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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से जेब्राफिश भ्रूण में माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज लिटिक सेल डेथ का दृश्य

Published: January 9, 2019 doi: 10.3791/60698
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, 2School of Life Sciences, Bengbu Medical College

Summary

यह प्रोटोकॉल माइकोबैक्टीरियम मैरिनम संक्रमण के दौरान भ्रूणीय जेब्राफिश में मैक्रोफेज व्यवहार और मृत्यु की कल्पना करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है। बैक्टीरिया की तैयारी के लिए कदम, भ्रूण के संक्रमण, और इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी शामिल हैं। इस तकनीक को संक्रमण या बाँझ सूजन से जुड़े समान परिदृश्यों में सेलुलर व्यवहार और मृत्यु के अवलोकन पर लागू किया जा सकता है।

Abstract

जेब्राफिश अपनी पारदर्शी प्रकृति और जल्दी विकास के दौरान अपनी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली पर पूरी तरह से निर्भरता के कारण जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। जेब्राफिश माइकोबैक्टीरियम मैरिनम (एम मैरिनम)संक्रमण मॉडल माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में अच्छी तरह से स्थापित किया गया है। यह सुझाव दिया गया है कि विभिन्न मैक्रोफेज सेल मृत्यु प्रकार माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के विविध परिणामों को जन्म देंगे। यहां हम एम मैरिनम संक्रमण के बाद जेब्राफिश भ्रूण में मैक्रोफेज सेल मौत का निरीक्षण करने के लिए इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। जेब्राफिश ट्रांसजेनिक लाइनें जो विशेष रूप से मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल को लेबल करती हैं, वे फ्लोरोसेंटी लेबल वाले एम मैरिनम के इंट्रामस्कुलर माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से संक्रमित होती हैं या तो मिडब्रेन या ट्रंक में। संक्रमित जेब्राफिश भ्रूण को बाद में कम पिघलने वाले अगारोज पर रखा जाता है और एक्स-वाई-जेड-टी आयामों में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है। क्योंकि लंबे समय तक लाइव इमेजिंग के लिए फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिकिटी से बचने के लिए कम लेजर पावर का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, इसलिए ट्रांसजेनिक को दृढ़ता से व्यक्त करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। यह प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन, होस्ट रोगजनक बातचीत और सेल डेथ सहित वीवो में गतिशील प्रक्रियाओं के दृश्य की सुविधा प्रदान करता है।

Introduction

माइकोबैक्टीरियल संक्रमण मेजबान प्रतिरक्षा कोशिका मौत1का कारण प्रदर्शन किया गया है । उदाहरण के लिए, एक तनु तनाव मैक्रोफेज में एपोप्टोसिस को ट्रिगर करेगा और संक्रमण को नियंत्रित करेगा। हालांकि, एक उग्र तनाव lytic सेल मौत को ट्रिगर करेगा, जिससे बैक्टीरियल प्रसार1,2। इन विभिन्न प्रकार की कोशिका मृत्यु के प्रभाव को ध्यान में रखते हुए मेजबान एंटी-माइकोबैक्टीरियल प्रतिक्रिया पर है, वीवो में माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज सेल मौत का विस्तृत अवलोकन आवश्यक है।

सेल डेथ को मापने के लिए पारंपरिक तरीकों में मृत सेल दाग का उपयोग करना है, जैसे कि एननेक्सिन वी, ट्यूनल, या कक्रिडीन नारंगी/प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला3,4,5। हालांकि, ये तरीके वीवो में सेल डेथ की गतिशील प्रक्रिया पर प्रकाश नहीं डाल पा रहे हैं। लिव इमेजिंग6से सेल डेथ इन विट्रो की प्रेक्षण पहले ही सुविधा प्रदान की जा चुकी है । हालांकि, क्या परिणाम सही शारीरिक स्थितियों की नकल अस्पष्ट रहता है ।

जेब्राफिश मेजबान एंटी-माइकोबैक्टीरियम प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल रहा है। इसमें मनुष्यों के समान एक अत्यधिक संरक्षित प्रतिरक्षा प्रणाली है, आसानी से छेड़छाड़ जीनोम, और प्रारंभिक भ्रूण पारदर्शी होते हैं, जो लाइव इमेजिंग7,8,9के लिए अनुमति देता है। एम मैरिनम के साथ संक्रमण के बाद, वयस्क ज़ेब्राफिश विशिष्ट परिपक्व ग्रैनुलोमा संरचनाओं का रूप देता है, और भ्रूणीय ज़ेब्राफिश प्रारंभिक ग्रैनुलोमा जैसे संरचनाओं9,10बनाते हैं। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका-बैक्टीरिया बातचीत की गतिशील प्रक्रिया को पहले जेब्राफिश एम मैरिनम संक्रमण मॉडल11,12में खोजा गया है। हालांकि, उच्च स्थानिक-लौकिक संकल्प आवश्यकता के कारण, जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मृत्यु के आसपास के विवरण काफी हद तक अपरिभाषित रहते हैं।

यहां हम वर्णन करते हैं कि वीवो में माइकोबैक्टीरियल संक्रमण से शुरू होने वाली मैक्रोफेज लिटिक सेल डेथ की प्रक्रिया की कल्पना कैसे की जाए। यह प्रोटोकॉल विकास और सूजन के दौरान वीवो में सेलुलर व्यवहार की कल्पना करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।

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Protocol

पशु कल्याण की नैतिक समीक्षा के लिए प्रयोगशाला पशु दिशा-निर्देशों (GB/T 35823-2018) के अनुपालन में जेब्राफिश को मानक परिस्थितियों में उठाया गया था । इस अध्ययन में सभी जेब्राफिश प्रयोगों को मंजूरी दी गई (2019-A016-01) और शंघाई पब्लिक हेल्थ क्लीनिकल सेंटर, फुदान विश्वविद्यालय में आयोजित किया गया ।

1. एम मैरिनम सिंगल सेल इनोकुलम तैयारी(चित्रा 1)

  1. गल सेरूलन-फ्लोरोसेंट एम मैरिनम ग्लाइसेरोल स्टॉक -80 डिग्री सेल्सियस से और 10% (v/v) ओएडीसी, 0.25% ग्लाइसेरोल और 50 μg/mL hygromycin के साथ 7H10 आगर प्लेट का टीका लगाते हैं। लगभग 10 दिनों तक प्लेट को 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 10% ओएडीसी, 0.5% ग्लाइसेरोल, और 50 μg/mL हाइग्रोमाइसिन के साथ सकारात्मक फ्लोरेसेंस और टीका लगाने वाले 7एच9 मीडियम की 3 एमआईएल को व्यक्त करने वाली कॉलोनी का चयन करें।
    1. 32 डिग्री सेल्सियस और 100 क्रांतियों प्रति मिनट (आरपीएम) पर टीका 4-6 दिनों के लिए तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि संस्कृति लोगरिथमिक चरण (ओडी600 = 0.6-1.0) तक न पहुंच जाए।
    2. 10% OADC, 0.5% ग्लाइसेरोल, 0.05% ट्वीन-80, और 50 μg/mL के साथ ताजा 7H9 माध्यम के 30 मीटर में उपसंस्कृति (1:100) जब तक ओडी600 तक पहुंचता है ~ 1.0.
      नोट: उच्चतम संस्कृति गुणवत्ता के लिए, इस बिंदु पर एक उपसंस्कृति कदम की सिफारिश की जाती है। हमारे अनुभव में, क्लोन को सीधे बड़ी मात्रा में मध्यम से जोड़ने से बैक्टीरियल झुरमुट का निर्माण होगा।
  3. नीचे वर्णित एम मैरिनम कोशिकाओं को एकत्र करें।
    1. 10 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र एक गोली के रूप में एम मैरिनम इकट्ठा करने के लिए। सुपरनेटेंट के सभी लेकिन 300 माइक्रोन को त्यागें और इसका उपयोग गोली को फिर से निलंबित करने के लिए करें।
    2. गोली को और फिर से निलंबित करने के लिए 10% ग्लाइसेरोल के साथ 7H9 मध्यम के 3 mL जोड़ें, फिर 15 एस ऑन पर 100 डब्ल्यू पर पानी के स्नान में निलंबन को सोनीकेट करें, कुल 2 मिन के लिए 15 एस ऑफ।
      नोट: सोनिकेशन का उद्देश्य इनोकुलम के लिए एक एकल कोशिका समरूप प्राप्त करना है, जो माइक्रोइंजेक्शन सुई की रुकावट को रोकदेगा।
  4. बैक्टीरियल निलंबन को 10 मिलीएल सिरिंज में स्थानांतरित करें, फिर किसी भी बैक्टीरियल झुरमुट को हटाने के लिए 5 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें।
  5. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निलंबन के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें और इसे 7H9 मीडिया के साथ ओडी600 = 1.0 तक पतला करें जिसमें 10% ग्लाइसेरोल होता है। निलंबन को 10 माइक्रोन एलिकोट्स में विभाजित करें और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर स्टोर करें।
  6. ओएडीसी के 10% (v/v), ग्लाइरोल के ०.५% और हाइग्रोमाइसिन के ५० μg/mL युक्त 7H10 आगर प्लेट पर बैक्टीरियल स्टॉक की आंतल (cfu/mL) की जीवाणु एकाग्रता की पुष्टि करें ।

2. जेब्राफिश भ्रूण तैयारी

  1. एक दिन पहले स्पॉन, प्रजनन कक्ष में जेब्राफिश प्रजनन जोड़े की स्थापना की ।
    नोट: प्रत्येक प्रजनन कक्ष में केवल एक जोड़ी जोड़ें।
  2. अगली सुबह 1 एच पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) के भीतर भ्रूण एकत्र करें। ध्यान से आसुत पानी के साथ भ्रूण धोने और एक १०० मिमी पेट्री E3 माध्यम के 30 मिलील युक्त पकवान में १०० भ्रूण तक हस्तांतरण । 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. 12 घंटे के बाद, माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें और गैर-निषेचित या क्षतिग्रस्त अंडे को त्यागदें।
  4. 24 एचपीएफ में, वर्णक के विकास को रोकने के लिए एन-फिनाइलथिओरेया (पीटीयू, 0.2 एनएम अंतिम एकाग्रता) के साथ मध्यम को ताजा E3 माध्यम में बदलें। भ्रूण को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए तैयार न हो जाएं।

