Summary
Ontduiking van natuurlijke killer (NK) celgemedieerde uitroeiing door kankercellen is belangrijk voor kanker initiatie en progressie. Hier presenteren we twee niet-radioactiviteit-gebaseerde protocollen om NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit te evalueren in de richting van levertumorcellen. Daarnaast wordt een derde protocol gepresenteerd om NK-celmigratie te analyseren.
Abstract
Natuurlijke killer (NK) cellen zijn een subset van de cytotoxische lymfocyten populatie van het aangeboren immuunsysteem en deelnemen als een eerste verdedigingslinie door het opruimen van pathogene geïnfecteerde, kwaadaardige, en gestreste cellen. Het vermogen van NK-cellen om kankercellen uit te roeien maakt hen een belangrijk instrument in de strijd tegen kanker. Verschillende nieuwe immuun-gebaseerde therapieën worden onderzocht voor de behandeling van kanker die afhankelijk zijn van het verbeteren van NK celactiviteit of het verhogen van de gevoeligheid van kankercellen voor NK cel-gemedieerde uitroeiing. Echter, om deze therapeutische benaderingen effectief te ontwikkelen, zijn ook kosteneffectieve in vitro tests nodig om NK celgemedieerde cytotoxiciteit en migratie te monitoren. Hier presenteren we twee in vitro protocollen die betrouwbaar en reproducibly het effect van NK-cel cytotoxiciteit op kankercellen (of andere doelcellen) kunnen monitoren. Deze protocollen zijn niet-radioactiviteit-gebaseerd, eenvoudig op te zetten, en kan worden opgeschaald voor high-throughput screening. We presenteren ook een flow cytometrie-gebaseerd protocol om nk celmigratie kwantitatief te monitoren, die ook kan worden opgeschaald voor screening met hoge doorvoer. Gezamenlijk kunnen deze drie protocollen worden gebruikt om belangrijke aspecten van NK-celactiviteit te controleren die nodig zijn voor het vermogen van de cellen om disfunctionele doelcellen uit te roeien.
Introduction
Het vermogen van het menselijk lichaam om niet-zelf te identificeren en vreemde voorwerpen uit te roeien is de sleutel tot menselijke overleving tegen ziekteverwekkers en maligniteiten1. De menselijke immuunrespons speelt de belangrijkste rol in dit proces2,3,4. Op basis van belangrijke kenmerken en functies kan het menselijk immuunsysteem in grote lijnen worden ingedeeld in twee belangrijke functionele groepen: het adaptieve immuunsysteem en het aangeboren immuunsysteem. Het adaptieve immuunsysteem is meestal specifiek voor een bepaalde ziekteverwekker en heeft een immunologisch geheugen en reageert dus langdurig en reageert op toekomstige herinfectie door dezelfde ziekteverwekker5,6,7,8,9. De aangeboren immuniteit is daarentegen veel breder in de doeluitroeiing en relatief niet-specifiek. Daarom, typisch, de aangeboren immuunrespons dient als de eerste lijn van immunologische verdediging10. Natuurlijke killer (NK) cellen behoren tot het aangeboren immuunsysteem en vertegenwoordigen 10−15% van de totale circulerende lymfocyten11. NK-cellen roeien doelcellen uit via twee belangrijke mechanismen. Ten eerste, bij binding aan doelcellen die activerende liganden uitdrukken, geven NK-cellen het membraanverstorende eiwitperforine en serine protease granzymes vrij door exocytose, die gezamenlijk apoptose in doelcellen12,13,14,15. Daarnaast werken NK-cellen die FasL en tumornecrose-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL) uitdrukken, samen met doelcellen die doodsreceptoren uitdrukken (Fas/CD95), wat leidt tot caspase-afhankelijke apoptose16. Het belangrijkste is dat NK-cellen geen voorstimulatie nodig hebben, zoals antigeenpresentatie, om pathogene of kwaadaardige cellen uit te roeien; dus, ze zijn meestal in een ready-to-kill staat17,18. Om de ontwikkeling en progressie van tumoren te remmen en kankercellen uit te roeien, moeten NK-cellen migreren naar de tumorsite en, eenmaal in de tumormicroomgeving, de doelcellen identificeren en aanvallen.
