Summary
Uno scaffold bioinspired è fabbricato con una tecnica di fotolitografia morbida utilizzando idrogel sagomati dal punto di guida ed elettricamente conduttivi. Gli idrogel micromodellati forniscono l'allineamento delle cellule cardiomiociti cardiomiociti direzionali, con conseguente direzione di azionamento su misura. I microelettrodi flessibili sono integrati anche nello scaffold per portare la controllabilità elettrica per un tessuto cardiaco auto-octuante.
Abstract
I sistemi robotici morbidi bioispirati che imitano organismi viventi utilizzando tessuti muscolari ingegnerizzati e biomateriali stanno rivoluzionando l'attuale paradigma biorobotica, specialmente nella ricerca biomedica. La ricreazione di dinamiche artificiali di attivimento realistiche è fondamentale per un sistema soft-robotico. Tuttavia, il controllo preciso e la messa a punto del comportamento di alleuazione rappresentano ancora una delle principali sfide dei moderni sistemi robotici morbidi. Questo metodo descrive una procedura a basso costo, altamente scalabile e facile da usare per fabbricare un robot morbido controllabile elettricamente con movimenti realistici che viene attivato e controllato dalla contrazione del tessuto muscolare cardiaco su una puntura micromodellata a raggi-come scaffold idrogel. L'uso di metodi di fotolitografia morbida consente di integrare con successo più componenti nel sistema robotico morbido, tra cui scaffold a base di idrogel micromodellati con nanotubi di carbonio (CNT) di gelatina emifaccoliloyl (CNT-GelMA), diacrilato poli(etilene glicole), microelettrodi in oro flessibile (Au) e tessuto muscolare cardiaco. In particolare, l'allineamento degli idrogel e il micropattern sono progettati per imitare la struttura muscolare e cartilaginea del raggio di puntura. L'idrogel CNT-GelMA conduttivo elettricamente funge da impalcatura cellulare che migliora il comportamento di maturazione e contrazione dei cardiomiociti, mentre l'idrogel PEGDA robusto meccanicamente fornisce un supporto strutturale simile alla cartilagine a tutto il robot morbido. Per superare la natura dura e fragile dei microelettrodi a base metallica, abbiamo progettato un modello serpentino che ha un'elevata flessibilità e può evitare di ostacolare la dinamica di battitura dei cardiomiociti. I microelettrodi Au flessibili incorporati forniscono stimolazione elettrica attraverso il robot morbido, rendendo più facile controllare il comportamento di contrazione del tessuto cardiaco.
Introduction
I moderni robot morbidi all'avanguardia possono imitare le strutture gerarchiche e le dinamiche muscolari di molti organismi viventi, come la medusa1,2, il raggio di pungiglione2, il polpo3,i batteri4e lo sperma5. Imitando le dinamiche e l'architettura dei sistemi naturali offre prestazioni più elevate in termini di efficienza energetica e strutturale6. Questo è intrinsecamente correlato alla natura morbida del tessuto naturale (ad esempio, la pelle o il tessuto muscolare con un modulo di un giovane tra 104x 109 Pa) che consente livelli più elevati di libertà e deformazione e adattabilità superiori rispetto agli attuatori standard ingegnerizzati (ad esempio, un modulo di Young di solito tra 109x 1010 Pa) 6. Gli attuatori morbidi a base muscolare cardiaca, in particolare, mostrano una migliore efficienza energetica grazie alla loro auto-attivazione e al loro potenziale di autoriparazione e rigenerazione rispetto a un sistema robotico basato su meccanica7. Tuttavia, la fabbricazione di robot morbidi è difficile a causa della necessità di integrare diversi componenti con diverse proprietà fisiche, biologiche e meccaniche in un unico sistema. Ad esempio, i sistemi sintetici ingegnerizzati devono essere integrati con sistemi biologici viventi, non solo fornendo loro supporto strutturale, ma anche influenzando e modulando il loro comportamento di attuazione. Inoltre, molti metodi di microfabbricazione richiedono processi duri / citotossici e sostanze chimiche che riducono la vitalità e la funzione di qualsiasi componente vivente. Pertanto, sono necessari nuovi approcci per migliorare la funzionalità dei robot morbidi e per controllare e modulare il loro comportamento.
Per integrare con successo i componenti viventi con una buona vitalità, uno scaffold a base di idrogel è un materiale eccellente per creare il corpo di un robot morbido. Le proprietà fisiche e meccaniche di un idrogel possono essere facilmente regolate per creare microambienti per componenti viventi come i tessuti muscolari8,9. Inoltre, può facilmente adottare varie tecniche di microfabbricazione, con conseguente creazione di strutture gerarchiche ad alta fedeltà1,2,10. I dispositivi elettronici flessibili possono essere incorporati nel robot morbido per controllarne il comportamento con la stimolazione elettrica. Ad esempio, le tecniche optogenetiche per l'ingegneria delle cellule elettrogeniche (ad esempio, i cardiomiociti), che mostrano un'attivazione elettrofisiologica dipendente dalla luce, sono state utilizzate per sviluppare un raggio di puntura robotica morbida basato su polidimetilsiloxane (PDMS) guidato dalla luce che è stato in grado di ricreare il movimento ondulatorio della vitro del pesce in vitro2 . Anche se le tecniche optogenetiche hanno dimostrato un'eccellente controllabilità, il lavoro presentato utilizza la stimolazione elettrica, un metodo di simulazione convenzionale e tradizionale. Questo perché la stimolazione elettrica tramite microelettrodi flessibili è facile e semplice rispetto alle tecniche optogenetiche, che richiedono ampi processi di sviluppo11. L'uso di dispositivi elettronici flessibili può consentire la stimolazione a lungo termine e processi di fabbricazione standard/semplici, nonché la biocompatibilità regolabile e le proprietà fisiche e meccaniche12,13.
Qui, presentiamo un metodo innovativo per fabbricare un robot morbido bioispirato, azionato dal battito del tessuto muscolare cardiaco ingegnerizzato e controllato dalla stimolazione elettrica attraverso microelettrodi Au flessibili incorporati. Il robot morbido è progettato per imitare la struttura muscolare e cartilaginea del raggio di pungiglione. Il raggio di pungiglione è un organismo con una struttura e un movimento relativamente facili da imitare rispetto ad altre specie che nuotano. I muscoli vengono ricreati in vitro seeding cardiomiociti su un micromodello di idrogel elettricamente conduttivo. Come riportato in precedenza, l'incorporazione di nanoparticelle elettricamente conduttive come il CNT nell'idrogel GelMA non solo migliora l'accoppiamento elettrico del tessuto cardiaco, ma induce anche un'eccellente architettura in vitro e disposizione8,9. Le articolazioni della cartilagine vengono poi imitate utilizzando un modello idrogel PEGDA meccanicamente robusto che agisce come il substrato meccanicamente robusto dell'intero sistema. I microelettrodi Flessibili Au con un modello serpentino sono incorporati nel modello PEGDA per stimolare localmente e stimolare elettricamente il tessuto cardiaco.
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Protocol
Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Sanità. Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Brigham and Women's Hospital.
1. Sintesi GelMA
- Sciogliere 10 g di gelatina in 100 mL di salina tamponata da fosfati (DPBS) utilizzando un agitatore magnetico a 50 gradi centigradi.
- Aggiungere 8 mL di anidride methacrlica lentamente mescolando la soluzione di prepolimero di gelatina a 50 gradi centigradi per 2 h. Diluire la soluzione di gelatina reattiva con DPBS preriscaldata a 50 gradi centigradi.
- Trasferire la soluzione diluita nelle membrane di dialisi (taglio del peso molecolare 12-14 kDa) e metterle in acqua deionizzata (DI). Eseguire la dialisi a 40 gradi centigradi per circa 1 settimana.
- Filtrare la soluzione prepolimero GelMA dialfatto utilizzando un filtro sterile (dimensione del poro è 0,22 m) e trasferire 25 o 30 mL della soluzione in tubi da 50 mL e conservare a -80 gradi centigradi per 2 giorni.
- Asciugare a secco la soluzione prepolimerale GelMA congelata utilizzando un'asciugatrice congelata per 5 giorni.
2. Preparazione della soluzione prepolimero polipolilene (etilene glicole) (PEGDA)
- Sciogliere 200 mg (20% della soluzione totale) di PEGDA (MW - 1.000) con 5 mg (0,5% della soluzione totale) di 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone (foto-initiator, PI) in 1 mL di DPBS.
- Incubare la soluzione prepolimera a 80 gradi centigradi per 5 min.
3. Preparazione della soluzione di stock disperso Rivestita in GelMA con CNT
- Sciogliere 80 mg di GelMA (utilizzato come biosurfactant) in 4 mL di DPBS e quindi aggiungere 20 mg di COOH multidimensionale nanotubi di carbonio multiwalled (MWCNT) nella soluzione prepolimerica GelMA.
- Sonicare la soluzione prepolimeri GelMA carica da MWCNT per 1 h (0,66Hz, 100 Watt).
NOTA: Durante il processo di sonicazione, la soluzione deve essere immersa in un bagno d'acqua a 15 gradi centigradi per evitare l'evaporazione del solvente a causa dell'aumento della temperatura.
4. Preparazione di 1 mg/mL CNT contenente 5% soluzione prepolimerica GelMA
- Sciogliere 50 mg di GelMA e 5 mg (0.5% della soluzione totale) di PI in 0.8 mL di DPBS a 80 gradi centigradi per 10 min.
- Aggiungere 0,2 mL della soluzione di stock CNT preparata (passaggio 3). Vorticare e incubare la soluzione a 80 gradi centigradi per 10 min.
5. Preparazione di uno scivolo di vetro rivestito a 3 (trimethoxysilyl)propyl (TMSPMA)
- Lavare i vetrini di vetro (spessore 1 mm, dimensioni 5,08 cm x 7,62 cm) con etanolo puro.
- Impilare i vetrini puliti verticalmente in un becher da 250 mL e diffondere 3 mL di TMSPMA su di loro utilizzando una siringa. Coprire il becher con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione di TMSPMA.
- Incubare gli scivoli in un forno a 80 gradi centigradi per 1 giorno.
- Lavare i vetrini di vetro rivestiti immergendoli in etanolo puro, quindi asciugare.
- Conservare i vetrini in vetro rivestito avvolti in un foglio di alluminio a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Cercare di ridurre al minimo il tocco delle superfici dei vetrini in vetro rivestiti tè TMSPMA.
6. Fabbricazione dei microelettrodi Au flessibili
- Progettare una maschera shadow utilizzando la progettazione assistita dal computer (Supplementary File 3).
- Fabbricare e acquistare una maschera d'ombra.
- Lavare lo scivolo di vetro (spessore 1 mm, dimensioni x 3 cm x 4 cm) con acetone e asciugare con una pistola ad aria compressa.
- Fissare la maschera d'ombra ai substrati di vetro utilizzando nastro adesivo a doppio lato, quindi metterli in un evaporatore a fascio esistito e attendere che la pressione della camera raggiunga almeno 10-6 Torr.
NOTA: I due pezzi di nastro sono stati posizionati manualmente sul supporto ad una distanza sufficientemente breve da ospitare il vetro e abbastanza grande da adattarsi all'intero modello. Questo passo richiede circa 45-60 min. - Depositare uno strato Au spesso 200 nm mediante evaporatore di e-beam (ad esempio, con Denton EE-4, il vuoto - 10-6 Torr, potenza del 2,6%, velocità : 2 s) e tagliare i microelettrodi fabbricati utilizzando una macchina di sega da dicing (dimensione degli elettrodi - 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).
7. Fabbricazione di un scaffold idrogel multistrato multistrato integrato con micromagnete Au micromagnete
NOTA: Il risultato di questa procedura è una membrana in cui un idrogel PEGDA micromodellato si trova nello strato inferiore, un idrogel CNT-GelMA micromodello è in cima e i microelettrodi Au sono tra i due strati. Questa configurazione garantisce una maggiore flessibilità all'elettrodo e limita il rischio di rottura.
- Progettare e fabbricare due fotomaschere per creare il PEGDA micromodellato (1smask) e gli strati di idrogel CNT-GelMA (2nd photomask). Vedere File supplementare 2–3. Il progetto può essere fatto utilizzando il software CAD.
NOTA: vedere la figura 2B, E. - Posizionare 50 distanziali realizzati impilando uno strato di nastro invisibile commerciale (Thickness: 50 m) su un vetro rivestito TMSPMA. Versare la soluzione prepolimerizza PEGDA del 20% del 20% sopra il vetro rivestito TMSPMA, quindi coprire con microelettrodo in oro. Posizionare la prima fotomaschera per la vetrina di vetro (PEGDA micromodellata) sopra il microelettrodo dorato ed esporre l'intero costrutto alla luce UV (200 W vapore di mercurio lampada ad arco corto con filtro 320-390 nm) a 800 mW di intensità e 8 cm di distanza per 110 s.
NOTA: vedere la figura 1A. - Aggiungere DPBS per circondare lo scivolo di vetro e staccare l'idrogel PEGDA micromodellato insieme ai microelettrodi Au dal substrato di vetro non rivestito con attenzione dopo 5-10 min per ottenere il vetrino di vetro che ha l'idrogel PEGDA micromodellato con l'Au microelettrodi.
NOTA: vedere la figura 1B. A causa del rivestimento TMSPMA, il costrutto viene trasferito dal substrato di vetro non rivestito a quello rivestito tè TMSPMA. Staccarsi con attenzione perché i microelettrodi Au possono rompersi facilmente durante questo passaggio (Figura 3). - Posizionare sul fondo di una piastra Petri due strati di nastro trasparente commerciale (spessore e 50 m). Depositare una goccia di 20 CNT-GelMA soluzione prepolimerica tra i distanziali e poi capovolgere il vetrino di vetro ottenuto in 7.3 e fissarlo sul piatto con nastro adesivo.
- Ruotare il dispositivo a testa in giù e posizionare la 2nd photomask sopra la diapositiva di vetro. Esporre sotto la luce UV a 800 mW di intensità e 8 cm di distanza per 200 s.
NOTA: vedere la figura 1C. L'allineamento della seconda maschera è importante. - Lavare l'impalcatura ottenuta con DPBS e con un mezzo di coltura cellulare che include il 10% del siero bovino fetale (FBS).
- Lasciarli per una notte nell'incubatrice di 37 gradi centigradi prima di seminare le cellule.
8. Isolamento e cultura dei ratti neoatali
- Isolare i cuori dai ratti Sprague-Dawley di 2 giorni seguendo i protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Istituto8.
- Mettere i pezzi di cuore sullo shaker durante la notte (circa 16 h) in 0.05% trypsin senza EDTA in HBSS in una stanza fredda.
- Raccogliere i pezzi di cuore con una pistola pipetta e ridurre al minimo la quantità di trypsin, quindi metterli in un tubo da 50 mL con 10 mL di mezzi cardiaci caldi (10% FBS, 1% P/S, 1% L-glutamine).
- Swirl lentamente (60 giri/) in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 7 min. Rimuovere il supporto con attenzione dal tubo con una pipetta da 10 mL e lasciare i pezzi di cuore nel tubo.
- Aggiungere 7 mL di 0,1% di collagenasi di tipo 2 in HBSS e girare in un bagno d'acqua 37 C per 10 min.
- Mescolare con una pipetta da 10 mL 10 volte delicatamente per disturbare i pezzi di cuore. Rimuovere il supporto dal tubo con una pipetta da 1 mL.
- Aggiungete 10 mL di 0,1% di collagenasi di tipo 2 in HBSS e girare rapidamente (120-180 rpm) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 10 min, quindi controllare se i pezzi cardiaci si stanno sciogliendo.
- Mescolare con una pipetta da 10 mL, quindi ripetere con una pipetta da 1 mL per rompere gli ultimi pezzi di cuore.
- Una volta che la soluzione appare omogenea, posizionare un colino a celle da 70 m su un nuovo tubo da 50 mL e pipettare la soluzione 1 mL alla volta sul colino.
- Centrifugare la soluzione delle cellule cardiache a 180 x g per 5 min a 37 gradi centigradi.
NOTA: Se ci sono ancora alcuni pezzi di cuore o muco che non si sono sciolti, ripetere nuovamente i passaggi da 8,7–8,9. - Rimuovere con attenzione tutto il liquido sopra il pellet cellulare e risospeso le cellule in 2 mL di supporto cardiaco.
- Aggiungere 2 mL di supporto cardiaco dalla parete del tubo con attenzione per risospendere le cellule ed evitare di romperle.
- Aggiungere le cellule sospese in un pallone T175 con caldo cardiaco media goccia dopo goccia. Mettere il flacone in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire ai fibroblasti cardiaci di attaccarsi sul fondo.
NOTA: A questa fase di prepsiatura, i fibroblasti cardiaci si attaccheranno al pallone mentre i cardiomiociti rimarranno nel mezzo di sospensione. - Raccogliere il supporto dal flacone che contiene i cardiomiociti e metterlo in un tubo da 50 mL.
- Contare le cellule, quindi centrifugare a 260 x g per 5 min a 37 gradi centigradi.
- Risospendere e seleggere le cellule sulla parte superiore del robot morbido fabbricato nel passaggio 7. Versare un volume specifico di supporti cardiaci con i cardiomiociti ad una concentrazione di 1,95 x 106 celle/mL goccia per goccia su tutta la superficie del dispositivo.
- Incubare i campioni a 37 gradi centigradi e cambiare i media con supporti di coltura cellulare da 5 mL con il 2% di FBS e l'1% L-glutamine il primo e il secondo giorno dopo la semina. Modificare il supporto ogni volta che il colore del supporto cambia.
9. Colorazione delle celle per l'analisi dell'allineamento
- Rimuovere il supporto e lavare con DPBS per 5 min a RT.
- Fissare le cellule utilizzando 4% paraformaldeide (PFA) per 20 min a RT. Quindi lavare con DPBS per 5 min a RT.
- Incubare le cellule con 0,1% tritonte in DPBS a RT per 1 h. Lavare 3x con PBS per 5 min a RT.
- Incubare le cellule con 10% siero di capra in DPBS a RT per 1 h.
- Incubare le cellule con un anticorpo primario (sarcomeric z-actinina e connexin-43) nel 10% del siero di capra nel DPBS a 4 gradi centigradi per 14–16 h.
- Lavare 3x con DPBS per 5 min a RT. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario nel 10% del siero di capra in DPBS a RT per 1 h.
- Lavare 3x con DPBS per 5 min a RT, quindi contrastare le cellule con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in acqua DI (1:1,000) per 10 min a RT. Lavare 3x con DPBS per 5 min a RT.
- Scatta immagini a fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione laser invertita.
10. Test degli attuatori e valutazione del comportamento
- Battito spontaneo dei cardiomiociti sul robot morbido
- Incubare attuatori bioispirati a 37 gradi centigradi per 5 giorni e aggiornare i media il giorno 1 e 2 e quando necessario (cioè quando i media diventano gialli). Utilizzare un microscopio ottico invertito per scattare immagini ogni giorno (5x e/o 10x). Registra i movimenti delle celle utilizzando il software di acquisizione video sulla finestra live del microscopio per 30 s a 20 fotogrammi al secondo (5x e/o 10x) quando inizia l'attività contrattile (generalmente intorno al giorno 3).
- Al giorno 5, staccare le membrane sollevando delicatamente dal bordo con uno scivolo di copertura.
NOTA: Se le cellule mostrano un forte comportamento di battitura, le membrane si staccano da sole a causa dell'azione meccanica delle contrazioni.
