموت الخلية الضامة التي تسببها العدوى المتفطرات في الجسم الميت. ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول لتصور السلوك الخلوي في الجسم المجري اثناء التطور والتهاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أثيرت في اطار الشروط القياسية zebrafish وفقا للمبادئ التوجيهية الحيوانية مختبر للمراجعة الاخلاقيه لرعاية الماشية (GB/T 35823-2018). تمت الموافقة علي جميع التجارب الزرد في هذه الدراسة (2019-A016) وأجريت في مركز شانغهاي الصحة العامة السريرية ، جامعه fudan.
1. م. مرنوم خليه واحده اعداد الخلايا القطنية (الشكل 1)
- ذوبان Cerulean-الفلورسنت m. مارنوم الجلسرين الأسهم من-80 درجه مئوية وتطعيم لوحه أجار 7h10 مع 10 ٪ (v/v) oadc ، 0.25 ٪ الجلسرين و 50 ميكروغرام/مل هيجرومايسين. احتضان لوحه في 32 درجه مئوية لحوالي 10 أيام.
- حدد مستعمره التعبير عن الفلورية الايجابيه وتطعيم 3 مل من المتوسط 7H9 مع 10 ٪ OADC ، 0.5 ٪ الجلسرين ، و 50 ميكروغرام/مل hygromycin.
- احتضان التلقيح في 32 درجه مئوية و 100 الثورات في الدقيقة الواحدة (rpm) لمده 4-6 أيام حتى تصل الثقافة إلى المرحلة اللوغاريتمية (OD600 = 0.6-1.0).
- الثقافة الفرعية (1:100) في 30 مل من المتوسطة 7H9 الطازجة مع 10 ٪ OADC ، 0.5 ٪ الجلسرين ، 0.05 ٪ توين-80 ، و 50 ميكروغرام/مليلتر حتى OD600 تصل إلى ~ 1.0.
ملاحظه: للحصول علي اعلي جوده الثقافة ، يوصي خطوه الثقافة الفرعية في هذه المرحلة. في تجربتنا ، وأضافه استنساخ مباشره إلى حجم كبير من المتوسطة سوف يؤدي إلى تشكيل كتل بكتيرية.
- جمع الخلايا m. مارنوم كما هو موضح أدناه.
- جهاز الطرد المركزي في 3,000 x g ل 10 دقيقه لجمع m. مارنوم كبيليه. تجاهل جميع ولكن 300 μl من ماده طافي واستخدامه لأعاده تعليق بيليه.
- أضافه 3 مل من المتوسط 7H9 مع 10 ٪ الجلسرين لمزيد من أعاده تعليق بيليه ، ثم التعليق في حمام المياه في 100 W في 15 ق علي ، 15 ليالي OFF لمده إجماليه 2 دقيقه.
ملاحظه: الغرض من صوتنه هو تحقيق خليه واحده الخالطون للأعور ، والتي سوف تمنع انسداد ابره الحقن المجهري.
- نقل التعليق البكتيري إلى حقنه 10 مل ، ثم تمر من خلال فلتر 5 ميكرون لأزاله اي كتل بكتيرية.
- قياس الكثافة البصرية (OD) للتعليق باستخدام مقياس طيفي وتمييع إلى OD600 = 1.0 مع 7H9 وسائل الاعلام التي تحتوي علي 10 ٪ الجلسرين. يقسم التعليق إلى 10 ميكرولتر ويخزن في-80 درجه مئوية الفريزر للاستخدام في المستقبل.
- تاكيد التركيز البكتيري للعين (كفو/mL) عن طريق التخفيف التسلسلي والطلاء من الأسهم البكتيرية علي لوحه أجار 7H10 تحتوي علي 10 ٪ (v/v) من OADC ، 0.5 ٪ من الجلسرين ، و 50 ميكروغرام/مل من hygromycin.