In het verleden werden nk-celeffectorfuncties voornamelijk gecontroleerd door degranulatie en cytotoxiciteitstesten19,20,21. NK celcytotoxiciteit kan ook worden gemeten door 51chroomafgifte test22,23,24,25. Deze test heeft echter een aantal specifieke eisen, waaronder de noodzaak van een gammateller, en is gebaseerd op radioactiviteit, wat training vereist in het hanteren en verwijderen van radioactieve materialen en een risiconiveau voor de gebruiker inhoudt. Daarom zijn verschillende nieuwe niet-radioactiviteit-gebaseerde tests ontwikkeld en gebruikt om NK celactiviteit te bestuderen.
Hier beschrijven we twee van dergelijke protocollen, colorimetrische melkzuurdehydrogenase (LDH) meting op basis van NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit assay en calcein acetoxymethyl (AM) vlekken op basis microscopische methode om NK cel-gemedieerde kankercel uitroeiing te meten. Deze tests vereisen niet het gebruik van radio-isotopen, zijn eenvoudig, gevoelig, en reproducibly identificeren factoren die moduleren NK celfunctie. Bovendien, omdat NK celfunctie niet volledig kan worden geëvalueerd zonder veranderingen in NK celmigratie te monitoren, presenteren we ook een op flow cytometrie gebaseerde kwantitatieve methode om NK celmigratie te monitoren.
Protocol
1. Voorbereiding van Cultuur Medium voor NK Cellen en Levertumorcellen
- Gebruik menselijke natuurlijke killer cellen (bijvoorbeeld NK92MI) en menselijke lever kanker cellijn (bijvoorbeeld SK-HEP-1).
- Bereid NK celkweekmedium voor op NK92MI menselijke NK-cellen door de volgende componenten toe te voegen aan 500 mL van minimaal essentieel medium Eagle alpha zonder ribonucleosides en deoxyribonucleosides aan de aangegeven eindconcentraties: 0,02 mM foliumzuur (100 μL van 100 mM foliumzuur), 0,2 mM myoinositol (500 μL van 200 mM myoinositol), 0,1 mM β-mercaptoethanol (3,5 μL van 14,3 M β-mercaptoethanol), 2 mM L-glutamine (5 mL van 200 mM L-glutamine), 1% penicilline/streptomycine (5 mL van 100x penicilline/streptomycine), 12,5% foetaal bovine serum (FBS) en 12,5% paardenserum. Meng en filter steriliseren met behulp van een steriele filtratie-eenheid van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
- Bereid kweekmedium voor op hepatische tumorcellijn SK-HEP-1 door 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine toe te voegen aan het gemodificeerde Eagle medium (DMEM) van Dulbecco (DMEM) met 2 mM L-glutamine.
2. Colorimetrische LDH Measurement-based NK Cell-gemedieerde Cytotoxiciteit Assay
- Kweek SK-HEP-1 cellen tot 70−80% samenvloeiing in een 100 mm celkweek Petrischaal in 5% CO2 bij 37 °C in een CO2 incubator. Genereer een eencellige suspensie door eerst wascellen te wassen met 5 mL 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door incubatie met 1 mL van 0,25% trypsin-EDTA in 5% CO2 bij 37 °C in een CO2-incubator totdat een enkele celse suspensie wordt gegenereerd.
OPMERKING: NK celactiviteit kan worden veroorzaakt door gestreste kankercellen als gevolg van veranderingen in de expressie van NK celactiverende ligand in kankercellen. Daarom moeten gezonde en sub-confluent kankercellen worden gebruikt voor nauwkeurige resultaten. Het is ook belangrijk op te merken dat NK celreceptoren en liganden gevoelig kunnen zijn voor trypsinisatie26,27. Daarom moet het trypsinisatieprotocol zorgvuldig worden geoptimaliseerd en moet overmatige trypsinisatie worden vermeden. - Voeg na trypsinisatie 10 mL SK-HEP-1 kweekmedium toe en centrifugeer bij 160 x g gedurende 3 min in een steriele conische centrifugebuis van 15 mL. Was de celpellet met 5 mL 1x PBS en breg in 5 mL kweekmedium.