- Stimolazione del segnale elettrico sfuso
- Utilizzando un PDMS distanziato di 3 cm come supporto, apporre due elettrodi di asta di carbonio con filo di platino (Pt) in una parabola Petri di 6 cm piena di supporti cardiaci. Quindi trasferire con attenzione il robot morbido nel piatto Petri.
- Applicare una forma d'onda quadra con 50 ms larghezza impulso, valore di offset DC 0 V, e l'ampiezza di tensione di picco tra 0,5 e 6 V. La frequenza varia tra 0,5, 1,0 e 2,0 Hz con un ciclo di lavoro compreso rispettivamente tra 2,5%, 5% e 10%. Registra le contrazioni su macroscala utilizzando una fotocamera disponibile in commercio.
- Stimolazione elettrica con i microelettrodi Au
- Dopo la fabbricazione di scaffold idrogel multistrato integrati con microelettrodo Au, collegare due fili di rame agli elettrodi Au attraverso una porta quadrata esterna con pasta d'argento.
- Coprire la pasta d'argento con un sottile strato di PDMS precurato a 80 gradi centigradi per 5 min. Quindi mettere i campioni su una piastra calda a 45 gradi centigradi per 5 h per incrociare completamente il PDMS.
- Dopo la semina cardiomiocito, applicare uno stimolo elettrico a onda quadra sui fili di rame con il valore di offset DC 1 V, l'ampiezza della tensione di picco tra 1,5 e 5 V e le frequenze di 0,5, 1,0 e 2,0 Hz rispettivamente.
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Representative Results
Diagramma di flusso dei passaggi per lo sviluppo del robot morbido bioispirato incorporato con microelettrodo Au
L'obiettivo del design soft robot era quello di costruire una membrana in grado di azionare un movimento di nuoto con una complessità minima. La struttura deve essere in grado di sostenere forti flessioni ripetutamente nel tempo (circa 1 Hz) ed essere in grado di mantenere la sua forma, ottenendo un forte battito. Foto che attraversano selettivamente il polimero utilizzando fotomaschere, abbiamo fabbricato uno scaffold strutturato gerarchicamente composto da uno strato idrogel PEGDA micromodellato, uno strato flessibile di microelettrodi Au e uno strato idrogel CNT-GelMA micromodellato. Un diagramma schematico e immagini effettive della procedura di fabbricazione del robot morbido come descritto nel protocollo sono illustrati nella Figura 1. In breve, ci sono stati tre passaggi di fabbricazione principali per il robot morbido bioispirato con microelettrodi Au incorporati: In primo luogo, un idrogel PEGDA micromodellato con microelettrodi Au incorporati è stato ottenuto mediante il collegamento incrociato UV utilizzando la prima fotomaschera (Figura 1A, B). In secondo luogo, un costrutto multistrato composto da microelettrodi Au, il micromodello CNT-GelMA, e gli idrogel PEGDA è stato fabbricato da crosslinking UV utilizzando la seconda fotomaschera (Figura 1C). Infine, i cardiomiociti sono stati seminati sul costrutto a tre strati fabbricato per fornire l'attuazione al robot morbido (Figura 1D).
Diversi disegni del robot morbido
Per quanto riguarda la forma del robot morbido, all'inizio, abbiamo progettato due forme bioispirate biomimando i modelli di due diversi animali acquatici. Il primo design è stato ispirato dalla comparsa di una stella marina caraibica (Figura 2A, B, C), perché la stella marina può essere semplificata in un oggetto bidimensionale (2D), ha una spina dorsale dura e ha una parte flessibile che si unisce per muoversi nell'acqua, riducendo al minimo il movimento richiesto. Il secondo dispositivo era basato sulla forma di un raggio di manta (Figura 2D, E, F) che è facile da riprodurre in un dispositivo 2D. La manta può nuotare rapidamente utilizzando movimenti unici. Abbiamo disegnato il raggio della manta usando forme geometriche di base con ridotta complessità per essere collegati in modo incrociato durante la fase della fotomaschera. L'elettrodo, posto lungo la linea mediana della struttura, è stato progettato con un modello ondulato, consentendo una migliore diffusione degli impulsi elettrici e della flessibilità (Figura 2D). Per sviluppare il robot morbido bioispirato, la forma ispirata ai raggi di manta è stata selezionata e testata a fondo in questo studio.
La sfida di incorporare i microelettrodi Au tra idrogel CNT-GelMA e PEGDA
L'incapsulamento di microelettrodi Au spessi 200 nm nel corpo del robot fabbricato potrebbe controllare localmente il costrutto fornendo stimolazione elettrica. Anche se il collegamento UV dei modelli idrogel CNT-GelMA e PEGDA direttamente sulla superficie dell'elettrodo ha ostacolato la delaminazione degli elettrodi, ha garantito il successo dell'incorporazione dell'elettrodo nel robot morbido. Tuttavia, dopo il trasferimento dell'elettrodo Au sugli idrogel PEGDA, l'elettrodo Au con una forma rettangolare e un'ampia larghezza (>1 mm) è stato facilmente rotto durante il processo di fabbricazione a causa del gonfiore dell'idrogel PEGDA (Figura 3A, B, C). Quindi, dovevamo assicurarci che i microelettrodi fossero trasferiti con successo all'idrogel PEGDA e incorporati tra gli idrogel CNT-GelMA e PEGDA, mentre erano intatti. Pertanto, sono stati progettati e fabbricati microelettrodi Au con un motivo serpentino (spessore e 200 m) con litografia morbida. Sono state scattate immagini al microscopio a contrasto di fase con diversi ingrandimenti e stadi al fine di ispezionare i segni di frattura sull'elettrodo dopo il trasporto sugli idrogel PEGDA micromodellati (Figura 3D, E, F).
