癌细胞对自然杀手(NK)细胞介导的根除的逃避对癌症的启动和进展非常重要。在这里,我们提出了两个非放射性为基础的协议,以评估NK细胞介导的细胞毒性对肝肿瘤细胞。此外,还提出了第三个协议来分析NK细胞迁移。
自然杀手 (NK) 细胞是先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞群的子集,通过清除病原体感染、恶性和有压力的细胞作为第一道防线参与。NK细胞消灭癌细胞的能力使其成为对抗癌症的重要工具。几种新的基于免疫的疗法正在接受癌症治疗研究,这些疗法要么依赖于增强NK细胞活性,要么增加癌细胞对NK细胞介导的根除的敏感性。然而,为了有效地开发这些治疗方法,还需要具有成本效益的体外检测来监测NK细胞介导的细胞毒性和迁移。在这里,我们提出了两个体外协议,可以可靠和重复地监测NK细胞毒性对癌细胞(或其他目标细胞)的影响。这些协议基于非放射性,易于设置,可以放大以进行高通量筛查。我们还提出了一种基于流细胞学的协议,用于定量监控NK细胞迁移,也可以放大以进行高通量筛选。总之,这三个协议可用于监测NK细胞活动的关键方面,这些方面是细胞消除功能失调靶细胞所必需的。
人体识别非自身和消除异物的能力是人类战胜病原体和恶性肿瘤的关键。人体免疫反应在这一过程中起着最重要的作用2,3,4。根据关键特性和功能,人体免疫系统大致可分为两大功能组:适应性免疫系统和先天免疫系统。适应性免疫系统通常特定于给定的病原体,具有免疫记忆,因此,对同一病原体5、6、7、8、9的未来重新感染具有持久和反应能力。相反,先天免疫在目标根除方面更为广泛,而且相对不特定。因此,通常,先天免疫反应作为免疫防御的第一线10。自然杀手(NK)细胞属于先天免疫系统,占循环淋巴细胞总数的10-15%。NK细胞通过两个主要机制消灭靶细胞。首先,当结合到靶细胞表达活化配体后,NK细胞通过外细胞凋亡释放膜破坏蛋白穿孔蛋白和血清蛋白粒体,共同诱导靶细胞12、13、14、15细胞凋亡。此外,NK细胞表达FasL和肿瘤坏死因相关凋亡诱导配体(TRAIL)与靶细胞表达死亡受体(Fas/CD95)相互作用,导致卡巴西依赖性凋亡16。最重要的是,NK细胞不需要预刺激,如抗原表达,以消除病原体感染或恶性细胞;因此,他们通常处于随时可杀的状态17,18。为了抑制肿瘤的发展和进展,消灭癌细胞,NK细胞必须迁移到肿瘤部位,一旦在肿瘤微环境中,识别和攻击目标细胞。
过去,NK细胞效应器功能主要通过脱粒和细胞毒性测定19、20、21进行监测。NK细胞细胞毒性也可以测量51铬释放测定22,23,24,25。然而,这种测定有一些具体要求,包括需要伽玛计数器,并且是基于放射性的,这需要处理和处置放射性物质的培训,对使用者构成一定程度的风险。因此,开发并使用了几种新的非放射性测定基,用于研究NK细胞活性。
在这里,我们描述了两种这样的协议,彩色乳酸脱氢酶(LDH)测量基NK细胞介导细胞毒性测定和钙素乙酰甲基(AM)染色为基础的显微方法,以测量NK细胞介导癌细胞的消灭。这些测定不需要使用放射性同位素,是直接的,敏感的,可重复地识别调节NK细胞功能的因素。此外,由于如果不监测NK细胞迁移的变化,就无法充分评估NK细胞功能,我们还提出了一种基于流细胞学的定量方法来监测NK细胞迁移。
此处描述的细胞毒性和迁移方法可用于评估NK细胞对癌细胞的细胞毒性和恶性肿瘤中NK细胞介导的免疫逃逸机制,以及确定增强NK细胞活性/功能的治疗剂。该协议是简单,敏感,可重复的,和更好的替代品,以传统的放射性为基础的51铬释放测定。这些协议经过专门设计,易于适应大多数实验室,具有易于解释的直观的色度、显微或基于 FACS 的读出,使研究人员能够得出可靠的结论。所有这些都可针对基于高吞吐量筛选的方法进行扩展。虽然这些协议是在单个肝肿瘤细胞系的背景下提出的,但它们可以很容易地适应其他癌细胞类型和/或其他非癌症靶细胞。
