Summary
생체 영감 스캐폴드는 기계적으로 견고하고 전기 전도성 하이드로겔을 사용하여 부드러운 포토리소그래피 기술로 제작됩니다. 마이크로 패턴 하이드로겔은 방향성 심근세포 정렬을 제공하여 맞춤형 작동 방향을 제공합니다. 유연한 마이크로 전극은 또한 자체 작동 심장 조직에 대한 전기 제어 성을 가지고 스캐폴드에 통합되어 있습니다.
Abstract
엔지니어링 된 근육 조직 및 생체 재료를 사용하여 살아있는 생물을 모방하는 바이오 영감 연질 로봇 시스템은 특히 생물 의학 연구에서 현재의 생물 로봇 패러다임에 혁명을 일으키고 있습니다. 소프트 로봇 시스템에는 인공 생명체와 같은 작동 역학을 재현하는 것이 매우 중요합니다. 그러나 작동 동작의 정밀한 제어 및 튜닝은 여전히 현대 소프트 로봇 시스템의 주요 과제 중 하나입니다. 이 방법은 미세 패턴 스팅에서 심장 근육 조직의 수축에 의해 활성화되고 제어되는 실물 같은 움직임으로 전기적으로 제어 가능한 소프트 로봇을 제작하기 위해 저비용, 확장성 및 사용하기 쉬운 절차를 설명합니다. 광선 같은 하이드로 겔 비계. 소프트 포토리소그래피 방법을 사용하면 마이크로 패턴 하이드로겔 기반 스캐폴드와 탄소 나노튜브(CNT) 내장 젤라틴 메타크릴로일(CNT-GelMA)을 포함한 연질 로봇 시스템의 여러 구성 요소를 성공적으로 통합할 수 있습니다. 폴리 (에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA), 유연한 금 (Au) 미세 전극, 심장 근육 조직. 특히, 하이드로겔 정렬 및 마이크로패턴은 가오리의 근육 및 연골 구조를 모방하도록 설계된다. 전기 전도성 CNT-GelMA 하이드로겔은 심근세포의 성숙과 수축 거동을 개선하는 세포 스캐폴드 역할을 하며, 기계적으로 견고한 PEGDA 하이드로겔은 전체 소프트 로봇에 구조적 연골과 같은 지원을 제공합니다. 금속 기반 미세 전극의 단단하고 부서지기 쉬운 특성을 극복하기 위해 유연성이 높고 심근 세포의 박동 역학을 방해하지 않도록 할 수있는 뱀 패턴을 설계했습니다. 통합된 유연한 Au 마이크로 전극은 소프트 로봇 전반에 걸쳐 전기 자극을 제공하여 심장 조직의 수축 거동을 보다 쉽게 제어할 수 있습니다.
Introduction
현대의 최첨단 소프트 로봇은 해파리1,2,가오리2,문어3,박테리아4,정자5와같은 많은 생물의 계층 구조와 근육 역학을 모방 할 수 있습니다. 자연 시스템의 역학과 아키텍처를 모방하는 것은 에너지 및 구조 효율성 모두의 측면에서 더 높은 성능을 제공합니다6. 이것은 본질적으로 자연 조직의 부드러운 특성과 관련이 있습니다 (예를 들어, 10 4-109 Pa 사이의영의 계수를 가진 피부 또는 근육 조직) 표준 엔지니어링 액추에이터 (예 : 영의 계수는 보통 109-1012 Pa6)와비교할 때 더 높은 자유도와 우수한 변형 및 적응성을 허용합니다. 심장 근육 기반 의 소프트 액추에이터, 특히, 기계적 기반 로봇 시스템7에비해 자기 작동뿐만 아니라 자동 수리 및 재생에 대한 잠재력으로 인해 우수한 에너지 효율을 보여줍니다. 그러나 소프트 로봇의 제작은 서로 다른 물리적, 생물학적, 기계적 특성을 하나의 시스템에 통합해야 하기 때문에 까다롭습니다. 예를 들어, 엔지니어링 된 합성 시스템은 살아있는 생물학적 시스템과 통합되어야하며 구조적 지원을 제공 할뿐만 아니라 작동 동작에 영향을 미치고 변조해야합니다. 또한, 많은 미세 제조 방법은 살아있는 구성 요소의 생존력과 기능을 감소시키는 가혹한 / 세포 독성 공정 및 화학 물질을 필요로합니다. 따라서 소프트 로봇의 기능을 향상시키고 동작을 제어하고 조절하기 위해 새로운 접근 방식이 필요합니다.