2. اعداد الاجنه الزبرافيش
- في أحد الأيام التي تسبق التفريخ ، قم باعداد أزواج التكاثر الزبرافوش في غرفه التكاثر.
ملاحظه: أضافه زوج واحد فقط إلى كل غرفه التكاثر. - جمع الاجنه في صباح اليوم التالي في غضون 1 ساعة بعد الإخصاب (hpf). اغسل الاجنه بعناية بالماء المقطر وانقل ما يصل إلى 100 من الاجنه إلى طبق بيتري 100 ملم يحتوي علي 30 مل من المتوسطة E3. احتضان في 28.5 درجه مئوية.
- بعد 12 ساعة ، راقب تحت المجهر وتخلص من البويضات غير المخصبة أو التالفة.
- في 24 hpf ، تغيير المتوسطة إلى الطازجة E3 المتوسطة مع N-فينيلثيوريا (PTU ، 0.2 nM التركيز النهائي) لمنع تطور الصباغ. احتضان الاجنه عند 28.5 درجه مئوية حتى تصبح الاجنه جاهزه للحقن المجهري.
3. العدوى عن طريق الحقن المجهري البكتيرية
- اعداد الابر حقن ميكروسيليكات الزجاجية المجهرية كما هو موضح سابقا في المرجع13.
- أجنه الزيبرافيش المتصاعدة للعدوى
- الميكروويف 100 مل من 1 ٪ (ث/ف) و 100 مل من 0.5 ٪ (ث/الخامس) ذوبان منخفضه نشات في المتوسطة E3 معقمه حتى يتم ذاب تماما الاغاروز. يقسم إلى 1 مل من أنابيب اليكووت ويخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
- قبل الاستخدام ، سخني الجهاز في كتله تسخين 95 درجه مئوية حتى يذوب تماما. الحفاظ علي الورم في شكل سائل عن طريق وضعه في كتله التدفئة 45 درجه مئوية (الشكل 2).
- تصاعد للعدوى العضلية في المنطقة الجذع
- إنشاء طبقه القاع السفلي بسكب 0.5 مل من 1 ٪ (ث/الخامس) اجنشا بالتساوي علي شريحة زجاجيه. وضع علي مربع الجليد أو سطح بارد لمده 3 دقائق ليصلب.
- تخدير الاجنه الزبرافيش (48 – 72 hpf) في ماء البيض مع tricaine (200 ميكروغرام/مل) و PTU لمده 5 دقائق قبل التركيب. وضع ما يصل إلى 60 الاجنه الزرد علي طبقه القاع ووضعها بعناية في صفين (الشكل 2ب).
- أزاله اي المياه المتبقية علي طبقه القاع السفلي مع المناديل الورقية قبل أضافه 0.3 mL من 0.5% (w/v) اجنشات لإنشاء الطبقة العليا. التاكد من ان الاجنه هي جزءا لا يتجزا تماما في اجنشا. أعاده الشريحة الزجاجية إلى مربع الجليد مره أخرى لترسيخ الاجثار ومنع الجفاف.
- الحفاظ علي الطبقة العليا من رطبه اجنشا من خلال تغطيه السطح مع الماء البيض E3 اضافيه.
- تصاعد للعدوى الدماغية الوسطي
- تغطيه الأخدود من الشريحة المجهرية الزجاجية تقعر واحد مع 1 ٪ (ث/ف) اجنشا ، ومن ثم نقل 4-6 الاجنه tricaine-تخدير في الاغثار.
- ضع راس كل جنين في الأعلى بعناية بابره 10 جرام (الشكل 2ج).
- وبمجرد ان يتم إصلاح مواقف جميع الاجنه ، قم بنقل الشريحة الزجاجية إلى صندوق جليدي أو سطح بارد للسماح للنشا.
ملاحظه: تجنب التخفيف من ذوبان منخفضه نشات عن طريق التقليل من حجم نقل المياه البيض مع الاجنه.