3. बैक्टीरियल माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से संक्रमण

  1. बोरोसिलिकेट ग्लास माइक्रोकेपिलरी इंजेक्शन सुई तैयार करें जैसा कि पहले संदर्भ13में वर्णित था।
  2. संक्रमण के लिए बढ़ते ज़ेब्राफिश भ्रूण
    1. माइक्रोवेव 1% (w/v) के 100 एमएल और 0.5% (w/v) कम पिघलने वाला अगारोज का 100 एमएल एक ऑटोक्लेव्ड ई3 मीडियम में जब तक अगारोज पूरी तरह से पिघल जाता है। 1 एमएल अलीकोट ट्यूबों में विभाजित करें और भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. उपयोग से पहले, 95 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में अगारोज को गर्म करें जब तक कि यह पूरी तरह से पिघल न जाए। अगरोज को 45 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक(चित्रा 2)में रखकर तरल रूप में बनाए रखें।
    3. ट्रंक क्षेत्र में इंट्रामस्कुलर संक्रमण के लिए बढ़ते
      1. 1% (w/v) के 0.5 mL डालने के द्वारा नीचे अगारोज परत बनाएं समान रूप से एक ग्लास स्लाइड पर अगारोज। जमना करने के लिए 3 मिन के लिए बर्फ के बक्से या ठंडी सतह पर रखें।
      2. बढ़ते से पहले 5 मिन के लिए ट्राइकेन (200 μg/mL) और पीटीयू के साथ अंडे के पानी में जेब्राफिश भ्रूण (48-72 एचपीएफ) एनेस्थेटइज़ करें। नीचे अगारोज परत पर 60 ज़ेब्राफिश भ्रूण तक रखें और उन्हें ध्यान से दो पंक्तियों(चित्रा 2बी)में रखें।
      3. ऊपरी परत बनाने के लिए ०.५% (w/v) agarose के ०.३ mL जोड़ने से पहले ऊतक कागज के साथ नीचे agarose परत पर किसी भी शेष पानी निकालें । सुनिश्चित करें कि भ्रूण पूरी तरह से अगारोज में एम्बेडेड हैं। अगारोज को जमना और निर्जलीकरण को रोकने के लिए ग्लास स्लाइड को फिर से बर्फ बॉक्स में लौटाएं।
      4. अतिरिक्त E3 अंडे के पानी के साथ सतह को कवर करके अगारोज नम की शीर्ष परत रखें।
    4. मिडब्रेन संक्रमण के लिए बढ़ते
      1. 1% (w/v) अगारोज के साथ एक एकल concavity ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड की नाली को कवर करें, और फिर 4-6 ट्राइकेन-एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण को अगारोज में स्थानांतरित करें।
      2. प्रत्येक भ्रूण के सिर को 10 जी सुई(चित्रा 2सी)के साथ ध्यान से ऊपर की ओर रखें।
      3. एक बार सभी भ्रूण की स्थिति तय कर रहे हैं, एक बर्फ बॉक्स या ठंडी सतह के लिए कांच स्लाइड हस्तांतरण करने के लिए अगागुलाब जमना ।
        नोट: भ्रूण के साथ अंडे के पानी के हस्तांतरण की मात्रा को कम करके कम पिघलने वाले अगागुलाब के कमजोर पड़ने से बचें।
  3. संक्रमण के लिए बैक्टीरिया तैयार
    1. बैक्टीरियल स्टॉक (चरण 1 में निर्मित) के 10 माइक्रोन एलिकोट में बाँझ-फ़िल्टर किए गए फिनॉल लाल (10x) का 1 μL जोड़ें और संक्षेप में भंवर द्वारा मिलाएं।
      नोट: अंतिम एकाग्रता बाँझ PBS का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है ।
    2. 10 एस ऑन पर 100 डब्ल्यू का उपयोग करके तैयारी, 1 0 एस ऑफ फॉर 1 0 0 00 से किसी भी झुरमुट को तोड़ने के लिए जो14का गठन कर सकता है।
  4. माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से संक्रमण
    1. माइक्रोइंजेक्टर और माइक्रोस्पेशिंग को उचित स्थिति में समायोजित करें और माइक्रोइंजेक्शन के लिए सेटिंग करें जैसा कि पहले13में बताया गया था ।
    2. तैयार सुई में एक माइक्रो लोडर का उपयोग कर बैक्टीरियल तैयारी के 3 μL स्थानांतरण (चरण 3.1 देखें) । हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए धीरे-धीरे और सावधानी से पिपेट करें।
    3. ट्रंक क्षेत्र संक्रमण के लिए, ट्रंक क्षेत्र में 100 सीएफयू इंजेक्ट करें(चित्रा 3ए)। नोटोकॉर्ड में बैक्टीरिया इंजेक्शन से बचें।
      नोट: इंजेक्शन के लिए सीएफयू का अनुमान फॉर्मूला सीएफयू = बैक्टीरियल स्टॉक कंसंट्रेशन एक्स कमजोर पड़ने वाले कारक एक्स इंजेक्शन ड्रॉपलेट वॉल्यूम से लगाया जाता है। वास्तविक सीएफयू की पुष्टि 7H10 आगर प्लेट पर बैक्टीरियल इनोक्यूलम की एक बूंद चढ़ाना द्वारा की जाती है जिसमें ओएडीसी का 10% (v/v), ग्लाइसेरोल का ०.५% और हाइग्रोमाइसिन का ५० μg/mL होता है ।
    4. मिडब्रेन संक्रमण के लिए, मिडब्रेन क्षेत्र(चित्रा 3बी)में लगभग 500 सीएफयू इंजेक्ट करें।
    5. माइक्रोइंजेक्शन के बाद, जेबकतरे भ्रूण को प्लास्टिक के पिपेट के साथ ताजे अंडे के पानी में सावधानी से फ्लश करें।
      नोट: बहुत जल्दी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रिया के अवलोकन को कवर करने के लिए जितनी जल्दी हो सके कांच के नीचे पकवान में भ्रूण माउंट ।