살아있는 부품을 우수한 생존 가능성과 성공적으로 통합하기 위해 하이드로겔 기반 스캐폴드는 부드러운 로봇의 몸을 만드는 훌륭한 재료입니다. 하이드로겔의 물리적 및 기계적 특성은 쉽게 근육 조직8,9와같은 살아있는 구성 요소에 대한 미세 환경을 만들기 위해 조정할 수 있습니다. 또한 다양한 미세 제작 기술을 쉽게 채택 할 수 있어 고충실도1,2,10으로계층 구조가 생성됩니다. 유연한 전자 장치를 소프트 로봇에 통합하여 전기 자극으로 동작을 제어할 수 있습니다. 예를 들어, 광의존적 전기생리적 활성화를 나타내는 전기발생세포(예를 들어, 심근세포)를 설계하는 광유전학 기술은, 생체외2에서물고기의 비굴란 운동을 재현할 수 있었던 빛에 의해 유도된 다각형 실실록산(PDMS) 기반의 연질 로봇 찌르기 광선을 개발하는데 사용되어 왔다. 광유전학 적 기술은 우수한 제어성을 보여 주었지만, 제시 된 작업은 전기 자극, 기존의 전통적인 시뮬레이션 방법을 사용합니다. 이는 유연한 미세전극을 통한 전기 자극이 광유전학적 기술에 비해 쉽고 간단하기 때문에, 이는 광범위한 개발 과정이11이다. 유연한 전자 장치의 사용은 장기 자극 및 표준 / 간단한 제조 공정뿐만 아니라 조정 가능한 생체 적합성 및 물리적 및 기계적 특성12,13을허용 할 수 있습니다.
여기에서는 엔지니어링된 심장 근육 조직의 박동에 의해 작동되고 임베디드 유연한 Au 마이크로 전극을 통해 전기 자극에 의해 제어되는 생체 영감 연질 로봇을 제작하는 혁신적인 방법을 제시합니다. 소프트 로봇은 가오리의 근육과 연골 구조를 모방하도록 설계되었습니다. 가오리는 다른 수영 종에 비해 구조와 움직임을 모방하기가 비교적 쉬운 유기체입니다. 근육은 전기 전도성 하이드로겔 마이크로 패턴에 심근 구균을 시드하여 시험관 내에서 재현됩니다. 이전에 보고된 바와 같이, GelMA 하이드로겔에 CNT와 같은 전기전도성 나노입자를 통합하면 심장 조직의 전기적 결합을 향상시킬 뿐만 아니라 시험관내 조직 구조 및 배열도 우수한유도8,9. 연골 관절은 전체 시스템의 기계적으로 견고한 기판 역할을 기계적으로 강력한 PEGDA 하이드로 겔 패턴을 사용하여 모방된다. 서펜타인 패턴을 가진 유연한 Au 마이크로 전극은 PEGDA 패턴에 내장되어 심장 조직을 국소적으로 및 전기적으로 자극한다.
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Protocol
이 연구는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드의 권고에 따라 엄격 하 게 실시 되었다. 이 프로토콜은 브리검 및 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 겔마 합성
- 50°C에서 자기 교반기로 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)의 100 mL에 젤라틴 10g을 용해합니다.
- 50°C에서 젤라틴 프리폴리머 용액을 50°C에서 2시간 동안 교반하면서 8 mL의 메타크릴 무수화물을 천천히 첨가합니다.
- 희석된 용액을 투석 막(분자량 차단 = 12-14 kDa)으로 옮기고 탈이온화된(DI) 물에 넣습니다. 약 1 주 동안 40 °C에서 투석을 수행합니다.
- 멸균 필터(공극 크기 = 0.22 μm)를 사용하여 투석된 GelMA 프리폴리머 용액을 걸러내고 용액의 25 또는 30 mL을 50 mL 튜브로 옮기고 -80°C에서 2일 동안 보관합니다.
- 동결 건조기를 사용하여 냉동 GelMA 프리폴리머 용액을 5일 동안 동결 건조시.
2. 폴리 (에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA) 프리 폴리머 용액의 준비
- 2-하이드록시-4-(2-하이드록스yethoxy)-2-메틸프로피오페논(광-이니시에이터, PI)의 5 mg(총 용액의 0.5%)으로 PEGDA(총 용액의 20%)를 DPBS 의 1 mL에 용해시고(총 용액의 20%)를 용해합니다.
- 프리폴리머 용액을 80°C에서 5분 동안 배양합니다.
3. GelMA 코팅 CNT 분산 재고 용액의 제조
- 80 mg의 GelMA (생체 계화제로 사용)를 DPBS 4 mL에 용해한 다음 GelMA 프리 폴리머 용액에 COOH 기능화 된 다중 벽 탄소 나노 튜브 (MWCNTs)20 mg을 추가하십시오.
- 1시간(0.66Hz, 100와트)에 대한 MWCNT-라덴 GelMA 프리폴리머 용액을 초음파 처리합니다.
참고 : 초음파 처리 중에 용액은 온도 상승으로 인한 용매의 증발을 방지하기 위해 ~ 15 °C의 수조에 침지해야합니다.
4. 5 % GelMA 프리 폴리머 용액을 함유 한 1 mg / mL CNT의 준비
- 50 mg의 GelMA와 5 mg의 MG (총 용액의 0.5%)을 DPBS 0.8 mL에서 80 °C에서 10 분 동안 용해하십시오.
- 준비된 CNT 스톡 솔루션의 0.2 mL를 추가합니다(3단계). 소용돌이 및 용액을 80°C에서 10분 동안 배양한다.
5. 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트(TMSPMA) 코팅 유리 슬라이드의 제조
- 순수한 에탄올로 유리 슬라이드 (두께 = 1mm, 크기 = 5.08cm x 7.62 cm)를 씻으십시오.
- 청소된 슬라이드를 250mL 비커에 수직으로 쌓고 주사기를 사용하여 TMSPMA 3mL를 펼입니다. TMSPMA의 증발을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 비커를 덮습니다.