虽然所有提出的方法都是健壮和可重复的,但不同批次的癌细胞和NK细胞可能会出现实验间变异。为了确保实验结果准确支持实验结论,建议使用生物三元数至少重复两次实验。
此方法的一个局限性是NK92MI细胞的生长速度可能很慢。因此,对于 50 个或更多样本的实验,应事先增加足够数量的 NK92MI,以防止延迟。此外,必须实现协议中描述的所有控件,以避免出现虚假和不可重复的结果。NK细胞毒性测定的另一个限制是,NK与癌细胞的比例以及孵育时间必须针对每个靶细胞进行优化。例如,我们测试了肝癌细胞系与NK细胞(1:5、1:10、1:20、1:40和1:80)的各种癌细胞比例,以及多个孵育时间(2、3、4、5和6小时)。根据我们的研究结果,我们观察到最一致的结果,癌细胞与NK细胞的1:10和1:20比率,孵育3小时。
此外,从实体肿瘤衍生的癌细胞将在培养板表面附着和生长,而NK细胞在悬浮物中生长。如果孵育时间超过3小时,建议使用超低附着96孔板,这将提高实验和生物复制之间的一致性和可重复性。还必须注意,NK细胞诱导细胞毒性测定也可以使用从外周血单核细胞(PBMC)分离的初级NK细胞进行。但是,此类实验存在几个限制。首先,这些实验不能像NK92MI细胞那样容易地进行缩放。其次,从PMBC分离的NK细胞细胞毒性活性的分批变异在结果的可重复性和解释方面可能存在问题。同样,文献中描述了其他人类NK细胞系,并可用于这些类型的实验,包括NKL细胞29;然而,与NK-92MI细胞不同,NKL细胞是IL-2依赖细胞,不能用于商业。
在考虑所描述的钙素AM实验时,重要的是要注意,在细胞死亡30后,钙素AM仍留在凋亡体中。因此,应仔细进行钙质 AM 染色的定量,因为它可能导致对 NK 细胞毒性的低估。
与NK细胞介导细胞毒性类似,细胞因子和其他化学吸引剂对NK细胞迁移的调节在NK细胞功能的调节中起着重要作用。此处描述的 NK 细胞迁移测定提供了一个简单的平台,用于在刺激(如化学素或化学吸引剂)的背景下评估 NK 细胞迁移。此测定可用于评估可促进或干扰 NK 细胞迁移的试剂 – 从而识别 NK 细胞迁移的增强剂和抑制剂。这种方法也可用于研究由于遗传/表观遗传改变(上升或降调控)或药物治疗引起的NK细胞迁移调节能力。
为了准确测量 NK 细胞迁移,应遵循几个关键步骤。对于使用条件介质的所有实验,从控制和处理条件中使用等效条件介质以获得准确的测量非常重要。孵化时间会因纯化化学吸引剂和条件培养物而不同。最后,跨孔迁移测定已经建立,被认为是评估NK细胞迁移的极好方法;然而,在测定中使用的同质单一培养缺乏组织甚至3D培养的复杂生理学,可能更准确地模仿肿瘤微环境。
因此,尽管本文提出的NK细胞毒性测定和NK迁移测定存在一些局限性,但这些测定适用于广泛的免疫学研究,从而为评估NK细胞提供了重要而可靠的方法。功能和NK细胞调节免疫治疗。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢国家卫生研究院的赠款:R01CA195077-01A1 (NW)、R01CA200919-01 (NW) 和 1R01 CA218008-01A1 (NW)。我们还确认国防部为 NW 提供资金 W81XWH1910480 和 W81XWH-18-1-0069。
Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |