Summary
生物启发的脚手架由软光刻技术使用机械坚固和导电水凝胶制成。微型水凝胶提供定向心肌细胞对齐，从而形成量身定制的驱动方向。柔性微电极还集成到支架中，为自驱动心脏组织提供电气可控性。
Abstract
使用工程肌肉组织和生物材料模仿生物的生物机器人的生物灵感软机器人系统正在彻底改变当前的生物机器人模式，特别是在生物医学研究中。重建人工生命般的驱动动力学对于软机器人系统至关重要。然而，对驱动行为的精确控制和调谐仍然是现代软机器人系统的主要挑战之一。此方法描述了一种低成本、高度可扩展且易于使用的程序，用于制造具有栩栩如生的运动、通过微模式刺痛的心肌组织收缩激活和控制的电动可控制软机器人射线状水凝胶支架。使用软光刻方法，可以成功地将多个组件集成到软机器人系统中，包括微型水凝胶基支架与碳纳米管 （CNT） 嵌入式明胶甲酰胺 （CNT-GelMA），聚（乙二醇）二甲酸酯（PEGDA）、柔性金（Au）微电极和心肌组织。特别是，水凝胶对齐和微模式设计模仿刺痛射线的肌肉和软骨结构。导电的CNT-GelMA水凝胶作为细胞支架，改善心肌细胞的成熟和收缩行为，而机械坚固的PEGDA水凝胶为整个软机器人提供结构软骨样的支持。为了克服金属基微电极的坚硬和脆性，我们设计了一种具有高灵活性的蛇形图案，可以避免阻碍心肌细胞的跳动动力学。结合的柔性Au微电极为软机器人提供电刺激，使控制心脏组织的收缩行为更加容易。
Introduction
现代最先进的软机器人可以模仿许多生物的层次结构和肌肉动力学，如水母1，2，刺射线2，章鱼3，细菌4和精子5。模拟自然系统的动力学和结构，在能量和结构效率方面提供更高的性能6。这与自然组织的柔软性（例如，皮肤或肌肉组织与杨的模量在104×109 Pa之间）的内在相关，与标准工程执行器相比，这允许更高的自由度和优越的变形和适应性（例如，Young 的模量通常在 109+ 1012 Pa 之间）6。心脏肌肉为基础的软执行器，特别是，表现出卓越的能源效率，由于其自我驱动，以及他们的自动修复和再生的潜力相比，机械为基础的机器人系统7。然而，软机器人的制造具有挑战性，因为需要将具有不同物理、生物和机械特性的不同组件集成到一个系统中。例如，工程合成系统需要与活生物系统集成，不仅为他们提供结构支持，而且影响和调节其驱动行为。此外，许多微加工方法需要苛刻/细胞毒性工艺和化学品，这些工艺和化学品会降低任何活部件的生存能力和功能。因此，有必要采用新的方法来增强软机器人的功能，并控制和调节它们的行为。
为了成功地将活部件与良好的生存能力集成，水凝胶基架是创建软机器人机身的极好材料。水凝胶的物理和机械特性可以很容易地调整，为生物成分，如肌肉组织8，9创建微环境。此外，它可以很容易地采用各种微加工技术，从而创建具有高保真度1、2、10的分层结构。柔性电子设备可以融入软机器人，通过电刺激控制其行为。例如，利用光技术设计电原细胞（例如心肌细胞），这种细胞具有光依赖性电生理活化，已用于开发一种基于二甲基硅氧烷（PDMS）的软机器人刺射线，该射线在光线引导下能够重现鱼在体外2的不可调节运动。虽然光遗传学技术表现出了优异的可控性，但所展示的工作采用电刺激，这是一种传统的、传统的模拟方法。这是因为通过柔性微电极进行电刺激与光遗传学技术相比是简单易行的，光遗传学技术需要大量的开发过程11。使用柔性电子设备可以允许长期刺激和标准/简单的制造过程，以及可调的生物相容性和物理和机械特性12，13。