4. संक्रमण की लाइव इमेजिंग

  1. लाइव इमेजिंग के लिए बढ़ते मछली
    1. एक गिलास नीचे 35 मिमी पकवान के बीच में 10 ट्राइकेन-एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण तक स्थानांतरित करें। अतिरिक्त E3 माध्यम त्यागें।
    2. 1% कम पिघलने बिंदु agarose के साथ पकवान कवर और ज़ेब्राफिश भ्रूण ध्यान से एक 10 जी सुई का उपयोग कर ओरिएंट । अगारोज को जमना करने के लिए 10 एस के लिए बर्फ पर ग्लास बॉटम डिश को इनक्यूबेट करें।
      नोट: मिडब्रेन इंजेक्शन के लिए, भ्रूण को ऊपर की ओर निर्देशित सिर के साथ अगारोज में रखा जाना चाहिए(चित्रा 4ए)। ट्रंक क्षेत्र इंट्रामस्कुलर संक्रमण के लिए, भ्रूण को बाद में अगारोज(चित्र4बी)में रखा जाना चाहिए।
    3. एक बार जब यह पूरी तरह से जम जाता है, तो अंडे के पानी (प्लस 1 एक्स ट्राइकेन और पीटीयू) की एक परत के साथ अगारोज को कवर करें।
  2. तीन रंग उच्च संकल्प समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी
    नोट: निम्नलिखित चरण 63.0 x 1.40 तेल यूवी ऑब्जेक्टल लेंस से लैस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर संचालित होते हैं।
    1. पर्यावरण कक्ष का तापमान 28.5 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। आर्द्रता प्रदान करने और अंडे के पानी(पूरक चित्रा 1)के वाष्पीकरण को रोकने के लिए कक्ष के अंदर कुछ गीले ऊतक कागज रखें।
    2. पर्यावरण कक्ष में जेब्राफिश के साथ 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश रखें।
    3. कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर खोलें और स्टेज को शुरू करें। 63.0 x 1.40 तेल यूवी उद्देश्य पर स्विच करें, और एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) फिल्टर के साथ उज्ज्वल क्षेत्र चैनल का उपयोग कर जेब्राफ़िश का पता लगाएं।
    4. 405 डायोड, आर्गन (20% पावर) और डीपीएस एस 561 एनएम लेजर खोलें। उपयुक्त लेजर पावर और स्पेक्ट्रम सेटिंग्स की स्थापना की।
      नोट: निम्नलिखित सेरूलन के लिए स्पेक्ट्रम सेटिंग्स हैं (उत्तेजना = 405 एनएम; उत्सर्जन = ~ 456-499 एनएम), ईजीएफपी (उत्तेजना = 488 एनएम; उत्सर्जन = ~ 500-550 एनएम), DsRed2 (उत्तेजना = 561 एनएम; उत्सर्जन = ~ 575-645 एनएम)(पूरक चित्रा 2बी)।
    5. 'XYZ'अनुक्रमिक स्कैनअधिग्रहण मोड चुनें और छवियों प्रारूप को'512 x 512 पिक्सल'(पूरक चित्र 2A)में सेट करें।
    6. 'लाइवडेटा मोड'पर स्विच करें। पहले जेब्राफिश की स्थिति को निशाना बनाते हैं और'शुरू'और'एंड'जेड पोजीशन को चिह्नित करें। शेष भ्रूण में से प्रत्येक के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। कार्यक्रम के अंत में एक'ठहराव'जोड़ा जा सकता है(पूरक चित्रा 2C)।
    7. कार्यक्रम के लूप और चक्र को परिभाषित करें।
    8. फाइल को सेव दें।

5. एपोप्टोसिस और लाइव इमेजिंग को प्रेरित करने के लिए एकल सेल यूवी विकिरण

  1. माउंट मछली के रूप में कदम 4.1 में वर्णित है।
  2. 3 दिनों के मिडब्रेन क्षेत्र इमेजिंग निषेचन (डीपीएफ) मैक्रोफेज विशिष्ट ट्रांसजेनिक टीजी (mfap4-eGFP) भ्रूण15
  3. एक फ्लोरोसेंटी लेबल मैक्रोफेज के हित के क्षेत्र का चयन करें और 400 हर्ट्ज गति पर स्कैन और 50 एस के लिए 6% यूवी लेजर पावर।
    नोट: स्कैनिंग गति और समय व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। स्कैनिंग समय को व्यापक डीएनए क्षति का कारण बनने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए जो बाद में लक्ष्य कोशिका एपोप्टोसिस का कारण बनेगा, लेकिन पूरे सेल को फोटोब्लीच नहीं करेगा।
  4. अधिक लक्षित कोशिकाओं को विकिरणित करने के लिए उपरोक्त चरण दोहराएं।
  5. धारा 4 में वर्णित मिडब्रेन क्षेत्र की समय चूक इमेजिंग करें।