- 슬라이드를 80°C 오븐에서 1일 동안 배양합니다.
- 코팅 된 유리 슬라이드를 순수한 에탄올에 담근 다음 건조시십시오.
- 코팅 된 유리 슬라이드를 실온 (RT)에서 알루미늄 호일로 감싸십시오.
참고: TMSPMA 코팅 유리 슬라이드의 표면에 닿지 않는 것을 최소화하십시오.
6. 유연한 Au 마이크로 전극의 제조
- 컴퓨터 지원설계(보조 파일 3)를사용하여 섀도우 마스크를 디자인합니다.
- 섀도우 마스크를 제작하고 구매하세요.
- 유리 슬라이드 (두께 = 1mm, 크기 = 3cm x 4cm)를 아세톤으로 씻고 압축 공기 총으로 건조시십시오.
- 양면 테이프를 사용하여 유리 기판에 그림자 마스크를 부착한 다음 E-빔 증발기에 넣고 챔버 압력이 적어도 10-6 Torr에 도달 할 때까지 기다립니다.
참고: 두 개의 테이프는 유리를 수용할 수 있을 만큼 짧은 거리에서 지지대 위에 수동으로 배치되었으며 전체 패턴에 맞을 만큼 충분히 큽니다. 이 단계는 약 45-60 분 걸립니다. - E-빔 증발기로 200 nm 두께의 Au 층을 증착 (예를 들어, 덴튼 EE-4, 진공 = 10-6 토르, 전력 = 2.6 %, 속도 = 2 Å / s)를 다이싱 톱 기계 (전극 크기 = 7.38 mm x 8.9 mm x 200 nm)를 사용하여 제조 된 마이크로 전극을 절단하십시오.
7. Au 마이크로 전극 통합 마이크로 패턴 다층 하이드로 겔 스캐폴드 제조
참고 : 이 절차의 결과는 마이크로 패턴 PEGDA 하이드로 겔이 하단 층에있는 멤브레인이며, 마이크로 패턴 CNT-GelMA 하이드로 겔이 상단에 있고 Au 마이크로 전극이 두 층 사이에 있습니다. 이 구성은 전극에 더 나은 유연성을 보장하고 파손의 위험을 제한합니다.
- 두 개의 포토마스크를 디자인하고 제작하여 마이크로 패턴 PEGDA(1st 포토마스크)와 CNT-GelMA 하이드로겔(2nd 포토마스크) 레이어를 만듭니다. 추가 파일 2-3을참조하십시오. 디자인은 CAD 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
참고: 그림 2B, E. - TMSPMA 코팅 유리에 상업용 보이지 않는 테이프(두께: 50 μm)의 한 층을 적층하여 만든 50 μm 스페이서를 놓습니다. TMSPMA 코팅 유리 위에 20% PEGDA 프리폴리머 용액 15 μL을 붓고 금 미세 전극으로 덮습니다. 금 마이크로 전극 위에 유리 슬라이드 (마이크로 패턴 PEGDA)에 대한 첫 번째 포토 마스크를 배치하고 UV 빛 (320-390 nm 필터 200W 수은 증기 짧은 아크 램프)에 전체 구성을 노출 800mW의 강도와 110 초에 대한 8cm 거리.
참고: 그림 1A. - DPBS를 추가하여 유리 슬라이드를 둘러싸고 5-10분 후에 코팅되지 않은 유리 기판에서 Au 마이크로 전극과 함께 마이크로 패턴 PEGDA 하이드로겔을 분리하여 Au와 함께 마이크로 패턴 PEGDA 하이드로겔을 가하는 유리 슬라이드를 얻을 수 있습니다. 마이크로 전극.
참고: 그림 1B를참조하십시오. TMSPMA 코팅으로 인해, 시공은 코팅되지 않은 유리 기판으로부터 TMSPMA 코팅된 기판으로 이송된다. 이 단계에서 Au 마이크로 전극이 쉽게 파손될 수 있으므로 조심스럽게 분리합니다(그림3). - 페트리 접시 바닥에 상업용 투명 테이프(두께 = 50 μm)를 두 겹 쌓어 만든 100 μm 스페이서를 놓습니다. 스페이서 사이에 20 μL CNT-GelMA 프리폴리머 용액 을 한 방울 떨어 뜨린 다음 7.3에서 얻은 유리 슬라이드를 뒤집어 접착 테이프로 접시에 고정시십시오.
- 장치를 거꾸로 회전시키고 유리 슬라이드 위에2nd 포토마스크를 놓습니다. 800mW의 강도와 200s의 거리에서 UV 광 아래에 노출하십시오.
참고: 그림 1C를참조하십시오. 2번째 마스크의 정렬이 중요합니다. - 얻어진 스캐폴드를 DPBS및 10% 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 세포 배양 배지로 세척한다.
- 세포를 파종하기 전에 37°C 인큐베이터에 밤새 방치한다.
8. 신생아 쥐 심근세포 고립과 문화
- 동물 관리 연구소의 위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 2 일 된 스프라그 - Dawley 쥐에서 마음을 분리8.
- 차가운 방에서 HBSS에서 EDTA없이 0.05 % 트립신에서 하룻밤 (약 16 시간)에 쉐이커에 심장 조각을 넣습니다.
- 파이펫 총으로 심장 조각을 수집하고 트립신의 양을 최소화 한 다음 따뜻한 심장 미디어 (10 % FBS, 1 % P / S, 1 % L-글루타민)의 10 mL로 50 mL 튜브에 넣습니다.
- 37°C 수조에서 7분 동안 천천히(~60rpm) 소용돌이치며, 10 mL 파이펫으로 튜브에서 조심스럽게 매체를 제거하고 심장 조각을 튜브에 남깁니다.
- HBSS에 0.1% 콜라게나아제 타입 2의 7 mL를 넣고 37°C 수조에서 10분 동안 소용돌이치세요.
- 10mL 파이펫10x와 부드럽게 섞어 심장 조각을 방해하세요. 1mL 파이펫으로 튜브에서 용지를 제거합니다.
- HBSS에 0.1% 콜라게나아제 타입 2의 10 mL를 넣고 37°C 수조에서 빠르게(~120-180rpm) 소용돌이치면 심장 조각이 녹는지 확인합니다.
- 10 mL 파이펫과 섞은 다음 1 mL 파이펫으로 반복하여 마지막 심장 조각을 부수습니다.
- 용액이 균일해 보이면, 새로운 50 mL 튜브에 70 μm 세포 스트레이너를 놓고 스트레이너에 한 번에 용액 1 mL을 파이펫합니다.
- 37°C에서 5분 동안 180 x g에서 심장 세포 용액을 원심분리기.
참고: 아직 녹지 않은 심장 조각이나 점액이 있다면 8.7-8.9단계를 다시 반복하십시오. - 조심스럽게 세포 펠릿 위의 모든 액체를 제거하고 심장 매체의 2 mL에서 세포를 다시 중단.
- 튜브 벽에서 심장 매체 2 mL을 조심스럽게 추가하여 세포를 다시 일시 중단하고 깨지지 않도록하십시오.
- 따뜻한 심장 매체를 한 방울 씩 떨어뜨리고 T175 플라스크에 부유 세포를 추가합니다. 플라스크를 37°C 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 심장 섬유아세포가 바닥에 부착되도록 하였다.
참고 :이 준비 단계에서 심장 섬유 아세포는 플라스크에 부착되고 심근 세포는 현탁액 배지에 남아 있습니다. - 심근구가 들어있는 플라스크에서 매체를 수집하고 50 mL 튜브에 넣습니다.
- 세포를 계산한 다음 260 x g에서 37°C에서 5분 동안 원심분리기를 합니다.
- 7단계에서 제작된 소프트 로봇 위에 셀을 다시 일시 중단하고 시드합니다. 1.95 × 106 세포 / mL 의 농도로 심근 세포와 함께 심장 매체의 특정 볼륨을 장치의 전체 표면에 떨어 뜨립니다.
- 시료를 37°C에서 배양하고 파종 후 첫 번째 및 제2일에 2% FBS 및 1% L-글루타민을 사용하여 5 mL 세포 배양 배지로 배지를 변경합니다. 미디어의 색상이 바뀔 때마다 미디어를 변경합니다.
9. 정렬 분석을 위한 세포 염색
- 미디어를 제거하고 RT에서 DPBS로 5분 동안 세척합니다.
- RT에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 세포를 고정시. 그런 다음 RT에서 DPBS로 5 분 동안 씻으하십시오.
- RT에서 DPBS에서 0.1 % 트리톤으로 세포를 배양하여 RT에서 5 분 동안 PBS로 3 x 씻어.
- 1 시간 동안 RT에서 DPBS에서 10 % 염소 혈청으로 세포를 배양하십시오.
- 1차 항체(육종α-액티닌 및 코넥신-43)로 세포를 4°C에서 DPBS에서 10% 염소 혈청에서 ~14-16h에 배양한다.
- RT에서 5 분 동안 DPBS로 3x를 씻습니다.
- RT에서 DPBS로 3x를 5분 간 씻은 다음, RT에서 DPBS로 3x를 5분 동안 RT에서 10분 동안 DI 물(1:1,000)에서 4',6-디아미디노-2-페닐린들(DAPI)으로 세포를 역태로 처리합니다.
- 거꾸로 된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 찍습니다.
10. 액추에이터 테스트 및 행동 평가
- 소프트 로봇에 심근 세포의 자발적인 구타
- 바이오영감 액추에이터를 37°C에서 5일 동안 인큐베이팅하고 1일째와 2일째및 필요에 따라 매립한다(즉, 미디어가 노랗게 변할 때). 거꾸로 된 광학 현미경을 사용하여 매일 (5배 및/또는 10x) 이미지를 찍습니다. 수축 활동이 시작될 때 현미경의 라이브 창에서 비디오 캡처 소프트웨어를 사용하여 초당 20 프레임(5배 및/또는 10배)으로 30초 동안 셀 움직임을 기록합니다(일반적으로 3일 경).
- 5일째에는 커버 슬라이드로 가장자리에서 부드럽게 들어 올려 멤브레인을 분리합니다.
참고 : 세포가 강한 박동 행동을 보이면 막은 수축의 기계적 작용으로 인해 스스로 분리됩니다.
- 벌크 전기 신호 자극
- 3cm 간격의 PDMS를 홀더로 사용하여, 심장 매체로 채워진 6cm 페트리 접시에 백금(Pt) 와이어가 있는 2개의 탄소 막대 전극을 부착합니다. 그런 다음 조심스럽게 부드러운 로봇을 페트리 접시에 옮김을 옮김을 넣습니다.
- 50ms 펄스 폭, DC 오프셋 값 0V 및 피크 전압 진폭이 0.5~6V인 사각형 파형을 적용합니다. 주파수는 각각 2.5%, 5%, 10%의 듀티 사이클로 0.5, 1.0 및 2.0Hz 사이에서 다릅니다. 상용 카메라를 사용하여 대용량 수축을 기록합니다.
- Au 마이크로 전극을 가진 전기 자극
- Au 마이크로 전극 통합 다층 하이드로겔 스캐폴드를 제조한 후, 은색 페이스트를 사용하는 외부 정사각형 포트를 통해 Au 전극에 두 개의 구리 와이어를 부착합니다.
- 80°C에서 5분 동안 구치면 얇은 PDMS 층으로 은페이스트를 덮습니다. 그런 다음 샘플을 45°C에서 5시간 동안 핫 플레이트에 놓고 PDMS를 완전히 가교합니다.
- 심근구를 시드한 후, DC 오프셋 값 1V, 피크 전압 진폭 1.5 V, 0.5, 1.0 및 2.0Hz의 주파수를 가진 구리 와이어에 사각파 전기 자극을 적용합니다.
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Representative Results
Au 마이크로 전극 통합 바이오 영감 소프트 로봇 을 개발하기위한 단계의 흐름 다이어그램
소프트 로봇 설계의 목적은 최소한의 복잡성으로 수영 운동을 작동 시킬 수있는 멤브레인을 구축하는 것이었습니다. 구조는 시간이 지남에 따라 반복적으로 강한 굴곡을 유지할 수 있어야하며 (약 1 Hz) 강한 박동을 달성하면서 모양을 유지할 수 있어야합니다. 포토마스크를 사용하여 폴리머를 선택적으로 가교하여 마이크로 패턴 PEGDA 하이드로겔 층, 유연한 Au 마이크로 전극 층 및 마이크로 패턴 CNT-GelMA 하이드로겔 층으로 구성된 계층구조의 스캐폴드를 제작했습니다. 프로토콜에 설명된 대로 소프트 로봇의 제작 절차의 개략도 및 실제 이미지는 도 1에나와 있습니다. 간단히, 내장 된 Au 마이크로 전극과 바이오 영감 소프트 로봇에 대한 세 가지 주요 제조 단계가 있었다 : 먼저, 통합 Au 마이크로 전극과 마이크로 패턴 PEGDA 하이드로 겔은 제 1 포토 마스크를 사용하여 UV 가교에 의해 얻어졌다(그림 1A, B). 둘째, Au 마이크로전극, 마이크로패턴 CNT-GelMA 및 PEGDA 하이드로겔로 구성된 다층 구성체를 제2 포토마스크(도1C)를사용하여 UV 가교에 의해 제조하였다. 마지막으로, 심근구를 연로봇에 작동시키기 위해 제작된 3층 구조상에 시드하였다(도1D).
소프트 로봇의 다양한 디자인
소프트 로봇의 모양에 관해서는, 처음에는 두 개의 다른 수생 동물의 패턴을 생체 모방하여 두 개의 생체 영감 모양을 디자인했습니다. 첫 번째 디자인은 불가사리가 2차원(2D) 물체로 단순화될 수 있고, 단단한 백본을 가지며, 물 속에서 이동하기 위해 결합되어 필요한 움직임을 최소화하기 때문에 카라이빅 불가사리의 모양에서 영감을받았습니다(그림 2A, B, C). 두 번째 장치는 2D 장치에서 재현하기 쉬운 만타선(도2,E, F)의형상을 기반으로 하였다. 만타 광선은 독특한 움직임을 사용하여 빠르게 수영 할 수 있습니다. 포토마스크 단계에서 상호 연결될 복잡성이 줄어든 기본 기하학적 모양을 사용하여 만타 광선을 스케치했습니다. 구조의 중간선을 따라 배치 된 전극은 물결 모양 패턴으로 설계되어 전기 펄스와 유연성의 더 나은 확산을 허용합니다(그림 2D). 바이오 영감 소프트 로봇을 개발하기 위해, 만타 광선에서 영감을 받은 모양을 선택하고 이 연구에서 철저히 테스트했습니다.
CNT-GelMA와 PEGDA 하이드로겔 사이에 Au 마이크로 전극을 내장하는 과제
제작된 로봇 본체에 200 nm 두께의 Au 마이크로 전극을 캡슐화하면 전기 자극을 제공함으로써 시공을 로컬로 제어할 수 있습니다. CNT-GelMA와 PEGDA 하이드로겔 패턴을 전극 표면에 직접 적으로 연결하는 UV 가교가 전극의 박리를 방해했지만 소프트 로봇에 전극을 성공적으로 통합할 수 있었습니다. 그러나, PEGDA 하이드로겔 상에 Au 전극을 옮김후, 직사각형 형상및 넓은 폭(>1 mm)을 가진 Au 전극은 PEGDA 하이드로겔의 팽윤으로 인해 제조 과정에서 쉽게 파손되었다(도3A, B, C). 따라서, 우리는 마이크로 전극이 성공적으로 PEGDA 하이드로겔로 전송되고 CNT-GelMA와 PEGDA 하이드로겔 사이에 내장되어 있는지 확인해야 했습니다. 따라서, 서펜타인 패턴(두께 = 200 μm)을 가진 Au 마이크로전극은 부드러운 리소그래피로 설계 및 제작되었다. 상이한 배율 및 스테이지를 가진 위상 대조 현미경 사진은 마이크로 패턴 PEGDA 하이드로겔상에서 수송 후 전극상 골절의 징후를 검사하기 위해 촬영하였다(도3D, E, F).
하이드로겔 마이크로패턴 간의 간격 최적화
심근세포 시드 CNT-GelMA 층은 패턴 거리에 따라 상이한 박동 거동을보였다(도 4A, B). 이것은 선의 거리에 따라 막의 표면에 붙어 있는 세포가 다른 쪽에 기인할 수 있습니다. 50 μm 거리의 경우, 셀이 너무 포장되었고 원하는 조직 구성을 갖지 못했다. 날개에 부분적으로 상호 연결되고 정렬되지 않은 세포는 모두 동시에 수영 운동에 기여하지 않았습니다. 따라서 심근세포에 의해 생성된 힘은 날개를 구부리기에 충분하지 않았습니다. 150 μm 거리에서, 세포는 아주 잘 정렬되었다. 그러나, 그(것)들은 주로 홈에 앉았고 약한 박동의 결과로 상부 층에 있는 세포 사이 몇몇 상호 연결이 있었습니다. 75 μm 거리에서, 세포는 하단 부에 정렬하고 상부에 상호 연결, 강한 구타를 보여주는. 또한, 심근세포의 동적 박동 시 소프트 로봇의 돌이킬 수 없는 완전한 압연을 방지하기 위해 PEGDA 하이드로겔 지지층의 패턴 간격을 300 μm(도4C)로최적화하였다. 마지막으로, 이 매개 변수화 과정에 따라, 우리는 300 μm 거리 PEGDA 패턴과 75 μm 거리 CNT-GelMA 패턴을 가진 만타 광선 모양 막에 더 집중하기로 결정했습니다. 미세 패턴 PEGDA- 및 CNT-GelMA 패턴에 심장 조직은 또한 위상/대조 이미지 및 F-액틴/DAPI 공초점 이미지에 의해 나타났다(그림 4B).
마이크로 패턴 PEGDA- 및 CNT-GelMA 하이드로겔에 심장 조직의 움직임의 분석
액추에이터의 움직임을 분석하기 위해, 우리는 탄소 막대 전극을 사용하여 전기장을 적용하는 동안 Au 마이크로 전극없이 멤브레인의 비디오를 찍었습니다. 도 4D는 수축 기록에서 가져온 일부 프레임을 나타낸다. 만타 광선 모양의 액추에이터가 예상대로 날개를 구부리고 있다는 것이 분명하게 드러났다. 꼬리는 조금 곧게 펴서 구조의 균형을 맞추고 있었고 날개는 중간에 강하게 닫히고 있었습니다. 일부 멤브레인은 잘못 정렬된 마이크로패턴 CNT-GelMA 및 PEGDA 하이드로겔로 인해 수축하는 동안 회전하는 움직임을보였다(도 4E 및 비디오 1). 이 경우, 무브먼트는 이전 운동에 비해 덜 정의되었지만 수축은 회전 운동의 작동을 허용할 만큼 충분히 강했습니다. 전체 원을 완료하는 데 는 총 시간은 약 45 s였습니다.
다층 소프트 로봇의 심근세포의 특성화 및 전기 자극에 의한 박동 행동 제어
생체 영감 로봇 시스템에 심근 세포의 파종 및 성숙 후(그림 5A),CNT-GelMA 패턴의 방향을 따라 심장 조직의 정렬이 관찰되었다(그림 5B-E)F-액틴 / DAPI 및 상혈 / connexin-43 / DAPI 면역 염색 모두에 의해 관찰되었다. 공초점 형광 이미지는 CNT-GelMA 하이드로겔 패턴상에서 잘 길고 정렬된 심근세포(도5B, C)를나타냈다. 부분축 사카망 정렬 및 상호 연결된 사르카망 구조는 패턴 부위에서 관찰되었다(도5D). 미세 전극 바로 위에 위치한 심장 조직의 잘 상호 연결된 사르코메르 구조도 관찰되었다(그림5E). 바이오 영감 소프트 로봇을 평가하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 사용하여 그 기능을 감지 : 첫째, 우리는 인공 튜닝 및 구타 동작을 제어하기위한 탄소 막대 전극하지만 소프트 로봇에 이격 전기 펄스를 적용했다. 둘째, 우리는 전체 로봇 구성을 통해 전기 신호를 생성하기 위해 Au 전극의 가장 바깥쪽 끝에 두 개의 구리 와이어를 연결했습니다. Au 전극에 연결된 외부 탄소 전극 또는 구리 와이어를 통해 전기 자극을 적용했을 때, 여기 임계값 전압은 상이한 주파수(0.5, 1.0 및 2.0 Hz, 도 5F)에서상이하였다.