- اعداد البكتيريا للعدوى
- أضافه 1 μl من الفينول المعقم المصفاة الحمراء (10x) إلى 10 μl قسامه من المخزون البكتيرية (المحرز في الخطوة 1) ومزيج من قبل vortexing لفتره وجيزة.
ملاحظه: يمكن تعديل التركيز النهائي باستخدام العقيمة تلفزيوني. - سوكاتي اعداد باستخدام 100 W في 10 ق علي ، 10 ليالي OFF لمده 1 دقيقه لتفريق اي كتل التي قد تكون شكلت14.
- أضافه 1 μl من الفينول المعقم المصفاة الحمراء (10x) إلى 10 μl قسامه من المخزون البكتيرية (المحرز في الخطوة 1) ومزيج من قبل vortexing لفتره وجيزة.
- العدوى عن طريق الحقن المجهري
- ضبط الحاقن الدقيقة والجزئية إلى الوضع الصحيح والاعداد للحقن المجهري كما ذكر سابقا13.
- نقل 3 μL من اعداد البكتيريا باستخدام محمل الصغيرة في الابره المعدة (انظر الخطوة 3.1). ماصه ببطء وبعناية لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
- للعدوى المنطقة الجذع ، حقن 100 كفو في المنطقة الجذع (الشكل 3ا). تجنب حقن البكتيريا في notochord.
ملاحظه: يتم تقدير cfu للحقن بواسطة الصيغة cfu = تركيز المخزون البكتيري x عامل التخفيف x حجم الحقن الحبريه. يتم تاكيد cfu الفعلية عن طريق الطلاء قطره واحده من البكتيريا البكتيرية علي لوحه أجار 7H10 تحتوي علي 10 ٪ (v/v) من OADC ، 0.5 ٪ من الجلسرين ، و 50 ميكروغرام/مل من hygromycin. - للعدوى الدماغية الوسطي ، حقن حوالي 500 كفو في منطقه الدماغ الوسطي (الشكل 3ب).
- بعد الحقن المجهري ، امسح الاجنه الزكية بعناية إلى ماء البيض الطازج مع ماصه بلاستيكية.
ملاحظه: جبل الاجنه في طبق أسفل الزجاج في أقرب وقت ممكن لتغطيه الملاحظة من استجابه الخلايا المناعية الفطرية في وقت مبكر جدا.
4. التصوير الحي للعدوى
- تركيب الأسماك للتصوير الحي
- نقل ما يصل إلى 10 أجنه ثلاثية التخدير إلى وسط طبق من الزجاج السفلي 35 ملم. تجاهل المتوسطة الاضافيه E3.
- غطي الطبق بنقطه انصهار منخفضه بنسبه 1% وتوجهي الاجنه الزكية بعناية باستخدام ابره 10 غ. احتضان طبق الزجاج السفلي علي الجليد لمده 10 ليالي لترسيخ الاجثار.
ملاحظه: بالنسبة للحقن في منتصف الدماغ ، يجب تركيب الاجنه في الحقن مع توجيه الراس للأعلى (الشكل 4ا). بالنسبة للعدوى العضلية في منطقه الجذع ، ينبغي تركيب الاجنه أفقيا في المناطق التي نشات (الشكل 4ب). - بمجرد انه قد عزز تماما ، وتغطيه اجنشا مع طبقه من مياه البيض (بالاضافه إلى 1 × tricaine و PTU).
- ثلاثه ألوان عاليه الدقة الفاصل الزمني المجهر البؤري
ملاحظه: يتم تشغيل الخطوات التالية علي المجهر البؤري مجهزه 63.0 x 1.40 الاشعه فوق البنفسجية النفط عدسه الهدف.- تعيين درجه حرارة الغرفة البيئية إلى 28.5 درجه مئوية. وضع بعض المناديل المبللة داخل الغرفة لتوفير الرطوبة ومنع تبخر مياه البيض (الشكل التكميلي 1).