- Centrifugeer tegelijkertijd de NK92MI-cellen met 160 x g gedurende 3 min in een sterielcentrifugebuis van 15 mL. Was de celpellet met 5 mL 1x PBS en breg in 5 mL NK92MI celkweekmedium.
OPMERKING: NK92MI cellen worden geteeld in NK celkweek medium en op dezelfde manier verkregen zoals beschreven in stap 2.1. - Tel de SK-HEP-1 en NK92MI cellen met behulp van een hemocytometer of een beschikbare geautomatiseerde celteller.
- Voeg SK-HEP-1-cellen (doelcellen) (1 x 104/100 μL/put) en NK92MI-cellen (effectorcellen) (1 x 105/100 μL/put) toe in de verhouding van 1:10 doel:effector en zaad in drievoudputten in een 96-put.
- Incubeer de 96 putplaat bij 37 °C in een atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. Na incubatie, centrifugeplaat op 450 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
- Zonder de celpellet te verstoren, verzamel je 100 μL supernatant uit elke put en breng je over naar een put in een nieuwe 96 putplaat.
- Voeg 50 μL LDH-substraat toe, meng goed en incubeer de plaat gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Stop de reactie door 50 μL stopoplossing (50% dimethylformamide en 20% natriumdodecylsulfaat bij pH 4.7) toe te voegen. Meet meteen de absorptie van de plaat op 490 nm en 680 nm met behulp van een plaatlezer.
- Trek de absorptie bij 680 nm af van de absorptie bij 490 nm. Bereken het percentage (%) NK celcytotoxiciteit met behulp van de onderstaande formule.
waar LDH-experimentele (effector + doelcellen) de absorptie is van NK92MI-cellen en SK-HEP-1-cellen, is LDH-effectorcellen alleen al de absorptie van NK92MI-cellen, ldh-spontane is alleen de absorptie van SK-HEP-1-cellen en LDH-maximale is de absorptie van SK-HEP-1 cellen met lysisbuffer.
OPMERKING: Gebruik altijd de volgende besturingselementen: doelcellen alleen (SK-HEP-1), effectorcellen alleen (NK92MI), doelcellen met lysisbuffer als volledige lysiscontrole, doelcelmedium, NK92MI-medium, evenals doelcelmedium en NK92MI medium in een 1:1 verhouding.
3. Calcein AM Staining-gebaseerde microscopische methode voor het meten van NK Cell-gemedieerde Cytotoxiciteit
- Cultuur SK-HEP-1 cellen tot 70−80% samenvloeiing. Genereer een eencellige suspensie door eerst wascellen te wassen met 5 mL 1x PBS, gevolgd door incubatie met 1 mL van 0,25% trypsin-EDTA.
- Centrifugeer SK-HEP-1 cellen in een 1 mL steriele centrifugebuis op 160 x g gedurende 3 min. Resuspend de pellet in 3 mL serumvrije DMEM.
- Voeg 1,5 μL calcein AM-oplossing (10 mM) toe aan SK-HEP-1 cellen en broed gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Centrifuge calcein AM-gelabelde SK-HEP-1 cellen op 160 x g gedurende 3 min in een 15 mL steriele centrifugebuis.
- Was cellen twee keer met 5 mL van 1x PBS om overtollige calcein AM kleurstof te verwijderen.
- Centrifugeer tegelijkertijd NK92MI-cellen bij 160 x g gedurende 3 min in een sterielcentrifugebuis van 15 mL. Was de celpellet eenmaal met 5 mL 1x PBS en breg in 5 mL NK92MI celmedium.
- Tel calcein AM-gelabelde SK-HEP-1 cellen en NK92MI cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.
- Resuspend SK-HEP-1 cellen in kweekmedium op 1 x 105 cellen/mL en NK92MI cellen bij 1 x 106 cellen/mL in NK celmedium.
- Plaat calcein AM-gelabelde SK-HEP-1 cellen (doelcellen) (1 x 104/100 μL/put) met NK92MI cellen (effectorcellen) (1 x 105/100 μL/well) (1:10 target:effector ratio) per put in drievoudputten in een 96 plaat put goed.