L'ottimizzazione della spaziatura tra micromodelli di idrogel
Lo strato di semi cardiomiocita CNT-GelMA ha mostrato un comportamento di battitura diverso a seconda delle distanze del modello (Figura 4A, B). Questo può essere attribuito ai diversi modi in cui le cellule attaccate alla superficie della membrana a seconda delle distanze delle linee. Nel caso della distanza di 50 m, le celle erano troppo imballate e non avevano la configurazione organizzata desiderata. Le cellule parzialmente interconnesse e non allineate sulle ali non contribuivano contemporaneamente al movimento di nuoto. Quindi, la forza generata dal cardiomiocita non era sufficiente a piegare le ali. A una distanza di 150 m, le cellule erano molto ben allineate. Tuttavia, si sedettero principalmente nella scanalatura e c'erano poche interconnessioni tra le celle negli strati superiori, con conseguente battito debole. A una distanza di 75 m, le celle erano allineate nella parte inferiore e interconnesse nella parte superiore, mostrando il battito più forte. Inoltre, per evitare il rotolamento completo irreversibile del robot morbido durante il battito dinamico dei cardiomiociti, abbiamo ottimizzato la spaziatura del modello dello strato di supporto idrogel PEGDA a 300 m (Figura 4C). Infine, a seguito di questo processo di parametrizzazione, abbiamo deciso di concentrarci maggiormente sulla membrana a forma di raggio di manta con modelli PEGDA a distanza di 300 m e modelli CNT-GelMA a distanza di 75 m. Il tessuto cardiaco sui modelli PEGDA- e CNT-GelMA micromodellati è stato dimostrato anche da immagini di fase/contrasto e immagini confocalie F-actin/DAPI (Figura 4B).
L'analisi del movimento del tessuto cardiaco sugli idrogel MICROpatterned PEGDA- e CNT-GelMA
Per analizzare il movimento dell'attuatore, abbiamo preso video della membrana senza i microelettrodi Au mentre si applica un campo elettrico utilizzando un elettrodo di asta di carbonio. Figura 4D Mostra alcuni fotogrammi tratti dai record di contrazione. Era chiaramente visibile che l'attuatore a forma di raggio di manta stava piegando le ali come previsto. La coda stava bilanciando la struttura raddrizzare un po 'e le ali erano fortemente chiusura nel mezzo. Alcune membrane hanno mostrato un movimento rotante durante la contrazione a causa di idrogel CNT-GelMA e PEGDA micromodellati disallineati (Figura 4E e Video 1). In questo caso, il movimento era meno definito rispetto al precedente, ma la contrazione era ancora abbastanza forte da consentire l'azionamento di un movimento rotante. Il tempo totale per completare un intero cerchio era di circa 45 s.
La caratterizzazione dei cardiomiociti sul robot morbido multistrato e il controllo del comportamento di battitura mediante stimolazione elettrica
Dopo la seming e la maturazione dei cardiomiociti sul sistema robotico bio-ispirato (Figura 5A), l'allineamento del tessuto cardiaco lungo la direzione dei modelli CNT-GelMA (Figura 5B-E) sia da F-actin/DAPI che da un'immunointazione sacromerica/connexina-43/DAPI. Le immagini confocali di fluorescenza mostravano cardiomiociti ben allungati e allineati sul modello di idrogel CNT-GelMA (Figura 5B, C). È stato osservato un allineamento sarcomere uniaxiale parziale e la struttura dei sarcomeri interconnessi sulle aree modellate (Figura 5D). Sono state osservate anche strutture sarcomere ben interconnesse di tessuti cardiaci situati direttamente sopra i microelettrodi (Figura 5E). Per valutare il robot morbido bioinspired, abbiamo rilevato la sua funzione utilizzando due metodi: In primo luogo, abbiamo applicato un impulso elettrico bifasico al robot morbido anche se elettrodi asta di carbonio per la messa a punto artificiale e il controllo del comportamento di battitura. In secondo luogo, abbiamo collegato due fili di rame all'estremità più esterna dell'elettrodo Au per generare un segnale elettrico attraverso l'intero costrutto robot. Quando abbiamo applicato una stimolazione elettrica attraverso l'elettrodo di carbonio esterno o filo di rame collegato all'elettrodo Au, la tensione di soglia di eccitazione era diversa a frequenze diverse (0,5, 1,0 e 2,0 Hz, Figura 5F).