- ضع الطبق الزجاجي السفلي 35 مم مع الزيبرافيش في الغرفة البيئية.
- فتح البرنامج المنسق وتهيئه المرحلة. التبديل إلى 63.0 x 1.40 النفط الاشعه فوق البنفسجية الهدف ، وتحديد موقع الزرد باستخدام قناه حقل مشرق مع مرشح تباين التداخل (DIC).
- فتح الصمام الثنائي 405 ، الارجون (20 ٪ السلطة) ، و DPSS 561 nm الليزر. قم باعداد ضبط الطاقة والطيف بالليزر المناسب.
ملاحظه: فيما يلي إعدادات الطيف Cerulean (الاثاره = 405 نانومتر ؛ الانبعاثات = ~ 456-499 نانومتر) ، eGFP (الاثاره = 488 nm ؛ الانبعاثات = ~ 500-550 نانومتر) ، DsRed2 (الاثاره = 561 nm ؛ الانبعاثات = ~ 575-645 نانومتر) (الشكل التكميلي 2 ب). - اختر "XYZ" "المسح المتسلسل" وضع الاستحواذ وتعيين تنسيق الصور إلى "512 x 512 بكسل" (الشكل التكميلي 2a).
- التبديل إلى "وضع البيانات المباشرة". استهدفت الموقعة من [زيبرفيش] اولي وعلامة ال "يبدا" و "نهاية" [ز] موقعه. كرر هذه العملية لكل من الاجنه المتبقية. ويمكن أضافه "وقفه" في نهاية البرنامج (الشكل التكميلي 2c).
- تحديد حلقه ودوره البرنامج.
- احفظ الملف.
5. الاشعه فوق البنفسجية خليه واحده للحث علي الخلايا المبرمجة والتصوير الحي
- جبل الأسماك كما هو موضح في الخطوة 4.1.
- التصوير في منطقه الدماغ الوسطي من 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) الضامة محدده المحورة وراثيا Tg (mfap4) الجنين15
- حدد المنطقة التي تهم فلوريسسينتلي واحد المسمي الضامة والمسح الضوئي في سرعه 400 هرتز و 6% الاشعه فوق البنفسجية الطاقة الليزر ل 50 s.
ملاحظه: يجب تحسين سرعه المسح الضوئي والوقت استنادا إلى المجهر الفردية. يجب ان يكون الوقت المسح الأمثل لتسبب الضرر الحمض النووي واسعه النطاق التي سوف تسبب لاحقا الخلايا المستهدفة المبرمج, ولكن ليس photobleach الخلية بأكملها. - كرر الخطوة أعلاه لإشعاع المزيد من الخلايا المستهدفة.
- تنفيذ التصوير الفاصل الزمني لمنطقه الدماغ الوسطي كما هو موضح في القسم 4.
6. معالجه الصور
- تنفيذ "الإسقاط الأقصى" للصور المكتسبة.
- البحث عن ووضع علامة XY الموضع والوقت من الخلايا الهدف ضمن عرض "الحد الأقصى الإسقاط".
- الرجوع إلى طريقه العرض القياسية للبحث عن موضع Z للخلايا الهدف ووضع علامة عليه.
- اقتصاص صوره الطبقة الواحدة للخلايا المستهدفة.
- تصدير قناه تراكب وحقل مشرق وأشرطه الفيديو في شكل AVI.
- اقتصاص منطقه الاهتمام بالقناة المتراكبه والحقل الساطع في ImageJ.