6. इमेज प्रोसेसिंग

  1. अधिग्रहीत छवियों के लिए"अधिकतम प्रक्षेपण"प्रदर्शन करें।
  2. 'अधिकतमप्रक्षेपण'दृश्य के तहत लक्ष्य कोशिकाओं की XY स्थिति और समय का पता लगाएं और चिह्नित करें।
  3. लक्ष्य कोशिकाओं की जेड स्थिति को खोजने और चिह्नित करने के लिए मानक दृश्य पर वापस जाएं।
  4. लक्ष्य कोशिकाओं की एकल परत छवि को क्रॉप करें।
  5. AVI प्रारूप में वीडियो के रूप में ओवरले चैनल और उज्ज्वल क्षेत्र का निर्यात करें।
  6. इमेजजे में ओवरले चैनल और उज्ज्वल क्षेत्र के हित के क्षेत्र को क्रॉप करें।
  7. अंतिम चरण में दो वीडियो को लंबवत मिलाएं और इमेजजे में एक AVI प्रारूप वीडियो के रूप में सहेजें।

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Representative Results

माइकोबैक्टीरियम संक्रमण संक्रमण के मार्गों के आधार पर विभिन्न मेजबान प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में, जेब्राफिश भ्रूण फ्लोरोसेंटी लेबल वाले बैक्टीरिया के इंट्रामस्कुलर माइक्रोइंजेक्शन से मिडब्रेन या ट्रंक(चित्रा 3)में संक्रमित होते हैं और कॉन्फोकल लाइव इमेजिंग द्वारा मनाए जाते हैं। इन दो मार्गों के माध्यम से संक्रमण स्थानीय रूप से जन्मजात प्रतिरक्षा सेल भर्ती और बाद में सेल मौत के कारण संक्रमण को प्रतिबंधित करेगा ।

जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका मृत्यु के विवरण की कल्पना चुनौतीपूर्ण है। Lytic सेल मौत एक बहुत ही कम समय खिड़की पर होता है और निरीक्षण करने के लिए उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता है । इसके अलावा, जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उच्च गतिशीलता उन्हें अवलोकन क्षेत्र से बाहर स्थानांतरित करने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में, हम समानांतर में कई भ्रूण देख कर इस मुद्दे को हल करते हैं । जेब्राफिश भ्रूण की एक सरणी संक्रमण के लिए एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मुहिम शुरू की जा सकती है, और 10 भ्रूण ों को लाइव इमेजिंग(चित्रा 4)के लिए एक ही 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश पर रखा जा सकता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लाइव डाटा मॉडल का फायदा उठाकर एक से बढ़कर एक भ्रूण एक साथ देखे जा सकते हैं। यह लाइव इमेजिंग की दक्षता को बढ़ाता है और पूरी तरह से लिटिक सेल डेथ प्रक्रिया पर कब्जा करने की संभावना को बहुत बढ़ाता है।

जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है, और दो प्रमुख घटक मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल हैं। यहां हम पहले रिपोर्ट किए गए टीजी (coro1a: eGFP;lyzDsRed2) और टीजी (mpeg1: loxP-DsRedx-loxP-eGFP; lyz:eGFP) का उपयोग मैक्रोफेज और विवो16,17,18में न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए करते हैं । बैक्टीरिया के साथ भारी रूप से एन्घोर हो गया एक मैक्रोफेज गोल हो गया और कम गतिशीलता प्रदर्शित हुई, जिसमें अंतिम साइटोप्लाज्मिक सूजन, कोशिका झिल्ली का टूटना, और साइटोप्लाज्मिक सामग्री का त्वरित प्रसार हुआ। ये घटनाएं लिटिक सेल डेथ के विशिष्ट रूपात्मक परिवर्तन हैं जैसा कि पहले बताया गया था (चित्रा 5A)16। यूवी विकिरण का उपयोग जेब्राफिश20,21में एपोप्टोसिस से गुजरने के लिए कोशिकाओं को ट्रिगर करने के लिए किया गया है । इस धारणा के अनुरूप, यूवी विकिरणित मैक्रोफेज ने विशिष्ट अपोप्टिक सेल फेनोटाइप दिखाए, जैसे सेल सिकुड़न, परमाणु विखंडन, और क्रोमेटिन संघनन(चित्रा 5B)22,23। सेरूलन-फ्लोरोसेंट एम मैरिनम19के उपयोग के साथ संयुक्त, मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल और एम मैरिनम के बीच बातचीत की तीन रंग लाइव इमेजिंग वीवो में हासिल की गई थी। हमने यह भी देखा कि मैक्रोफेज सक्रिय रूप से एम मैरिनम (पूरक चित्रा 3ए)का प्रचार-प्रसार कर सकते हैं। हालांकि, न्यूट्रोफिल में सीमित फागोसाइटिक क्षमता थी और जल्दी से स्पष्ट बैक्टीरियल एंग्ऑर्गेमेंट(पूरक चित्रा 3बी)के बिना लिटिक सेल डेथ हो गई थी। न्यूट्रोफिल केवल कुछ मृत एम मैरिनम के फागोसाइटोसिस से ट्रिगर किया जा सकता है जो सेरूलन-फ्लोरेसेंस को व्यक्त नहीं करते हैं, या बस सीमित मृत सेल मलबे के फागोसाइटोसिस द्वारा।