在这里，我们提出了一种创新的方法，以制造生物灵感的软机器人，通过跳动工程心肌组织来驱动，并通过嵌入式柔性Au微电极通过电刺激控制。软机器人设计模仿刺射线的肌肉和软骨结构。与其他游泳物种相比，刺射线是一种相对容易模仿结构和运动的有机体。通过在导电水凝胶微模式上播种心肌细胞，在体外重建肌肉。如前所述，在GelMA水凝胶中加入CNT等导电纳米颗粒不仅改善了心脏组织的电耦合，而且诱导了优良的体外组织架构和排列8、9。然后，使用机械坚固的 PEGDA 水凝胶模式模拟软骨接头，该模式充当整个系统的机械坚固基板。具有蛇形图案的柔性 Au 微电极嵌入 PEGDA 模式，以局部和电刺激心脏组织。
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Protocol
这项研究是严格按照国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》中的建议进行的。该协议得到了布里格姆和妇女医院动物护理和使用机构委员会（IACUC）的批准。
1. 凝胶合成
- 在 50°C 下使用磁性搅拌器将 10 克明胶溶解在 100 mL 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中。
- 缓慢加入8 mL的甲基丙烯酸氢化物，同时在50°C搅拌明胶预聚物溶液2小时。在50°C下用预热的DPBS稀释反应明胶溶液。
- 将稀释溶液转移到透析膜中（分子量截止 = 12-14 kDa），并将其放入去离子化 （DI） 水中。在40°C下进行透析约1周。
- 使用无菌过滤器过滤透析GelMA前聚合物溶液（孔径 = 0.22 μm），并将溶液的25或30 mL转移到50 mL管中，并在-80°C下储存2天。
- 使用冷冻干燥机冷冻干燥冷冻凝胶前聚合物溶液5天。
2. 制备聚（乙二醇）丙烯酸酯（PEGDA）预聚合物溶液
- 在DPBS的1 mL中溶解PEGDA（MW = 1，000）的200mg（总溶液的200%）（总溶液的0.5%）2-羟基-4-（2-氢氧乙烷）2-甲基丙酮（光开射器，PI）。
- 在80°C孵育预聚合物溶液5分钟。
3. 制备凝胶涂层CNT分散库存溶液
- 在 4 mL DPBS 中溶解 80 mg GelMA（用作生物活性剂），然后将 20 mg 的 COOH 功能化多壁碳纳米管 （MWCNTs） 加入 GelMA 预聚合物溶液中。
- 将MWCNT载载GelMA预聚合物溶液用于1小时（0.66Hz，100瓦）。
注：在声波过程中，溶液必须浸入水浴室，温度为+15°C，以防止溶剂因温度升高而蒸发。
4. 制备含有5%GelMA预聚合物溶液的1mg/mL CNT
- 在80°C下在0.8 mL的DPBS中溶解50mg的GelMA和5mg（总溶液的0.5%）10分钟。
- 添加 0.2 mL 的制备 CNT 库存解决方案（步骤 3）。涡旋，在80°C孵育溶液10分钟。
5. 制备3-（三氧西基）丙烯酰（TMSPMA）涂层玻璃玻片
- 用纯乙醇清洗玻璃玻片（厚度 = 1 毫米，尺寸 = 5.08 厘米 x 7.62 厘米）。
- 将清洁的幻灯片垂直堆叠在 250 mL 烧杯中，并使用注射器将 3 mL 的 TMSPMA 涂在上面。用铝箔盖住烧杯，防止TMSPMA蒸发。
- 在 80°C 烤箱中孵育幻灯片 1 天。
- 将涂覆的玻璃玻片浸入纯乙醇中，然后干燥，将其清洗。
- 在室温 （RT） 下将包裹在铝箔中的涂层玻璃玻片储存起来。
注：尽量尽量减少接触 TMSPMA 涂层玻璃玻片的表面。
6. 柔性Au微电极的制造
- 使用计算机辅助设计设计阴影蒙版 （补充文件 3.