- الجمع بين اثنين من أشرطه الفيديو في الخطوة الاخيره عموديا وحفظ كواحد أفي تنسيق الفيديو في ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن ان تؤدي عدوي المتفطره إلى استجابات مختلفه للمضيف استنادا إلى طرق العدوى. في هذا البروتوكول ، يصاب الاجنه الزبرافوش بالحقن المجهري العضلي لفلوريسسينتلي المسمية البكتيريا في الدماغ الوسطي أو الجذع (الشكل 3) والتي يلاحظها التصوير الحي البؤري. العدوى عن طريق هذين المسارين سيقيد محليا العدوى التي تسبب تجنيد الخلايا المناعية الفطرية والموت اللاحق للخلايا.
تصور تفاصيل وفاه الخلايا المناعية الفطرية أمر صعب. يحدث موت الخلايا الليتيك علي نافذه زمنيه قصيرة جدا ويتطلب المجهر عالي الدقة لمراقبه. كما ان الحركة العالية للخلايا المناعية الفطرية تسمح لهم بالهجرة خارج منطقه المراقبة. في هذا البروتوكول ، نقوم بحل هذه المشكلة من خلال مراقبه الاجنه المتعددة بالتوازي. يمكن تركيب مجموعه من الاجنه الزكية علي شريحة مجهر زجاجيه واحده للعدوى ، ويمكن تركيب ما يصل إلى 10 أجنه علي نفس الطبق السفلي من الزجاج 35 ملم للتصوير الحي (الشكل 4). من خلال الاستفادة من نموذج البيانات الحية من المجهر البؤري ، يمكن ملاحظه أكثر من جنين واحد في وقت واحد. وهذا يعزز كفاءه التصوير الحي ويزيد بشكل كبير من احتمال الاستيلاء علي كامل عمليه الموت الخلية الليتيك.
الجهاز المناعي الفطري هو خط الدفاع الأول ضد العدوى المتفطرات ، واثنين من المكونات الرئيسية هي الضامة والعدلات. هنا نستخدم المبلغ عنها سابقا tg (coro1a: egfp; lyzDsRed2) و tg (mpeg1: loxp-dsredx-loxp-egfp ؛ lyz: egfp) لتمييز الضامة والالعدلات في فيفو16،17،18. أصبحت الضامة بشكل كبير مع البكتيريا المستديرة وعرض انخفاض الحركة ، مع تورم سيتوبلازمي في نهاية المطاف ، تمزق غشاء الخلية ، ونشر سريع للمحتوي سيتوبلازمي. هذه الاحداث هي التغييرات المورفولوجية النموذجية للموت الخلايا الليتيك كما ذكر سابقا (الشكل 5A)16. وقد استخدم تشعيع الاشعه فوق البنفسجية لتحريك الخلايا للخضوع للخلايا المبرمج في الزرد20,21. وتماشيا مع هذه الفكرة ، أظهرت الضامة المشعة فوق البنفسجية أنماط الخلايا الظاهرية النمطية ، مثل انكماش الخلايا ، والتجزؤ النووي ، والتكثيف الكروماتين (الشكل 5 ب)22،23. بالاضافه إلى استخدام Cerulean-الفلورسنت m. مارنوم19، وثلاثه ألوان حيه التصوير من التفاعل بين الضامة ، العدلات ، وتم تحقيق m. مارنوم في الجسم الحي. ولاحظنا أيضا ان الضامة يمكن ان فاجوسيتوسي بنشاط ونشر m. مارنوم (الشكل التكميلي 3a). ومع ذلك ، كانت العدلات محدوده القدرة وخضع بسرعة موت الخلايا الليتيك دون احتقان البكتيرية واضحة (الشكل التكميلي 3b). العدلات يمكن ان تكون ناجمه عن كثرة المحببات فقط عدد قليل من الموتى الذين لا يعبرون عن Cerulean-الفلورية ، أو ببساطه عن طريق ندره الخلايا الميتة محدوده الحطام.