- Incubeer de 96 putplaat bij 37 °C in een atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende 4 uur. Leg na incubatie fluorescentiebeelden vast van de met calcein AM gelabelde cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop bij 10x vergroting. Leg ten minste 10 verschillende velden van elke repliceren voor elke behandelingsaandoening.
- Selecteer willekeurig 10 afbeeldingen voor elke replicerende en telling calcein AM-positieve gelabelde doelcellen geïncubeerd met of zonder NK92MI-cellen. Bereken % cytotoxiciteit met behulp van de onderstaande formule.
OPMERKING: Gebruik als besturingselementen doelcellen zonder NK92MI-cellen en volledig lysed doelcellen als volledige lysiscontrole. Voor volledige lyse, incubeer de cellen in 0,5% Triton X-100 voor 1 h (20 μL van 5% Triton X-100 in 200 μL van cultuurmedia).
4. NK Celmigratie-test
- Kweek NK92MI-cellen en centrifugecellen met 160 x g gedurende 3 min in een sterielcentrifugebuis van 15 mL.
- Was de celpellet twee maal met 5 mL 1x PBS en breg de cellen opnieuw op in 3 mL serumvrij NK92MI celmedium. Tel NK92MI-cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.
- Plaat NK92MI-cellen (2,5 x 105 cellen/100 μL/put) in het bovenste compartiment van transputdoorlaatbare kamer (6,5 mm diameter insert en 5 μm porie grootte).
- Voeg in de onderste kamer 0,6 mL serumvrij medium toe dat materiaal bevat dat moet worden getest op NK-celchemoattractante eigenschappen (bijvoorbeeld geconditioneerd medium, chemokines, cytokinen).
OPMERKING: Gebruik bij de bereiding van geconditioneerd medium een medium met verminderd serum zonder toegevoegd serum om interferentie van serumeiwitten in de migratietest te elimineren. - Incubeer de 24 goed doorlatende kamers bij 37 °C gedurende 4 uur. Verzamel na 4 uur de niet-aanhangende en gemigreerde NK92MI-cellen uit de onderste kamer en breng ze over naar fluorescentiegeactiveerde celsorteerbuizen (FACS) voor verdere analyse.
OPMERKING: De tijd van de cultuur kan variëren afhankelijk van het type doelcellen, evenals de hoeveelheid en kinetiek van chemokines geproduceerd door de doelcellen. Daarom moet deze tijd empirisch worden bepaald voor elk celtype, chemokine en experiment. - Voeg vooraf bepaald aantal tellende kralen voor flow cytometrie in een volume van 50 μL toe aan elke buis met gemigreerde NK-cellen. Evalueer het volume van 300 μL/well celvering met behulp van een stroomcytometer die geautomatiseerd facs-gebaseerde celtelling kan automatiseren.
OPMERKING: Meng of vortex-meng de tellende kralen voor flow cytometrie grondig elke keer voor gebruik om ervoor te zorgen dat een constant aantal kralen wordt gebruikt om experimentele variabiliteit te minimaliseren. Reverse pipetteren wordt aanbevolen met graafkralen om de nauwkeurigheid te behouden. Gebruik alleen NK-cellen en het tellen van kralen voor flow cytometrie als FACS-analysecontroles. De auteurs raden het lezen van ten minste 10.000 kralen + NK cellen gecombineerd, een bedrag dat goed heeft gewerkt. Dit aantal kan echter variëren afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Daarom moet het gecombineerde aantal kralen + NK-cellen empirisch worden bepaald voor elk type experiment. Daarnaast is het belangrijk om experimenten uit te voeren met biologische drievouden om statistisch significante resultaten te bereiken en rekening te houden met variabiliteit tussen verschillende celtellingen. - Bereken het absolute aantal gemigreerde NK92MI-cellen met behulp van deze formule:
waar A = aantal cellen, B = aantal kralen, C = toegewezen kraaltelling van de partij (aantal tellende kralen voor stroomcytometrie/50 μL; in dit voorbeeld 49.500) en D = volume van monster (μL).