그림 1: 유연한 Au 마이크로 전극의 통합을 통해 전기 신호에 의해 전기적으로 제어되는 생체 영감 다층 소프트 로봇의 제조 과정을 묘사한 회로도 및 실제 이미지. (A)1st 포토마스크를 사용하여 PEGDA 하이드로겔의 패터닝 및 가교. (B)단계(A)후얻어진 TMSPMA 유리 상에 캡슐화된 Au 마이크로 전극을 가진 마이크로 패턴 PEGDA 하이드로겔. (C)2nd 포토마스크를 사용하여 CNT-GelMA 패턴 하이드로겔의 가교. (D)다층 구문에 심근세포의 시딩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 바이오영감 소프트 로봇의 설계. (a)실제 불가사리 사진과 구성 요소와 줄무늬를 가리키는 3 차원 (3D) CAD 모델의 다른 보기. (B)CNT-GelMA 패턴, PEGDA 패턴 및 불가사리 형상의 Au 마이크로 전극용 마스크 디자인. (C)불가사리 형상을 위한 마이크로 패턴 CNT-GelMA 및 PEGDA 패턴의 광학 현미경 이미지. (D)구성 요소를 가리키는 3D CAD 모델의 실제 만타 광선 그림과 다른 보기. (e)CNT-GelMA 패턴, PEGDA 패턴 및 만타선 형상을 위한 Au 마이크로전극용 마스크 디자인, Su Ryon 등의 허가를 받아10. (F)만타선 형상에 대한 마이크로 패턴 CNT-GelMA 및 PEGDA 패턴의 광학 현미경 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유연한 Au 마이크로 전극의 설계. (A)직사각형 모양과 넓은 너비로 제작 된 Au 전극의 사진. (B 및 C)PEGDA 하이드로겔로 전달하지 못한 Au 전극의 광학 현미경 이미지. (D)Wavy Au 마이크로 전극 전후(E 및 F)마이크로 패턴 PEGDA 하이드로겔에 이송되. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마이크로 패턴 PEGDA 및 CNT-GelMA 하이드로겔의 최적화 및 소프트 로봇의 이동 분석. (A)CNT-GelMA 하이드로겔 패턴에 50, 75 및 150 μm 간격으로 심근세포의 광학 이미지. (B)PEGDA- 및 CNT-GelMA 하이드로겔 패턴에 대한 심근세포의 광학 이미지와 F-액틴/DAPI 염색은 각각 300 μm 및 75 μm 간격으로. (C)300 μm 간격의 마이크로 패턴 PEGDA 하이드로겔이 유무에 관계없이 바이오 영감 된 구성물의 롤링 형태. (D)전기 자극을 도면서 녹화된 자립형 바이오영감 소프트 로봇 비디오의 프레임. (E)소프트 로봇의 회전 움직임을 기록하는 비디오에서 가져온 4 개의 서로 다른 프레임의 콜라주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Au 마이크로 전극 통합 소프트 로봇에 심근세포의 특성화 및 전기 자극에 의한 박동 동작의 제어. (A)PEGDA와 CNT-GelMA 하이드로겔 사이에 캡슐화된 Au 마이크로 전극상 배양된 심근세포의 광학 현미경 이미지. (B)F-액틴/DAPI 형광 이미지는 CNT-GelMA 하이드로겔 마이크로패턴상에서 잘 길고 정렬된 심근세포를 나타내는 것이다. (C-E) 공초점 형광이미지는 조작된 소프트 로봇상에서 사르코메르 정렬 및 상호 연결된 사르코메르 구조를 나타낸 이미지:(C 및 D)CNT-GelMA 하이드로겔 마이크로패턴상에서 배양된 심근세포, 및(E)Au 마이크로전극 근처의. (F)카본 로드 전극 및 임베디드 Au 마이크로 전극을 통해 전기 자극을 적용할 때 서로 다른 주파수(0.5, 1.0 및 2.0Hz)에서 필요한 여기 임계값 전압. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법을 사용하여, 우리는 성공적으로 내장 Au 마이크로 전극에 의해 제어되는 다층 구조의 스캐폴드에 통합 자기 작동 심장 조직과 바티드 물고기 와 같은 바이오 영감 소프트 로봇을 제조 할 수 있었다. PEGDA와 CNT-GelMA 하이드로겔로 만들어진 두 개의 뚜렷한 마이크로 패턴 하이드로겔 층으로 인해, 바이오영감 스캐폴드는 좋은 기계적 안정성과 이상적인 세포 정렬 및 성숙을 보였다. PEGDA 패턴 층은 가오리에서 골격 구조의 연골 조인트 역할을하며 로봇 몸 전체에 기계적 지원을 제공합니다. 특히, 그것은 심장 조직 수축 및 이완 동안 기계적 안정성을 유지, 수축 다음 막 장력을 방출 하는 능력으로 인해 효율적인 구타에 대 한 허용 하면서. 더욱이, 마이크로전극(200 nm)의 나노미터두께는 이들의 뱀 패턴뿐만 아니라, 심장 조직의 수축을 방해하거나 영향을 미치지 않을 정도로 유연하게 할 수 있게하였다(도 2). 하이드로겔 표면에 미세 전극을 파손 없이 쉽게 전달하기 위해 Au 마이크로 전극은 일반적으로 유리와 Au 사이의 강한 접착력을 만드는 데 사용되는 티타늄과 같은 접착층없이 유리에 제조되었습니다. 한편, 심근세포 부착 및 정렬을 지지하는 CNT-GelMA 층은 PEGDA 하이드로겔 패턴의 배향에 수직인 패턴으로만들어졌다(그림 3). 성숙 후, 상부 층의 심근세포는 전체 스캐폴드에 대한 자기 작동을 제공했다. 통합 된 Au 유연한 미세 전극의 국소 전기 자극을 통해 심장 조직에 해를 끼치지 않고 로봇의 박동 주파수를 조절 할 수 있었습니다. 이 제조 방법은 배우기 쉽고 재현하기 쉽지만, 제조 공정에서 여전히 몇 가지 기술적으로 어려운 단계가 강조되어야 합니다.