الشكل 1: رسم تخطيطي لاعداد بكتيريا خليه واحده. خليه واحده Cerulean-الفلورسنت m. مارنوم الأسهم التي تم إنشاؤها بعد العملية الموصوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي لتركيب الاجنه الزبرافيش للحقن المجهري. (ا) رسم تخطيطي لعمليه التركيب. (ب) تم تركيب أجنه الزيبرافيش أفقيا للعدوى في منطقه الجذع. (ج) تم تركيب أجنه الزيبرافيش مع رؤوسهم موجهه للأعلى للاصابه بعدوي المخ الوسطي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد المواقع للحقن المجهري. (ا) يشير السهم الأحمر إلى موقع الحقن للعدوى في منطقه الجذع. (ب) يشير السهم الأحمر إلى موقع الحقن للاصابه بعدوي منتصف الدماغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الاجنه الزبرده المتصاعدة للتصوير الحي. (ا) بالنسبة للعدوى بالمخ النصفي ، كانت الاجنه الزكية قد شنت واتجهت رؤوسها إلى الأسفل. (ب) بالنسبة للعدوى في منطقه الجذع ، تم تركيب الاجنه الزكية بشكل أفقي مع موقع الحقن بالقرب من أسفل طبق الزجاج السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التغيرات المورفولوجية النموذجية في العدوى m. مارنوم التي يسببها الضامة موت الخلايا الليتيك والاشعه فوق البنفسجية التي يسببها الضام المبرمج. (ا) التصوير بالفواصل الزمنيه من الضامة (ماك) التي تمر بموت الخلايا الخلوية بمجرد انه يتم بشكل كبير مع m. مارنوم. الدماغ الأوسط من 3 dpf Tg (coro1a: egfp; lyzDsRed2) الجنين الزرد مصاب بواسطة cerulean-فلوري م. مارنوم (~ 500 كفو) عن طريق الحقن المجهري. يتم توفير الصور لكل من القناة المتراكبه (اللوحة العليا) وقناه DIC (اللوحة السفلي). T 00:00 هو 5 ح 20 دقيقه آخر العدوى. خطوط متقطعه بيضاء = المخطط التفصيلي لغشاء الخلية; خطوط متقطعه سوداء = تورم سيتوتوبلاسما. السهام السوداء = تمزق غشاء الخلية. خطوط متقطعه حمراء = فقدت بسرعة محتوي سيتوبلازمي. (ب) التصوير بالفواصل الزمنيه من الضامة المشعة UV. واحد GFP + خليه في منطقه الدماغ الوسطي من 3 dpf Tg (mfap4: egfp) هو المشع بواسطة الاشعه فوق البنفسجية وتليها التصوير الفاصل الزمني. خطوط متقطعه بيضاء = المخطط التفصيلي لغشاء الخلية; السهام السوداء = التجزئة النووية والتكثيف الكروماتين. شريط مقياس = 15 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: إنشاء غرفه بيئية للتصوير الحي. (ا) ضبط وحده التحكم الرقمية للحفاظ علي درجه الحرارة عند 28.5 درجه مئوية. (ب) وضع مناديل مبلله داخل الغرفة لتوفير الرطوبة ومنع تبخر مياه البيض. (ج) إغلاق غطاء الغرفة والانتظار لمده 30 دقيقه علي الأقل لتثبيت درجه الحرارة قبل البدء في التصوير الحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: اعداد اللوحة المحورية للتصوير الحي. (ا) تمثيل اعداد لوحه الاقتناء. (ب) تمثيل الطاقة بالليزر وإعدادات الطيف. (ج) تمثيل الوظائف المتعددة ووضع الحلقات في وضع البيانات الحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3: الضامة نشر العدوى والخضوع العدلات الموت الخلايا الخلوية بعد العدوى m. مارنوم . (ا) الضامة