OPMERKING: Als 300 μL monstervolume (gemigreerde cellen) wordt gebruikt voor FACS-analyse met 50 μL tellende kralen voor stroomcytometrie, het absolute aantal gemigreerde cellen = 1.700 cellen /3.300 kraalgebeurtenissen x 49.500 kralen/300 μL = 84.975 cellen/μL. De berekening moet worden gecorrigeerd als het monster wordt verdund of als een ander volume facs-tellende kralen wordt gebruikt.
Representative Results
NK cel cytotoxiciteit testen en NK celmigratie test werden uitgevoerd met behulp van de SK-HEP-1 hepatische tumor cel lijn als een model systeem. Om nk-celcytotoxiciteit te meten met behulp van de LDH-test, werden SK-HEP-1-cellen die een niet-specifiek (NS) shRNA of shRNA uitdrukken dat gericht is op activerende transcriptiefactor 4(ATF4)geïncubeerd met NK92MI-cellen in een 96-putplaat voor 3 uur (figuur 1A). ATF4 is eerder aangetoond dat het NK celcytotoxiciteit reguleren door het activeren van ligand ULBP128te reguleren. LDH-activiteit in verband met NK-celgemedieerde doelceldoden werd colorimetrisch gemeten en procentcytotoxiciteit berekend met behulp van de formule beschreven in protocol 1. ATF4 knockdown aanzienlijk verminderd NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit in vergelijking met NK cellen uitdrukken NS shRNA (Figuur 1B-D). We hebben ook NK-celcytotoxiciteit gemeten met behulp van een calcein AM kleuring-gebaseerde test. Sk-HEP-1-cellen die NS shRNA of ATF4-targetingshRNAs uitdrukken, werden met calcein AM geëtiketteerd en geïncubeerd met NK92MI-cellen in 96 putplaten voor 4 uur, zoals geïllustreerd in figuur 2A. Na incubatie werden beelden van calcein AM-positieve cellen vastgelegd door fluorescentiemicroscopie met behulp van een FITC/GFP-filter. Cellen gedood door NK cellen worden niet gedetecteerd door deze aanpak, omdat ze niet langer behouden de calcein AM kleurstof. Zoals blijkt uit figuur 2B,C ,wordt het aantal calcein AM-positieve SK-HEP-1 cellen verminderd na co-cultuur met NK92MI-cellen in vergelijking met SK-HEP-1 cellen die zonder NK92MI-cellen worden geteeld. Echter, zoals verwacht, ATF4 knockdown via shRNA verminderd NK cel-gemedieerde doden van SK-HEP-1 cellen, waargenomen door een groter aantal calcein AM-positieve cellen (Figuur 2B,C). Daarom, zowel LDH-gebaseerde en calcein AM testen toonde consistente resultaten en bevestigde dat ATF4 knockdown vermindert NK-gemedieerde kankercel cytotoxiciteit. Een van deze testen is voldoende om NK celgemedieerde cytotoxiciteit te beoordelen; We raden echter aan om beide methoden te gebruiken om zowel de strengheid als het vertrouwen in de resultaten te vergroten.
We presenteren ook de resultaten van een 24 goed NK celmigratie test. NK92MI cellen werden opnieuw opgehangen in serum-vrije NK92MI medium in de bovenste kamer, en chemokine, CC motief, ligand 2 (CCL2) werd toegevoegd aan de onderste permeabele kamer. NK celmigratie werd in de tweede deel 3 (figuur 3A) genoemd. Het aantal gemigreerde NK92MI-cellen werd gekwantificeerd door het toevoegen van tellende kralen voor flow cytometrie en gevolgd door FACS-analyse. Zoals blijkt uit figuur 3B-C, was er een aanzienlijke toename van het aantal NK92MI-cellen dat was gemigreerd naar CCL2-bevattend medium in vergelijking met het controlemedium.