연약한 바이오 로봇의 제조를 위한 5개의 중요한 단계가 있습니다: 1) GelMA 하이드로겔내의 CNT의 정확한 분산; 2) TMSPMA 코팅 유리에 PEGDA 및 CNT-GelMA 하이드로겔의 성공적인 UV 가교; 3) 지지 유리로부터 하이드로겔 패턴으로 Au 마이크로 전극의 전달; 4) 지지 유리 슬라이드에서 액추에이터의 올바른 분리; 5) Au 마이크로 전극과 파형 발생기 연결에 사용되는 전선 사이의 양호한 전기 적 접촉의 생성.
깨끗한 GelMA 기질과 비교하여, CNTs의 혼입은 더 높은 자발적동기 박동 속도 및 심근 조직의 더 낮은 여기 임계값에 기여하는 향상된 기계적 특성 및 향상된 전기 생리학적 기능을 가진 GelMA 하이드로겔을 제공합니다9. CNT 세포 독성의 문제는 표면 기능화 CNT를 사용함으로써뿐만 아니라 5.0 mg / mL9의농도까지 GelMA 하이드로 겔 매트릭스에 나노 구조를 통합하여 방지됩니다. 실제로, 겔마 하이드로겔의 소수성 세그먼트와 CNTs 측벽 사이의 상호작용은 하이드로겔 다공성매트릭스(14)에서CNT의 캡슐화로 이어진다. 이것은 잠재적으로 독성 응집체를 형성하는 것을 방지할 뿐만 아니라 식염수 용액(예: DPBS 또는 세포 배양 배지)에서 CNTs 용해도를 향상시킵니다.
PEGDA와 CNT-GelMA 하이드로겔 사이에 Au 마이크로 전극을 성공적으로 통합하려면 각 단일 층의 UV 가교에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 구체적으로, PEGDA 하이드로겔 층 상에 Au 마이크로 전극을 전달하기 위해, 하이드로겔 용액이 박리 단계 동안 전극의 파열을 피하기 위해 전체 전극 영역을 커버하도록 보장할 필요가 있다. 따라서, TMSPMA 유리 코팅의 품질은 PEGDA 하이드로겔을 유리 기판에 최적으로 부착하여 미세 전극의 전달 단계에서 의 분리를 방지하는 데 매우 중요합니다.
이 방법의 또 다른 중요한 단계는 지지 유리 슬라이드로부터 바이오액추이터의 분리이다. 이 문제는 심장 조직의 자발적인 박동이 유리 슬라이드에서 지지 하이드로겔을 자연스럽게 벗길 정도로 동기적이고 충분히 강할 때 쉽게 해결할 수 있다. 이러한 이유로, 이전에 보고된 바와 같이, 기능적 및 동기성 심장 조직의 조직에 유리한 특정 세포 정렬을 유도하기 위해 하이드로겔 패턴을 최적화하는 것이 근본적이다.
마이크로 전극을 파형 발생기에 전기적으로 연결하려면 마이크로 전극에 전기 연결이 생성되어야 합니다. 이 단계에서는 세포 독성 효과를 피하기 위해 미세 전극을 구리 와이어에 접촉하는 데 사용되는 은 접착제를 완전히 캡슐화하는 것이 중요합니다. 이것은 성공적으로 전기 접촉의 상단에 PDMS의 얇은 방울을 증착하여 달성된다.
이 방법은 복잡한 제조 공정, 긴 제조 시간 및 광유전학 도구의 잠재적 독성과 같은 기존 광유전학 기술의 한계를 극복 할뿐만 아니라 세포 기반의 성능을 강력하게 향상시킬 수 있습니다. 저비용 및 취급하기 쉬운 기술을 사용하여 실시간 자극을 이끌어내는 액추에이터. 현재 바이오 영감 액추에이터의 설계는 전방 추진을 생성할 수 없었지만, 자율 세포 기반 로봇 분야에서의 성공은 많은 관심을 끌 수 있습니다. 이 방법은 또한 잠재적으로 전체 로봇 바디를 위한 무선 으로 구동되는 이식형 패치의 개발에 기여할 수 있습니다. 이 방법은 하이드로겔 기반 스캐폴드에 직접 유연한 RF 회로를 통합하지만 소프트 바이오 로봇의 향후 무선 전기 자극을 위한 길을 열어줍니다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 논문은 국립 보건원 (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), 브리검 연구소 스테핑 강력한 혁신상 및 AHA 혁신 프로젝트 상 (19IPLOI34660079)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
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