التي تنشر م. مارنوم في صندوق الامتعه (coro1a: Egfp; lyz: DsRed2) الاجنه الزيبرافيش المصابة بواسطة cerulean-فلوري م. مارنوم (~ 100 cfu). (ب) العدلات (النوى) التي تمر بموت الخلايا الليتيك دون واضح m. مارنوم لادن في المنطقة الجذع من 3 dpf Tg (mpeg1: ارlg; التحللي: egfp) الجنين الزرد المصابة بواسطة cerulean-فلوري م. مارنوم (~ 100 cfu) عن طريق الحقن المجهري. يتم تعيين اللون الأخضر إلى عرفان ويتم تعيين اللون الأحمر إلى egfp لتحسين التصور لعمليه الموت الخلية التحللي. تشير الأسهم السماوية إلى الخلايا المستهدفة. الأسهم في النقطة الحمراء إلى الخلايا التي هي علي وشك الإفراج عن محتويات سيتوتوبلاسما في الإطار التالي. الأسهم في النقطة الخضراء إلى الخلايا الميتة التي فقدت للتو محتواها سيتوتوبلاسما. شريط مقياس = 25 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الفيديو 1: الضامة محمله بشده مع m. مارينوم يخضع للموت الخلايا الطفيلية ، ذات الصلة إلى الشكل 5a. التصوير بالفواصل الزمنيه (63x الهدف) لمده 9 دقيقه و 18 ثانيه في 3 إطارات في الثانية (fps) من منطقه الدماغ الأوسط من 3 dpf Tg (coro1a: egfp; lyzDsRed2) الجنين الزيبرافيش المصابة بالفلورية-الفلورسنت m. مارينوم. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الفيديو 2: الضامة يخضع لموت الخلايا المبرمج بعد الاشعه فوق البنفسجية ، ذات الصلة إلى الشكل 5B. التصوير بالفاصل الزمني (63x الهدف) من 74 دقيقه في 6 اطارا في الثانية من منطقه الدماغ الأوسط من 3 dpf Tg (mfap4: egfp) الجنين الزرد. يتم التشعيع خليه واحده + GFP في منطقه الدماغ الوسطي من الاجنه بواسطة الاشعه فوق البنفسجية وتليها التصوير الفاصل الزمني. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
فيديو 3: الضامة تنشر m. مارنوم, المتعلقة الشكل التكميلي 3 ا. التصوير بالفاصل الزمني (63x الهدف) من 24 دقيقه في 3 اطارا في الثانية من المنطقة الجذع من 2 dpf Tg (coro1a: eGFP; lyz: DsRed2) الجنين الزيبرافيش المصابة بالفلورية-الفلورسنت م. مارنوم. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الفيديو 4: العدلات يخضع لموت الخلايا الطفيلية دون واضح m. مارنوم engorgement ، المتعلقة الشكل التكميلي 3b. التصوير بالفواصل الزمنيه (63x الهدف) من 7 دقيقه 30 ثانيه في 3 اطارا في الثالثة من المنطقة الجذع من 3 dpf Tg (mpeg1: ارLG; lyz: eGFP) الجنين زيبراافيش المصابة بالفلورية-الفلورسنت m. مارينوم. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول التصور للوفاة الضامة اثناء العدوى المتفطرات. استنادا إلى عوامل مثل سلامه غشاء الخلية ، يمكن تقسيم موت الخلايا مدفوعة العدوى إلى موت الخلايا المبرمج ووفاه الخلية التحللي24،25. الموت الخلية lytic هو أكثر إرهاقا للكائن الحي من المبرمج ، لأنه يحفز استجابه التهابيه قويه 24،25. المراقبة من موت الخلايا الليتيك في الجسم الصلب من الصعب ، وذلك بسبب متطلبات الدقة المكانية والزمانيه عاليه ، وإعدادات المجهر البؤري السليم ، والتعبير الوراثي القوي.