Figuur 1: Colorimetrische LDH-activiteit op basis van NK-celgemedieerde cytotoxiciteitstest. (A) Schematisch met de belangrijkste stappen van colorimetrische LDH activiteit op basis van NK cel cytotoxiciteit test. (B,C) ATF4 expressie werd geanalyseerd in SK-HEP-1 cellen uitdrukken van ofwel niet-specifieke (NS) shRNA of shRNAs gericht OP ATF4 door kwantitatieve RT-PCR en western blotting. (B) Relatieve ATF4 mRNA niveau wordt getoond na normalisatie tot ACTINB niveau in SK-HEP-1 cellen uitdrukken NS shRNA of ATF4 shRNAs. (C) ATF4- en ACTINB-eiwitgehalten in SK-HEP-1-cellen die NS shRNA of ATF4 shRNAs uitdrukken. (D) NK celgemedieerde cytotoxiciteit werd geanalyseerd in SK-HEP-1 cellen uitdrukken van NS shRNA of ATF4 shRNAs door de LDH-methode. Percentage (%) NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit wordt getoond. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM; ns, niet significant; **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Calcein AM vleken gebaseerde microscopische methode voor het meten van NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit. (A) Schematische beeltenis van de belangrijkste stappen van calcein AM vlekken op basis microscopische methode voor het meten van NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit. (B) NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit werd geanalyseerd in SK-HEP-1 cellen uitdrukken van NS shRNA of ATF4 shRNAs met behulp van de calcein AM methode. Representatieve beelden worden getoond. Schaalbalk = 200 μm. (C) Procent van de calcein AM-positieve cellen voor het experiment gepresenteerd in paneel B. **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: op FACS gebaseerde kwantitatieve NK-celmigratietest. (A) Schematisch met de belangrijkste stappen van FACS-gebaseerde NK celmigratie test. (B,C) NK celmigratie test werd uitgevoerd na het toevoegen van 50 ng van CCL2 aan de onderste kamer van de 24 put plaat. (B) Representatieve NK-celmigratiepuntpercelen voor controle of met CCL2 behandelde kweekmedium worden weergegeven. (C) NK celmigratiegegevens (gemiddelde ± SEM) worden gepresenteerd voor het experiment in paneel B. ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De hier beschreven cytotoxiciteit s-totoxiciteits- en migratiemethoden kunnen worden gebruikt om nk-celcytotoxiciteit te evalueren op kankercellen en NK-celgemedieerde immuunontduikingsmechanismen in kwaadaardige tumoren, en om therapeutische middelen te identificeren die de NK-celactiviteit/-functie zullen verbeteren. De protocollen zijn eenvoudig, gevoelig, reproduceerbaar, en de voorkeur alternatieven voor klassieke radioactiviteit op basis van 51chroom release test. De protocollen zijn speciaal ontworpen om gemakkelijk aanpasbaar te zijn voor gebruik in de meeste laboratoria, met eenvoudige colorimetrische, microscopische of FACS-gebaseerde uitlezingen die gemakkelijk te interpreteren zijn, waardoor onderzoekers betrouwbare conclusies kunnen trekken. Alle zijn schaalbaar voor high-throughput screening-gebaseerde benaderingen. Hoewel de protocollen worden gepresenteerd in de context van een enkele levertumorcellijn, kunnen ze gemakkelijk worden aangepast aan andere kankerceltypen en/of andere niet-kankercellen.
Terwijl alle gepresenteerde methoden robuust en reproduceerbaar zijn, kunnen interexperimentele varianten optreden met verschillende partijen kankercellen en NK-cellen. Om ervoor te zorgen dat de resultaten de conclusies van de experimenten nauwkeurig ondersteunen, is het raadzaam om het experiment ten minste twee keer te herhalen met biologische drievouden.
Een beperking van deze methode is dat het groeipercentage van NK92MI-cellen traag kan zijn. Daarom moet voor experimenten met 50 of meer monsters vooraf voldoende aantal NK92MI worden geteeld om vertragingen te voorkomen. Ook moeten alle in de protocollen beschreven controles worden uitgevoerd om onschijnbare en niet-reproduceerbare resultaten te voorkomen. Een andere beperking van de NK cytotoxiciteitstest is dat het NK naar kankercelverhouding, evenals de incubatietijd, voor elke doelcel geoptimaliseerd moet worden. Zo hebben we verschillende verhoudingen van kankercellen met NK-cellen (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 en 1:80) getest op de hepatische kankercellen, evenals meerdere incubatietijden (2, 3, 4, 5 en 6 uur). Op basis van onze resultaten zagen we de meest consistente resultaten met 1:10 en 1:20 ratio's van kankercellen tot NK cellen en incubatie voor 3 uur.