Figure 1
चित्र 1: एकल कोशिका बैक्टीरिया तैयार करने का योजनाबद्ध आरेख। वर्णित प्रक्रिया के बाद सिंगल सेल सेरूलन-फ्लोरोसेंट एम मैरिनम स्टॉक्स जेनरेट किए गए थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोइंजेक्शन के लिए बढ़ते जेब्राफिश भ्रूण का आरेख। (क)बढ़ते प्रक्रिया का योजनाबद्ध आरेख। (ख)ट्रंक क्षेत्र के संक्रमण के लिए जेब्राफिश भ्रूण को बाद में घुड़सवार किया गया था । (ग)जेब्राफिश भ्रूण को मिडब्रेन के संक्रमण के लिए ऊपर की ओर निर्देशित उनके सिर के साथ रखा गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोइंजेक्शन के लिए स्थिति। (A)लाल तीर ट्रंक क्षेत्र के संक्रमण के लिए इंजेक्शन साइट को इंगित करता है। (ख)लाल तीर मिडब्रेन संक्रमण के लिए इंजेक्शन साइट को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: लाइव इमेजिंग के लिए बढ़ते ज़ेब्राफिश भ्रूण। (क)मिडब्रेन संक्रमण के लिए, ज़ेब्राफिश भ्रूण उनके सिर के साथ नीचे की ओर निर्देशित किया गया । (ख)ट्रंक क्षेत्र संक्रमण के लिए, जेब्राफिश भ्रूण को कांच के नीचे पकवान के नीचे के करीब इंजेक्शन साइट के साथ पार्श्व में घुड़सवार किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एम मैरिनम संक्रमण में विशिष्ट रूपात्मक परिवर्तन मैक्रोफेज लिटिक सेल डेथ और यूवी प्रेरित मैक्रोफेज एपोप्टोसिस प्रेरित करते हैं। (A) एम मैरिनमके साथ भारी रूप से एन्गर्गित होने के बाद लिटिक सेल डेथ से गुजर रहे मैक्रोफेज (मैक) की टाइम लैप्स इमेजिंग । 3 डीपीएफ टीजी (coro1a: eGFP;lyzDsRed2) जेब्राफिश भ्रूण का मिडब्रेन माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से सेरूलन-फ्लोरोसेंट एम मैरिनम (~ 500 सीएफयू) से संक्रमित है। ओवरले चैनल (ऊपरी पैनल) और डीआईसी चैनल (निचले पैनल) दोनों के लिए छवियां प्रदान की जाती हैं। टी 00:00 5 घंटे 20 min पोस्ट संक्रमण है। सफेद धराशायी लाइनें = कोशिका झिल्ली की रूपरेखा; काले धराशायी लाइनें = सूजन साइटोप्लाज्म; काले तीर = उठी कोशिका झिल्ली; लाल धराशायी लाइनें = जल्दी से साइटोप्लाज्मिक सामग्री खो दिया है। (ख)यूवी विकिरणित मैक्रोफेज की समय चूक इमेजिंग। 3 डीपीएफ टीजी (एमएफएपी4:ईजीएफपी) के मिडब्रेन क्षेत्र में एक जीएफपी + सेल यूवी द्वारा विकिरणित है और इसके बाद समय चूक इमेजिंग है। सफेद धराशायी लाइनें = कोशिका झिल्ली की रूपरेखा; काले तीर = परमाणु विखंडन और क्रोमेटिन संघनन। स्केल बार = 15 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: पर्यावरण चैंबर लाइव इमेजिंग के लिए स्थापित किया । }तापमान को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए डिजिटल कंट्रोलर सेट करें। (ख)आर्द्रता प्रदान करने और अंडे के पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए कक्ष के अंदर गीले पोंछे सेट करें। (ग)कक्ष के कवर को बंद करें और लाइव इमेजिंग शुरू करने से पहले तापमान स्थिरीकरण के लिए कम से कम 30 न्यूनतम का इंतजार करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 2
पूरक चित्रा 2: लाइव इमेजिंग के लिए कॉन्फोकल पैनल सेटिंग। (A)अधिग्रहण पैनल की स्थापना का प्रतिनिधित्व। (ख)लेजर पावर और स्पेक्ट्रम सेटिंग्स का प्रतिनिधित्व । (ग)लाइव डेटा मोड में कई नौकरियों और लूप सेटिंग का प्रतिनिधित्व । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 3