يتطلب الحقن المجهري السليم عده خطوات حاسمه. يجب ان يكون المخزون البكتيرية سونيكاتيد تماما لأزاله جميع كتل قبل الحقن. لقد قمنا بتحسين التركيب الزبرافيش للحقن المجهري من خلال دمجها علي شريحة زجاجيه بين طبقتين من الذوبان المنخفض. بعد تطبيق الطبقة الثانية من اجنشا ، يتم نقل الشريحة إلى مربع الجليد أو سطح بارد لتسريع التصلب ومنع الجفاف من اجنشا. إذا كانت الاجنه تحتاج إلى ان تركب علي شرائح مختلفه ، تاكد من الحفاظ علي الطبقة العليا من الرطبة التي نشات عن طريق أضافه مياه البيض اضافيه.
للتصوير الحي ، مطلوب عدسه عاليه الدقة الهدف لمراقبه تفاصيل وفاه الخلية. ويرافق هذا الشرط دائما مسافة قصيرة العمل ، التالي يتطلب وضع موقع العدوى بالقرب من الشريحة الغطاء. عدسه طويلة العمل مسافة المياه مثاليه للتصوير أعمق الانسجه وسوف تسمح لمزيد من المساحة لتركيب الجنين السليم. التصوير الحي الممتد باستخدام الليزر مع كثافة عاليه سوف يسبب تلف الانسجه أو وفاه الجنين. التالي ، فمن المهم جدا للحفاظ علي كثافة الليزر منخفضه قدر الإمكان لتجنب الرشح الضوئي والسمية. والتعبير بقوة المعدلة وراثيا يمكن ان تسهل المراقبة باستخدام الليزر مع كثافة منخفضه. لان التعبير GFP اقوي في tg (coro1a: egfp) من tg (Mpeg1: egfp)، استخدمنا Tg (coro1a: Egfp ؛ lyz: DsRed2) بدلا من tg (mpeg1: egfp; lyz: DsRed2) في هذه الدراسة. يعد إنشاء محطه عمل متنقلة للحقن المجهري بالقرب من الجهاز المحوري أفضل لمراقبه الاستجابات السريعة. تقشعر لها الأبدان ذوبان منخفضه نشات علي الجليد لتسريع الوقت التصلب يمكن ان تساعد أيضا في تقليل الوقت بين الحقن والتصوير الحي.
في هذا البروتوكول ، ونحن نركز علي مراقبه السلوك الضام. ومع ذلك ، فان الدراسة التفصيلية للسلوك العدلات اثناء العدوى المتفطرات يمكن أيضا ان تكون مفيده. علي سبيل المثال ، كيف يتم اشراك الفخاخ غير الخلوية (الشباك) في قتل المتفطره خارج الخلية لا يزال غير معرف إلى حد كبير. الجمع بين تقنيه التصوير الموصوفة في هذا البروتوكول مع البروتين هيستون وضع العلامات الوراثية سوف تسهل إلى حد كبير التصور من الشباك في الجسم المجري.
حاليا ، يتم التعرف علي الزرد كنظام قوي جدا لدراسة سلوك الخلايا المناعية الفطرية. ويمكن تحقيق البيانات الاحصائيه عن كثرة الكريات وموت الخلايا باستخدام هذا البروتوكول. بالاضافه إلى أدوات تحرير الجينات القوية المتاحة اليوم ، يمكن لهذا البروتوكول توفير منصة فعاله لزيادة فهم تاثير مجموعه متنوعة من العوامل علي التفاعل بين المضيف والممرض في الجسم الخارجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور زيلونغ ون لتقاسم سلالات الزرد ، الدكتور ستيفان اواهلرز والدكتور ديفيد توبين لتقاسم الموارد المتعلقة m. مارنوم ، yuepeng هو للمساعدة في اعداد الرقم. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81801977) ، وبرنامج تدريب الشباب المتميز للجنة الصحة البلدية في شنغهاي (2018YQ54) (B.Y.) ، وبرنامج شنغهاي للإبحار (18YF1420400) (B.Y.) ، والصندوق المفتوح لمختبر شانغهاي الرئيسي للسل (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