- 制作并购买阴影蒙版。
- 用丙酮清洗玻璃滑块（厚度 = 1 mm，尺寸 = 3 厘米 x 4 厘米），用压缩空气枪擦干。
- 使用双面胶带将阴影掩膜连接到玻璃基板，然后将它们放入 E-梁蒸发器中，直到腔室压力达到至少10-6 Torr。
注：两块胶带被手动放置在支架上，距离足够短，足以承载玻璃，足够大，足以容纳整个图案。此步骤大约需要 45-60 分钟。 - 通过 E-beam 蒸发器沉积 200 nm 厚的 Au 层（例如，使用大成 EE-4，真空 = 10-6 Torr，功率 = 2.6%，速率 = 2 °/s），并使用切片锯机切割制造微电极（电极尺寸 = 7.38 mm x 8.9 mm x 200 nm）。
7. 制造Au微电极集成微模式多层水凝胶脚手架
注：此过程的结果是，在底层有一个微图案的PEGDA水凝胶，一个微图案的CNT-GelMA水凝胶在顶部，Au微电极位于两层之间。这种配置可确保电极具有更好的灵活性，并限制断裂的风险。
- 设计和制作两个光掩膜，以创建微图案PEGDA（第1个光掩膜）和CNT-GelMA水凝胶（第2个光掩膜）层。请参阅补充文件 2_3。设计可以使用CAD软件完成。
注：参见图2B，E。 - 将 50 μm 垫片堆叠在 TMSPMA 涂层玻璃上，将一层商业隐形胶带（厚度：50 μm）制成。将 15 μL 的 20% PEGDA 预聚合物溶液倒在 TMSPMA 涂层玻璃上，然后用金色微电极覆盖。将玻璃滑动（微图案 PEGDA）的第一个光掩膜（微图案 PEGDA）放在金色微电极顶部，并将整个结构暴露在紫外线下（200 W 汞蒸气短弧灯，带 320–390 nm 过滤器），强度为 800 mW，距离为 8 厘米，为 110 s。
注：参见图1A。 - 在 5-10 分钟后，添加 DPBS 以环绕玻璃滑块，将微图案 PEGDA 水凝胶与 Au 微电极一起小心地从未涂布的玻璃基板上分离，以获得具有具有 Micro 型 PEGDA 水凝胶的玻璃滑块。微 电极。
注：参见图1B。由于 TMSPMA 涂层，该结构从未涂布的玻璃基板转移到 TMSPMA 涂层基板。小心拆卸，因为Au微电极在此步骤中很容易断裂（图3）。 - 将两层商业透明胶带（厚度 = 50 μm）堆叠在培养皿底部，将 100 μm 垫垫制成。在垫片之间沉积一滴 20 μL CNT-GelMA 预聚合物溶液，然后翻转 7.3 中获得的玻璃滑块，然后用胶带将其固定在盘子上。
- 将设备倒置旋转，并将第 2个照片蒙版放在玻璃幻灯片的顶部。在800 mW的强度和 8 厘米距离下以 200 s 的紫外线照射。
注：参见图1C。对齐第二个蒙版非常重要。 - 用DPBS和包括10%胎儿牛血清（FBS）的细胞培养基液清洗获得的脚手架。
- 在播种细胞之前，将它们留在37°C培养箱中过夜。
8. 新生儿大鼠心肌细胞隔离与培养
- 根据该研究所动物护理委员会8批准的协议，将心脏从2天大的斯普拉格-道利大鼠中分离出。
- 在HBSS的冷室中，将心脏碎片放在摇摇器上过夜（约16小时），在0.05%胰蛋白酶中，没有EDTA。
- 用移液器枪收集心脏碎片，尽量减少胰蛋白酶的量，然后将它们放入50 mL管中，管中装有10 mL的温心介质（10%FBS，1%P/S，1%L-谷氨酰胺）。
- 在 37°C 水浴中缓慢旋转（约 60 rpm），7 分钟。用 10 mL 移液器小心地从管中取出介质，并将心脏片留在管中。
- 在 HBSS 中加入 7 mL 的 0.1% 胶原酶 2 型，在 37°C 水浴中旋转 10 分钟。
- 与 10 mL 移液器轻轻混合 10 倍，以扰乱心脏碎片。用 1 mL 移液器从管中取出介质。
- 在 HBSS 中加入 10 mL 的 0.1% 胶原酶类型 2，在 37°C 水浴中快速旋转（±120~180 rpm），10分钟，然后检查心脏片是否溶解。
- 与 10 mL 移液器混合，然后用 1 mL 移液器重复以折断最后一块心片。
- 一旦溶液看起来均匀，将70μm细胞过滤器放在新的50 mL管上，在滤网上一次移液1 mL。
- 在37°C下，在180 x g下将心脏细胞溶液离心5分钟。
注：如果仍有一些心脏片或粘液未溶解，请再次重复步骤8.7~8.9。 - 小心地取出细胞颗粒上方的所有液体，并在2 mL的心脏介质中重新悬浮细胞。
- 从管壁上小心地加入2 mL的心脏介质，以重新悬浮细胞，避免破裂。