Daarnaast zullen kankercellen afkomstig van vaste tumoren hechten en groeien op het oppervlak van de kweekplaat, terwijl NK-cellen groeien in suspensie. Als de incubatietijd langer is dan 3 uur, is het raadzaam om ultralow attachment 96 putplaten te gebruiken, wat de consistentie en reproduceerbaarheid tussen experimenten en biologische repliceringen zal verbeteren. Het is ook belangrijk op te merken dat NK cel-geïnduceerde cytotoxiciteit testen kan ook worden uitgevoerd met behulp van primaire NK cellen geïsoleerd van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's). Er zijn echter verschillende beperkingen met dergelijke experimenten. Ten eerste kunnen deze experimenten niet zo gemakkelijk worden geschaald als met NK92MI-cellen. Ten tweede kan batch-to-batch variatie van cytotoxische activiteit van NK-cellen geïsoleerd van PMBC's problematisch zijn in termen van reproduceerbaarheid en interpretatie van de resultaten. Ook andere menselijke NK-cellijnen worden in de literatuur beschreven en kunnen in dit soort experimenten worden gebruikt, waaronder NKL-cellen29; In tegenstelling tot NK-92MI-cellen zijn NKL-cellen echter IL-2 afhankelijk en niet commercieel beschikbaar.
Bij het overwegen van de calcein AM experimenten beschreven, is het belangrijk op te merken dat calcein AM blijft in apoptotische lichamen na celdood30. Daarom moet de kwantificering van calcein AM-kleuring zorgvuldig worden uitgevoerd, omdat dit kan leiden tot een onderschatting van NK cytotoxiciteit.
Net als bij NK celgemedieerde cytotoxiciteit speelt modulatie van NK celmigratie door cytokinen en andere chemoattractants een belangrijke rol in de regulatie van nk-celfunctie. De NK celmigratietest die hier wordt beschreven, biedt een eenvoudig platform om NK celmigratie te evalueren in het kader van een prikkel zoals een chemokine of chemoattractant. Deze test kan worden gebruikt om agenten te evalueren die NK-celmigratie kunnen bevorderen of verstoren - dus het identificeren van versterkers en verdrukkers van NK-celmigratie. Deze methode kan ook nuttig zijn om de regelgevende capaciteit van het NK voor celmigratie te bestuderen als gevolg van een genetische/epigenetische wijziging (upregulatie of downregulatie) of als gevolg van medicamenteuze behandeling.
Om NK-celmigratie nauwkeurig te meten, zijn er weinig kritieke stappen die moeten worden gevolgd. Voor alle experimenten met geconditioneerd medium is het belangrijk dat gelijkwaardig geconditioneerd medium wordt gebruikt uit zowel controle- als behandelingsomstandigheden om nauwkeurige metingen te verkrijgen. De tijd van incubatie zal worden gevarieerd met gezuiverde chemoattractants en geconditioneerd medium. Ten slotte zijn transwell migratietesten goed ingeburgerd en beschouwd als een uitstekende methode om nk-celmigratie te beoordelen; echter, de homogene monoculturen gebruikt in de tests missen de complexe fysiologie van weefsels of zelfs 3D-culturen die nauwkeuriger zou kunnen nabootsen van de tumor micro-omgeving.
Hoewel er dus enkele beperkingen zijn aan de NK-celcytotoxiciteitstesten en NK-migratietests die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn deze testen van toepassing op een breed scala aan immunologische studies en bieden ze dus belangrijke en betrouwbare methoden om NK-cel te beoordelen functie en NK celmodulatorische immuuntherapeutica.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen dankbaar subsidies van de National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) en 1R01 CA218008-01A1 (NW). We erkennen ook dat het ministerie van Defensie W81XWH1910480 en W81XWH-18-1-0069 financiert voor NW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
| Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
| Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
| LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
| Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |
References
- Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
- Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
- Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
- Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
- Janeway, C. A. Jr The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
- Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
- Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
- Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
- Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
- Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer's kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
- Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
- Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869 (2018).
- Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
- Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
- Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
- Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590 (2016).
- Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
- Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
- Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339 (2007).
- Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
- Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474 (2015).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