Figura 1: Diagramma schematico e immagini reali che raffigurano il processo di fabbricazione del robot morbido multistrato bioispirato controllato elettricamente dal segnale elettrico tramite l'integrazione di microelettrodi Au flessibili. (A) Modellazione e collegamento incrociato dell'idrogel PEGDA utilizzando la fotomaschera 1st. (B) Idrogel PEGDA micromodellato con microelettrodi Au incapsulati sul vetro TMSPMA ottenuto dopo fase (A). (C) Collegamento incrociato dell'idrogel a motivi geometrici CNT-GelMA utilizzando la 2nd photomask. (D) Seeding dei cardiomiociti sul costrutto multistrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Progettazione dei robot morbidi bioispirati. (A) Immagine reale delle stelle marine e diverse visioni del modello CAD tridimensionale (3D) che indicano i componenti e le strisce. (B) Design della maschera per il modello CNT-GelMA, il modello PEGDA e i microelettrodi Au per la forma delle stelle marine. (C) Immagine al microscopio ottico dei modelli CNT-GelMA e PEGDA micromodellati per la forma delle stelle marine. (D) Immagine reale dei raggi di manta e diverse viste del modello CAD 3D che indicai i componenti. (E) Disegno maschera per modello CNT-GelMA, modello PEGDA, e microelettrodi Au per la forma a raggi di manta, adattato con il permesso di Su Ryon et al.10. (F) Immagine al microscopio ottico dei modelli CNT-GelMA e PEGDA micromodellati per la forma del raggio della manta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Progettazione dei microelettrodi Au flessibili. (A) Fotografia di elettrodi Au fabbricati con forme rettangolari e larghezze larghe. (B e C) Immagini ottiche al microscopio degli elettrodi Au che non sono riusciti a trasferire agli idrogel PEGDA. (D) I microelettrodi Au ondulati prima e dopo(E e F) vengono trasferiti sull'idrogel PEGDA a micromodellata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'ottimizzazione degli idrogel PEGDA e CNT-GelMA micromodellati e l'analisi del movimento dei robot morbidi. (A) Immagini ottiche di cardiomiociti sul modello idrogel CNT-GelMA con spaziatura di 50, 75 e 150 m. (B) Immagini ottiche e colorazione F-actin/DAPI dei cardiomiociti sui modelli di idrogel PEGDA- e CNT-GelMA, rispettivamente con 300 m e 75 m di spaziatura. (C) Le morfologie rotanti dei costrutti bioispirati con e senza l'idrogel PEGDA micromodellato con spaziatura di 300 m. (D) Fotogrammi del video soft robot bioinspireizzato in piedi registrati durante l'applicazione dello stimolo elettrico. (E) Collage di quattro diversi fotogrammi presi dalla registrazione video del movimento rotante del robot morbido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Caratterizzazione dei cardiomiociti sul robot morbido incorporato in microelettrodi Au e controllo del comportamento di battitura mediante stimolazione elettrica. (A) Immagine al microscopio ottico dei cardiomiociti coltivati sui microelettrodi Au incapsulati tra gli idrogel PEGDA e CNT-GelMA. (B) Immagine di fluorescenza F-actin/DAPI che mostra i cardiomiociti ben allungati e allineati sul micropattern idrogel CNT-GelMA. (C-E) Immagini confocale di fluorescenza che mostrano l'allineamento dei sarcomeri e le strutture sarcomere interconnesse sul robot morbido fabbricato: cardiomiociti coltivati (C e D)sul micromodello idrogel CNT-GelMA e (E) vicino ai microelettrodi Au. (F) Necessaria tensione della soglia di eccitazione a frequenze diverse (0,5, 1,0 e 2,0 Hz) quando si applica la stimolazione elettrica tramite elettrodo di asta di carbonio e microelettrodi Au incorporati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di fabbricare con successo un robot morbido bioispirato simile al pesce batoid e con un tessuto cardiaco auto-azionante integrato su uno scaffold strutturato multistrato che è controllato da microelettrodi Au incorporati. A causa di due distinti strati di idrogel micromodellati fatti di idrogel PEGDA e CNT-GelMA, lo scaffold bioinspire d'ispirazione ha mostrato una buona stabilità meccanica e l'allineamento e la maturazione delle cellule ideali. Lo strato di pattern PEGDA, che funge da giunto cartilagineo dell'architettura scheletrica in un raggio di pungiglione, fornisce supporto meccanico per l'intero corpo del robot. In particolare, ha mantenuto la stabilità meccanica durante la contrazione e il rilassamento dei tessuti cardiaci, consentendo un battito efficiente grazie alla sua capacità di rilasciare la tensione della membrana dopo la contrazione. Inoltre, lo spessore nanometrico dei microelettrodi (200 nm), così come il loro modello serpentino, ha permesso loro di essere abbastanza flessibili da non ostacolare o influenzare la contrazione del tessuto cardiaco (Figura 2). Per trasferire facilmente microelettrodi sulla superficie dell'idrogel senza alcuna rottura, i microelettrodi Au sono stati fabbricati sul vetro senza alcuno strato di adesione, come il titanio, che viene comunemente utilizzato per creare una forte adesione tra il vetro e Au. Nel frattempo, lo strato CNT-GelMA, che fornisce supporto per l'attacco e l'allineamento cardiomiociti, è stato realizzato con motivi perpendicolari all'orientamento del modello idrogel PEGDA (Figura 3). Dopo la maturazione, i cardiomiociti sullo strato superiore hanno fornito l'auto-attuazione per l'intero scaffold. Attraverso la stimolazione elettrica locale dei microelettrodi flessibili Au incorporati, potremmo modulare la frequenza di battitura del robot senza danneggiare il tessuto cardiaco su di esso. Anche se questo metodo di fabbricazione è facile da imparare e da riprodurre, ci sono ancora alcuni passaggi tecnicamente impegnativi nel processo di fabbricazione che devono essere enfatizzati.