- 将悬浮细胞加入T175瓶中，加热心脏介质一滴一滴。将烧瓶放入 37°C 培养箱中 1 小时，使心脏成纤维细胞附着在底部。
注：在此预镀步骤中，心脏成纤维细胞将附着在烧瓶上，而心肌细胞则保持在悬浮介质中。 - 从装有心肌细胞的烧瓶中收集介质，并将其放入 50 mL 管中。
- 计数细胞，然后在260 x g下在37°C下离心5分钟。
- 在步骤 7 中，将细胞重新悬浮在制造软机器人顶部并播种。将心肌细胞以1.95×106细胞/mL的浓度将特定体积的心脏介质滴到设备的整个表面上。
- 在37°C下孵育样品，在播种后的第一天和第二天用2%FBS和1%L谷氨酰胺用5mL细胞培养基改变培养基。每次介质颜色移动时更改介质。
9. 用于对齐分析的细胞染色
- 在 RT 下取下介质并用 DPBS 清洗 5 分钟。
- 在RT处使用4%甲醛（PFA）修复细胞20分钟。然后在 RT 用 DPBS 清洗 5 分钟。
- 在RT处用0.1%三吨在DPBS中孵育细胞1小时，用PBS在RT处清洗3次5分钟。
- 在RT的DPBS中用10%山羊血清孵育细胞1小时。
- 在DPBS中的10%山羊血清中孵育细胞，在4°C为+14~16小时。
- 在RT处用DPBS洗涤3倍5分钟，在RT的DPBS中用10%山羊血清中的第二次抗体孵育细胞1小时。
- 在 RT 用 DPBS 洗涤 3 分钟，然后在 DI 水中（1：1，000）中用 4'，6-二甲苯-2-苯胺醇 （DAPI） 对反染色细胞 10 分钟，在 RT. 洗涤 3x 与 DPBS 在 RT 上 5 分钟。
- 使用倒置激光扫描共聚焦显微镜拍摄荧光图像。
10. 执行器测试和行为评估
- 软机器人上心肌细胞的自发跳动
- 在 37°C 下孵育生物激励执行器 5 天，并在第 1 天和第 2 天以及必要时（即介质变为黄色时）刷新介质。使用倒置光学显微镜每天拍摄图像（5 倍和/或 10 倍）。在收缩活动开始时（通常在第 3 天左右），使用显微镜实时窗口上的视频捕获软件以每秒 20 帧（5 倍和/或 10 倍）的速度记录细胞运动。
- 在第 5 天，用盖滑从边缘轻轻提起来分离膜。
注：如果细胞表现出强烈的跳动行为，膜将自行分离，由于收缩的机械作用。
- 批量电信号刺激
- 使用 3 厘米间距的 PDMS 作为支架，在充满心脏介质的 6 厘米培养皿中用铂 （Pt） 线固定两个碳棒电极。然后小心地将软机器人转移到培养皿中。
- 应用脉冲宽度为 50 ms、直流偏移值 0 V 且峰值电压振幅介于 0.5 和 6 V 之间的方波形。频率在 0.5、1.0 和 2.0 Hz 之间变化，占空比分别为 2.5%、5% 和 10%。使用市售摄像机记录宏观收缩。
- 使用Au微电极的电刺激
- 制造Au微电极集成多层水凝胶支架后，使用银浆将两根铜线连接到Au电极外部方形端口。
- 用一层薄薄的PDMS在80°C预固化5分钟覆盖银膏。然后将样品置于45°C的热板上5小时，以完全交联PDMS。
- 播种心肌细胞后，在具有直流偏移值 1 V、峰值电压振幅介于 1.5 和 5 V 以及频率分别为 0.5、1.0 和 2.0 Hz 的铜线上应用方波电刺激。
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Representative Results
开发Au微电极结合生物启发式软机器人的步骤的流程图
软机器人设计的目的是构建一个能够以最小的复杂性推动游泳运动的膜。结构必须能够持续反复的强柔韧性（约1赫兹），并能够保持其形状，同时实现强大的跳动。通过使用光掩膜选择性地将聚合物进行光交联，我们构建了由微图案 PEGDA 水凝胶层、柔性 Au 微电极层和微图案 CNT_GelMA 水凝胶层组成的分层结构支架。图1显示了协议中描述的软机器人制造过程的示意图和实际图像。简单地说，生物启发软机器人有三个主要的制造步骤，嵌入Au微电极：首先，利用第一个光掩膜（图1A，B），通过紫外线交联获得一种微图案PEGDA水凝胶，并结合Au微电极。其次，由Au微电极、微图案CNT-GelMA和PEGDA水凝胶组成的多层结构，由第二光掩膜（图1C）用紫外线交联制成。最后，将心肌细胞植入了构建的三层结构上，为软机器人提供驱动（图1D）。
软机器人的不同设计