पूरक चित्रा 3: मैक्रोफेज संक्रमण का प्रसार करते हैं और न्यूट्रोफिल एम मैरिनम संक्रमण के बाद लिटिक सेल डेथ से गुजरते हैं। (A)मैक्रोफेज एक 2 डीपीएफ टीजी (coro1a: eGFP; lyz:DsRed2) जेब्राफिश भ्रूण सेरूलन-फ्लोरोसेंट एम मैरिनम (~ १०० cfu) से संक्रमित के ट्रंक में एम मैरिनम का प्रसार । (ख)न्यूट्रोफिल (Neu) 3 डीपीएफ टीजी (mpeg1: LRLG; lyz:eGFP) जेब्राफिश भ्रूण के ट्रंक क्षेत्र में स्पष्ट एम मैरिनम लादेन के बिना lytic सेल मौत के दौर से गुजर माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से Cerulean-फ्लोरोसेंट एम मैरिनम (~ १०० cfu) से संक्रमित । ग्रीन कलर एलआरएलजी को सौंपा जाता है और रेड कलर को लिटिक सेल डेथ प्रोसेस के बेहतर विजुअलाइजेशन के लिए ईजीएफपी को सौंपा जाता है । सियान में तीर लक्ष्य कोशिकाओं को इंगित करते हैं। अगले फ्रेम में साइटोप्लाज्म सामग्री जारी करने वाली कोशिकाओं को लाल बिंदु में तीर। हरे रंग की कोशिकाओं में तीर जो सिर्फ अपनी साइटोप्लाज्म सामग्री खो चुके हैं। स्केल बार = 25 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 1
वीडियो 1: एम मैरिनम के साथ भारी लादेन एक मैक्रोफेज lytic सेल मौत से गुजरता है, चित्रा 5Aसे संबंधित । 9 मिन के लिए समय-चूक इमेजिंग (63x उद्देश्य) और 18 एस पर 3 डीपीएफ टीजी (coro1a: eGFP;lyzDsRed2) जेब्राफिश भ्रूण सेरूलन-फ्लोरोसेंट एम मैरिनमसे संक्रमित है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Figure 1
वीडियो 2: एक मैक्रोफेज यूवी विकिरण के बाद एपोप्टोसिस से गुजरता है, जो चित्रा 5Bसे संबंधित है। 3 डीपीएफ टीजी (एमएफएपी4:ईजीएफपी) जेब्राफिश भ्रूण के मिडब्रेन क्षेत्र के 6 एफपीएस पर 74 मिन की टाइम-लैप्स इमेजिंग (63x ऑब्जेक्टिव)। भ्रूण के मिडब्रेन क्षेत्र में एक GFP + कोशिका यूवी द्वारा किरणित है और समय चूक इमेजिंग के बाद। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Figure 1
वीडियो 3: एक मैक्रोफेज पूरकचित्रा 3A से संबंधित एम मैरिनमका प्रसार करताहै। 2 डीपीएफ टीजी (coro1a: eGFP;lyz:DsRed2) जेब्राफिश भ्रूण सेरूलन-फ्लोरोसेंट एम मैरिनमसे संक्रमित ट्रंक क्षेत्र के 3 एफपीएस पर 24 मिन की टाइम-लैप्स इमेजिंग (63x उद्देश्य) । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Figure 1
वीडियो 4: एक न्यूट्रोफिल स्पष्ट एम मैरिनम engorgement, पूरक चित्रा 3B से संबंधित बिना lytic सेल मौत से गुजरता है । समय चूक इमेजिंग (63x उद्देश्य) 7 मिन 30 एस के ट्रंक क्षेत्र के 3 एफपीएस पर 3 डीपीएफ टीजी (mpeg1: LRLG;lyz:eGFP) जेब्राफिश भ्रूण सेरूलन-फ्लोरोसेंट एम मैरिनमसे संक्रमित । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज मौत के दृश्य का वर्णन करता है। कोशिका झिल्ली की अखंडता जैसे कारकों के आधार पर, संक्रमण चालित कोशिका मृत्यु को एपोप्टोसिस और लिटिक सेल डेथ24,25में विभाजित किया जा सकता है। लिटिक सेल डेथ एपोप्टोसिस की तुलना में जीव के लिए अधिक तनावपूर्ण है, क्योंकि यह एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया 24,25को ट्रिगर करता है। उच्च स्थानिक-लौकिक संकल्प, उचित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स और मजबूत ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति की आवश्यकता के कारण वीवो में लिटिक सेल मृत्यु का अवलोकन मुश्किल है।