Ci sono cinque passaggi critici per la fabbricazione del biorobot morbido: 1) corretta dispersione dei CNT nell'idrogel GelMA; 2) il collegamento UV riuscito degli idrogel PEGDA e CNT-GelMA sul vetro rivestito TMSPMA; 3) il trasferimento dei microelettrodi Au dal vetro di supporto al modello di idrogel; 4) il corretto distacco dell'attuatore dallo scivolo di vetro di supporto; 5) creazione di un buon contatto elettrico tra i microelettrodi Au e i fili utilizzati per il collegamento al generatore di forma d'onda.
Rispetto ai substrati GelMA incontaminati, l'incorporazione di CNT fornisce all'idrogel GelMA proprietà meccaniche avanzate e funzioni elettrofisiologiche avanzate che contribuiscono a tassi di battito sincrono spontaneo più elevati e a una minore soglia di eccitazione del tessuto miocardico9. Il problema della citotossicità CNT è evitato non solo utilizzando CNT funzionalizzati superficiali, ma anche incorporando le nanostrutture nella matrice idrogel GelMA fino a una concentrazione di 5,0 mg/mL9. Infatti, l'interazione tra i segmenti idrofobici dell'idrogel GelMA con le pareti laterali del CTO porta all'incapsulamento dei CNT nella matrice porosa idrogel14. Questo non solo impedisce loro di formare aggregati potenzialmente tossici, ma migliora anche la solubilità delle CNT nelle soluzioni saline (ad esempio, DPBS o mezzo di coltura cellulare).
Per incorporare con successo i microelettrodi Au tra gli idrogel PEGDA e CNT-GelMA, è necessario prestare particolare attenzione al crosslink UV di ogni singolo strato. In particolare, per trasferire i microelettrodi Au sullo strato idrogel PEGDA, è necessario assicurarsi che la soluzione idrogel copra l'intera area degli elettrodi per evitare la rottura degli elettrodi durante la fase di peeling. Pertanto, la qualità del rivestimento in vetro TMSPMA è fondamentale per garantire un'adesione ottimale dell'idrogel PEGDA sul substrato di vetro, impedendone così il distacco durante la fase di trasferimento dei microelettrodi.
Un'altra fase critica del metodo è il distacco del bioactuatore dal vetrino di vetro di supporto. Questo problema può essere facilmente risolto quando il battito spontaneo dei tessuti cardiaci è sincrono e abbastanza forte da sbucciare naturalmente l'idrogel di supporto dallo scivolo di vetro. Per questo motivo, come riportato in precedenza, è fondamentale ottimizzare i modelli di idrogel per indurre uno specifico allineamento cellulare favorevole per l'organizzazione di un tessuto cardiaco funzionale e sincrono.
Per collegare elettricamente i microelettrodi al generatore di forme d'onda, è necessario creare collegamenti elettrici sui microelettrodi. Durante questa fase, è importante incapsulare completamente la colla d'argento utilizzata per contattare i microelettrodi al filo di rame per evitare effetti citotossici. Questo risultato si ottiene con successo depositando una sottile goccia di PDMS sulla parte superiore del contatto elettrico.
Questo metodo non solo potrebbe superare i limiti delle tecniche optogenetiche esistenti, come processi di fabbricazione complicati, lunghi tempi di fabbricazione e potenziale tossicità degli strumenti optogenetici, ma anche migliorare fortemente le prestazioni delle cellule attuatori che portano alla stimolazione in tempo reale utilizzando tecniche a basso costo e facili da maneggiare. Anche se la progettazione dei nostri attuali attuatori bioispirati non poteva generare propulsione in avanti, il suo successo nel campo dei robot autonomi basati sulle cellule potrebbe attirare molto interesse. Questo metodo può anche potenzialmente contribuire allo sviluppo di patch impiantabili alimentate in modalità wireless per un intero corpo robot. Questo metodo spiana la strada alla futura stimolazione elettrica wireless di soft-biorobots, anche se l'integrazione di circuiti RF flessibili direttamente nello scaffold a base di idrogel.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo documento è stato finanziato dal National Institutes of Health (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), dal Brigham Research Institute Stepping Strong Innovator Award e dal AHA Innovative Project Award (19IPLOI34660079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
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