关于软机器人的形状，我们一开始设计了两种生物启发的形状，通过生物模拟两种不同水生动物的图案。第一个设计灵感来自于一只甲鱼的外观（图2A，B，C），因为海星可以简化为二维（2D）对象，具有坚硬的骨干，并且有一个灵活的部分，连接在一起在水中移动，尽量减少所需的运动。第二个器件基于一个曼塔射线的形状（图2D，E，F），它很容易在2D设备中重现。曼塔射线能用独特的动作快速游泳。我们使用基本几何形状绘制了 manta 射线草图，在光掩码步骤中，具有降低复杂性的基本几何形状可进行交联。电极沿结构的中线放置，采用波浪图案设计，可实现更好的电脉冲分布和灵活性（图2D）。为了开发生物启发式软机器人，本研究选择了受射线启发的形状，并进行了全面测试。
在CNT-GelMA和PEGDA水凝胶之间嵌入Au微电极的挑战
在制造机器人体内封装200nm厚的Au微电极，通过提供电刺激，可以局部控制结构。虽然直接在电极表面上的CNT-GelMA和PEGDA水凝胶图案的紫外线交联阻碍了电极的分层，但它保证了电极成功融入软机器人。然而，在PEGDA水凝胶上转移Au电极后，由于PEGDA水凝胶膨胀（图3A、B、C），具有矩形形状和宽宽（>1 mm）的Au电极在制造过程中很容易断裂。因此，我们需要确保微电极成功地转移到PEGDA水凝胶，并嵌入在CNT-GelMA和PEGDA水凝胶之间，同时完好无损。因此，采用软光刻设计并制造具有蛇形图案（厚度 = 200 μm）的Au微电极。拍摄了不同放大倍数和阶段的相对比显微镜图像，以检查微图案PEGDA水凝胶运输后电极上的断裂迹象（图3D、E、F）。
水凝胶微模式间距的优化
心肌细胞种子CNT-GelMA层根据模式距离表现出不同的跳动行为（图4A，B）。这可能是由于细胞附着在膜表面的不同方式，取决于线的距离。在 50 μm 距离的情况下，细胞太包装，没有所需的组织配置。机翼上部分相互连接且未对齐的细胞并非同时对游泳运动作出贡献。因此，心肌细胞产生的力不足以弯曲翅膀。在150μm的距离，细胞非常对齐。然而，它们主要坐在凹槽中，上层细胞之间几乎没有互连，导致殴打较弱。在75μm距离处，细胞在底部对齐，在上部相互连接，显示最强的跳动。此外，为了防止软机器人在心肌细胞的动态跳动过程中不可逆转地完全滚动，我们将PEGDA水凝胶支撑层的图案间距优化为300μm（图4C）。最后，经过这个参数化过程，我们决定更加关注具有300μm距离PEGDA图案和75μm距离CNT-GelMA图案的曼塔射线状膜。微图案PEGDA和CNT-GelMA图案上的心脏组织也通过相位/对比度图像和F-actin/DAPI共聚焦图像显示（图4B）。
微模式PEGDA和CNT-GelMA水凝胶上心脏组织运动分析
为了分析执行器的运动，我们使用碳棒电极应用电场时，拍摄了没有 Au 微电极的膜视频。图 4D显示了从收缩记录中获取的一些帧。清晰可见的是，曼塔射线形执行器正像预期的那样弯曲机翼。尾巴通过拉直一点来平衡结构，翅膀在中间强烈地关闭。由于未对齐的微图案CNT-GelMA和PEGDA水凝胶（图4E和视频1），一些膜在收缩时出现旋转运动。在这种情况下，与前一个运动相比，运动的定义较少，但收缩仍然足够强大，以允许旋转运动的驱动。完成整个圆的总时间约为 45 s。
多层软机器人心肌细胞的表征和电刺激对跳动行为的控制
在生物激发的机器人系统上播种和成熟心肌细胞（图5A）后，通过F-actin/DAPI和囊肿/康奈辛-43/DAPI免疫染色观察到心脏组织沿CNT-GelMA模式的方向排列（图5B-E）。共聚焦荧光图像显示，CNT_GelMA水凝胶模式（图5B，C）上的心肌细胞具有长长和对齐。在图案区域上观察到了部分单轴沙科雷对齐和互连的沙科雷结构（图5D）。还观察到位于微电极正上方的心脏组织的紧密互联的沙科梅结构（图5E）。为了评估生物启发式软机器人，我们用两种方法检测其功能：首先，通过碳棒电极对软机器人应用双相电脉冲，用于人工调谐和控制跳动行为。其次，我们将两根铜线连接到Au电极的最外端，通过整个机器人结构产生电信号。当我们通过连接到Au电极的外部碳电极或铜线施加电刺激时，激发阈值电压在不同的频率（0.5、1.0 和 2.0 Hz，图 5F）时是不同的。