उचित माइक्रोइंजेक्शन के लिए कई महत्वपूर्ण चरणों की आवश्यकता होती है। इंजेक्शन से पहले सभी झुरमुटों को हटाने के लिए बैक्टीरियल स्टॉक को अच्छी तरह से सोनिकेट किया जाना चाहिए। हमने कम पिघलने वाले अगारोज की दो परतों के बीच एक ग्लास स्लाइड पर एम्बेड करके माइक्रोइंजेक्शन के लिए बढ़ते जेब्राफिश में सुधार किया। अगारोज की दूसरी परत लगाने के बाद, स्लाइड को एक बर्फ बॉक्स या ठंडी सतह पर स्थानांतरित कर दिया जाता है ताकि ठोसकरण में तेजी लाई जा सके और अगारोज के निर्जलीकरण को रोका जा सके। यदि भ्रूण को विभिन्न स्लाइडों पर चढ़ने की आवश्यकता है, तो अतिरिक्त अंडे के पानी को जोड़कर अगारोज की शीर्ष परत को नम रखना सुनिश्चित करें।

लाइव इमेजिंग के लिए, सेल डेथ के विवरण का निरीक्षण करने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑब्जेक्टिव लेंस की आवश्यकता होती है। यह आवश्यकता हमेशा कम काम करने की दूरी के साथ होती है, और इस प्रकार संक्रमण साइट को कवर स्लाइड के करीब स्थिति की आवश्यकता होती है। एक लंबी काम कर रहे दूरी के पानी लेंस गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए आदर्श है और उचित भ्रूण बढ़ते के लिए और अधिक कमरे के लिए अनुमति देगा । उच्च तीव्रता के साथ एक लेजर का उपयोग कर विस्तारित लाइव इमेजिंग ऊतक क्षति या भ्रूण की मौत का कारण होगा । इस प्रकार, फोटोब्लीचिंग और विषाक्तता से बचने के लिए लेजर की तीव्रता को यथासंभव कम रखना बहुत महत्वपूर्ण है। एक दृढ़ता से व्यक्त ट्रांसजेनिक कम तीव्रता के साथ एक लेजर का उपयोग कर अवलोकन की सुविधा कर सकते हैं। क्योंकि जीएफपी अभिव्यक्ति टीजी (mpeg1:eGFP)की तुलना में टीजी (coro1a:eGFP) में मजबूत है, हमने इस अध्ययन में टीजी (mpeg1:eGFP;lyz:DsRed2) के बजाय टीजी (coro1a: eGFP;lyz:DsRed2) का इस्तेमाल किया। कॉन्फोकल मशीन के करीब माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक मोबाइल वर्कस्टेशन स्थापित करना त्वरित प्रतिक्रियाओं को देखने के लिए सबसे अच्छा है। बर्फ पर कम पिघलने अगारोज हल्का करने के लिए ठोस समय में तेजी लाने के लिए भी इंजेक्शन और लाइव इमेजिंग के बीच समय को कम करने में मदद कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में, हम मैक्रोफेज व्यवहार को देखने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के दौरान न्यूट्रोफिल व्यवहार का विस्तृत अध्ययन भी जानकारीपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, कैसे न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर जाल (NETs) एक्स्ट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरियम को मारने में शामिल हैं काफी हद तक अपरिभाषित रहता है । इस प्रोटोकॉल में हिस्टोन प्रोटीन लेबलिंग ट्रांसजेनिक के साथ वर्णित इमेजिंग तकनीक का संयोजन करने से वीवो में एनईटीएस के दृश्य को काफी सुविधा मिलेगी।

वर्तमान में, ज़ेब्राफिश को जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक बहुत मजबूत प्रणाली के रूप में पहचाना जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके फागोसाइटोसिस और सेल डेथ के सांख्यिकीय डेटा प्राप्त किए जा सकते हैं। आज उपलब्ध शक्तिशाली जीन संपादन उपकरणों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल वीवो में मेजबान-रोगजनक बातचीत पर विभिन्न कारकों के प्रभाव को और समझने के लिए एक प्रभावी मंच प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम जेब्राफिश उपभेदों को साझा करने के लिए डॉ जिलॉन्ग वेन, डॉ स्टीफन ओहलर्स और डॉ डेविड टोबिन को एम मैरिनम संबंधित संसाधनों को साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं, यूपेंग वह आंकड़ा तैयार करने में सहायता के लिए । इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१८०१९७७) (B.Y.), शंघाई नगर स्वास्थ्य आयोग (२०१८YQ54) (B.Y.), शंघाई नौकायन कार्यक्रम (18YF1420400) (B.Y.), और तपेदिक की शंघाई कुंजी प्रयोगशाला के ओपन फंड (B.Y.) (B.Y.) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Tween-80 Sigma P1379
10 mL syringe Solarbio YA0552
10% OADC BD 211886
3-aminobenzoic acid Sigma E10521
5 μm filter Mille X SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin Sangon Biotech A600230
7H10 BD 262710
7H9 BD 262310
A glass bottom 35 mm dish In Vitro Scientific D35-10-0-N
Agarose Sangon Biotech A60015
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Enviromental Chamber Pecon temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader Eppendorf No.5242956003
Glass microscope slide Bioland Scientific LLC 7105P
Glycerol Sangon Biotech A100854
Incubator Keelrein PH-140(A)
M.marinum ATCC BAA-535
Microinjection needle World Precision Instruments IB100F-4
Microinjector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
msp12:cerulean Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red Sigma P3532
PTU Sigma P7629
Single concavity glass microscope slide Sail Brand 7103
Sonicator SCICNTZ JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600) Eppendorf AG 22331 Hamburg
Stereo Microscope OLYMPUS SZX10
Tg(mfap4:eGFP) Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) Ref.: PMID 27424497; 17477879

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References

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इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से जेब्राफिश भ्रूण में माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज लिटिक सेल डेथ का दृश्य
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Niu, L., Wang, C., Zhang, K., Kang, M., Liang, R., Zhang, X., Yan, B. Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e60698, doi:10.3791/60698 (2019).

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