图1：图解图和实际图像，描绘了生物启发多层软机器人通过柔性Au微电极的集成，通过电信号电控的制造过程。（A） 使用第 1个照片掩膜对 PEGDA 水凝胶的图案和交联。（B） 微图案PEGDA水凝胶，在步骤（A） 后获得的 TMSPMA 玻璃上封装的 Au 微电极。（C） 使用第二张光掩膜将 CNT-GelMA 图案水凝胶交联。（D） 心肌细胞在多层结构上的种子。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：生物启发式软机器人的设计。（A） 真正的海星图片和三维（3D）CAD模型的不同视图，指出组件和条纹。（B） CNT-GelMA 图案、PEGDA 图案和海星形状的 Au 微电极的掩膜设计。（C） 海星形状的微图案CNT-GelMA和PEGDA图案的光学显微镜图像。（D） 真实曼塔射线图片和 3D CAD 模型的不同视图指出组件。（E） CNT-GelMA 图案、PEGDA 图案和 A 微电极的掩膜设计，用于曼塔射线形状，经 Su Ryon 等人许可改编。（F） 微图案CNT-GelMA和PEGDA图案的光学显微镜图像为曼塔射线形状。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：柔性Au微电极的设计。（A） 用矩形形状和宽宽制作的Au电极的照片。（B和C） Au 电极的光学显微镜图像，这些电极未能传输到 PEGDA 水凝胶。（D） 在微图案PEGDA水凝胶上转移之前和之后的波浪Au微电极.请点击此处查看此图的较大版本。
图4：微模式PEGDA和CNT_GelMA水凝胶的优化和软机器人的运动分析。（A） CNT_GelMA 水凝胶图案上的心肌细胞的光学图像，间距为50、75和150μm。（B） PEGDA-和CNT-GelMA水凝胶图案上的心肌细胞的光学图像和F-actin/DAPI染色，间距分别为300μm和75μm。（C） 具有或没有具有 300 μm 间距的微图案 PEGDA 水凝胶的生物启发结构的滚动形态。（D） 应用电动刺激时录制的独立生物启发式软机器人视频的帧。（E） 从记录软机器人旋转运动的视频中获取的四个不同帧的拼贴。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：Au微电极结合软机器人上的心肌细胞特征，通过电刺激控制跳动行为。（A） 在PEGDA和CNT-GelMA水凝胶之间封装的Au微电极上培养的心肌细胞的光学显微镜图像。（B） F-actin/DAPI 荧光图像，显示 CNT_GelMA 水凝胶微模式上细长和对齐的心肌细胞。（C-E）共聚焦荧光图像显示在制造的软机器人上，在人造软机器人上显示沙康线对齐和互连的沙康木结构：（C和D）在CNT_GelMA水凝胶微模式上培养的心肌细胞，以及（E）靠近Au微电极。（F） 通过碳棒电极和嵌入式 Au 微电极施加电刺激时，需要不同频率（0.5、1.0 和 2.0 Hz）的激励阈值电压。请点击此处查看此图的较大版本。
视频 1.请点击此处查看此视频（右键单击下载）。
补充文件1。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
补充文件2。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
补充文件3.请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
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Discussion
使用这种方法，我们能够成功地制造出一个类似巴比的鱼类生物启发软机器人，在多层结构支架上集成了自激活的心脏组织，由嵌入式Au微电极控制。由于由PEGDA和CNT_GelMA水凝胶制成的两种截然不同的微模式水凝胶层，生物激发的脚手架表现出良好的机械稳定性和理想的细胞对齐和成熟。PEGDA图案层作为骨骼结构在刺射线中的软骨关节，为整个机器人身体提供机械支撑。具体来说，它在心脏组织收缩和放松期间保持机械稳定性，同时允许有效跳动，因为它能够在收缩后释放膜张力。此外，微电极（200nm）的纳米厚度及其蛇形图案使其足够灵活，不会阻碍或影响心脏组织的收缩（图2）。为了在水凝胶表面轻松转移微电极而不造成任何破损，Au 微电极在玻璃上制造，没有任何粘附层，如钛，通常用于在玻璃和 Au 之间产生强附着力。同时，CNT-GelMA层，为心肌细胞附着和对准提供支持，其图案垂直于PEGDA水凝胶图案的方向（图3）。成熟后，顶层的心肌细胞为整个支架提供自我驱动。通过结合Au柔性微电极的局部电刺激，我们可以调节机器人的跳动频率，而不会伤害其心脏组织。尽管这种制造方法易于学习和复制，但在制造过程中仍有一些技术上具有挑战性的步骤需要强调。
软生物机器人的制造有五个关键步骤：1） 凝胶水凝胶中 CNT 的正确分散;2） 在TMSPMA涂层玻璃上成功将PEGDA和CNT-GelMA水凝胶的紫外线交联;3） Au微电极从支撑玻璃转移到水凝胶图案;4） 将执行器从支撑玻璃滑块上正确分离;5） 在Au微电极与用于连接到波形发生器的导线之间建立良好的电气接触。
与原始GelMA基质相比，CNTs的加入为GelMA水凝胶提供了增强的机械性能和先进的电生理功能，有助于提高自发同步跳动率和更低的心肌组织9的激发阈值。CNT细胞毒性问题不仅通过使用表面功能化的CNT，而且通过结合GelMA水凝胶基质中的纳米结构，浓度高达5.0mg/mL9。事实上，GelMA水凝胶的疏水段与CNTs侧壁之间的相互作用导致在水凝胶多孔基质14中封装CNT。这不仅防止它们形成潜在的有毒骨料，而且还提高了盐水溶液（例如DPBS或细胞培养基）中的CNT溶解度。
为了成功地将PEGDA和CNT-GelMA水凝胶之间的Au微电极合并，需要特别注意每个单层的紫外线交联。具体来说，为了在PEGDA水凝胶层上转移Au微电极，有必要确保水凝胶溶液覆盖整个电极区域，以避免在剥离步骤期间电极破裂。因此，TMSPMA 玻璃涂层的质量是保证 PEGDA 水凝胶在玻璃基板上的最佳附着力，从而防止微电极在转移步骤过程中的分离。
该方法的另一个关键步骤是将生物执行器从支撑玻璃滑块上分离。当心脏组织的自发跳动是同步的，并且足够强，能够自然地从玻璃滑道上剥离支撑水凝胶时，这个问题很容易解决。因此，如前所报告的那样，优化水凝胶模式以诱导有利于组织功能性同步心脏组织的特定细胞对齐至关重要。
要将微电极电连接到波形发生器，必须在微电极上建立电气连接。在这一步骤中，必须完全封装用于将微电极接触铜线的银胶，以避免细胞毒性影响。这是通过在电气触点顶部沉积一小滴 PDMS 来实现的。
该方法不仅可以克服现有光遗传学技术的限制，如复杂的制造工艺、长的制造时间和光遗传学工具的潜在毒性，而且可以显著提高基于细胞的性能。执行器，使用低成本和易于操作的技术实现实时刺激。尽管我们目前的生物激励执行器的设计无法产生向前推进，但其在自主细胞机器人领域的成功可能会引起人们的兴趣。这种方法还可能为整个机器人身体开发无线供电的可植入贴片。该方法通过将柔性射频电路直接集成在水凝胶基架上，为未来软生物机器人的无线电刺激铺平了道路。
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Disclosures
提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
本文由美国国家卫生研究院（R01AR074234、R21EB026824、R01 AR073822-01）、布里格姆研究所步进强者奖和AHA创新项目奖（19IPLOI34660079）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
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- Park, S. J., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
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- Rus, D., Tolley, M. T. Design, fabrication and control of soft robots. Nature. 521 (7553), 467-475 (2015).
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- Shin, S. R., et al. Electrically Driven Microengineered Bioinspired Soft Robots. Advanced Materials. 30 (10), 1704189 (2018).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
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- Shin, S. R. Carbon Nanotube Reinforced Hybrid Microgels as Scaffold Materials for Cell Encapsulation. ACS Nano. , (2013).
